Organotipik Dilim Kültürleri Purkinje Hücre Dendritik Morfoloji Analizi

Bu prosedürün genel amacı, çeşitli deneysel koşullar altında burkini hücresi dendritik ağacının gelişimini analiz etmektir. Bu, öncelikle postnatal fare serebellumunun organotipik kesit kültürlerinin kurulmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, kesit kültürleri çeşitli deneysel koşullar altında kültüre edilir.

Örneğin, MGL R one agonistlerinin etkisini test edin, ardından kültürleri sabitleyin ve anti Calbindin immün boyama ile bireysel Purkinje hücrelerinin morfolojisini ve dendritik ağaçlarını ortaya çıkarın. Son adım, kontrol veya deneysel koşullar altında büyütülen Purkinje hücrelerinin dendritik ağaçlarını analiz etmektir; bu analiz, immün boyalı Purkinje hücrelerinin floresan mikroskobisi ile gerçekleştirilir ve dendritik ağaçlarının boyutunun ve dallanmasının kantitatif değerlendirmesi, nörotransmitter reseptörünün, özellikle de MGL R one aktivasyonunun, Purkinje hücresi dendritik ağaç gelişimini derinlemesine etkilediğini göstermektedir.

Bu tekniğin temel avantajı, kültür süresi boyunca Purkinje hücre uçlarının neredeyse tamamının uzamasının gerçekleşmesidir; böylece, dendritik ağaç gelişimi gibi oldukça karmaşık bir konu in vitro ortamda incelenebilir. Bu yöntem, aktivitenin nöronal uzantıların büyüme ve gelişimi üzerini nasıl etkilediği gibi, gelişimsel nörobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedüre başlamak için, bir stereo mikroskop altında, buz soğukluğundaki preparasyon ortamında bir PA fare yavrusunun beyninden serebellumu diseke edin.

Ardından, serebellumu McIlwain doku kıyıcısı kullanarak sagital oryantasyonda 350 mikron kalınlığında dilimler halinde kesin. Dilimleri ayırdıktan sonra, her bir insert başına yaklaşık altı dilim olacak şekilde millipore hücre kültürü insertlerine yerleştirin. Daha sonra, dilimleri her kuyuya 0.75 mililitre inkübasyon medyumu önceden doldurulmuş altı kuyucuklu plakalar içerisinde, %5 karbon dioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 derecede inkübe edin.

İstenen konsantrasyondaki PMA veya DHPG'yi kültür ortamına ekleyerek, in vitro üçüncü günde farmakolojik tedavilere başlayın. İlaçları, her ikinci veya üçüncü günde kültür ortamını değiştirirken yenileyin. Kültürün fiksasyonu için.

Öncelikle kültür ortamını uzaklaştırın, ardından Millicel insert membranına yapışık serebellar kesitlerin bulunduğu her bir kuyucuğa dikkatlice üç mililitre paraformaldehit ekleyin. Gece boyu süren kültür fiksasyonunun ardından fiksatörü uzaklaştırın. Sonrasında kültürleri fosfat tamponu ile durulayın.

Ardından, bloklama çözeltisi içinde seyreltilmiş tavşan anti-inek bağlayıcısını kültüre ekleyin. Perikinji hücrelerini seçici olarak görselleştirmek için tavşan anti-kalbindini 1:1000 oranında, granül hücrelerini seçici olarak görselleştirmek için ise bloklama çözeltisi içindeki monoklonal anti-neuN'i 1:500 oranında seyreltin.

Kültürleri, hafif ajitasyon altında dört derece Celsius'ta gece boyu inkübe edin. Ertesi gün, kültürleri üç kez 0,1 molar fosfat tamponu ile yıkayın, sekonder antikorları (Goat anti rabbit, Alexa 5 68 ve goat anti mouse Alexa 4 88) 0,1 molar fosfat tamponu ve %0,1 Triton X 100 içerisinde 1:500 oranında dilüe edin.

Kültürleri bu işlemle oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. Kültürleri fosfat tamponu ile üç kez duruladıktan sonra, boyanmış kesitleri bir resim fırçası yardımıyla kültür kuyucuğundan çıkarın ve super frosts plus lamların üzerine yerleştirin. Uygun bir montaj medyumu ile lamelleri kapatın.

Ardından, kültürleri epi-floresan donanımlı standart bir mikroskopla veya bikiny hücrelerinin floresan işaretlemesini görebileceğiniz bir konfokal mikroskopla inceleyin. Bir hücrenin dendritik ağacı diğer hücrelerle örtüşmüyorsa, bu ağacın boyutu kolayca ölçülebilir. Dendritik ağacı örtüşmeyen bir bikiny hücresi belirlendiğinde, hücre 20 x objektif ile incelenir.

Dijital bir kamera ile görüntü kaydedilir ve ardından bir görüntü analiz programı ile analiz edilir. Laboratuvarımızda Image Pro plus kullanılmaktadır. Bu program, tek bir fare tıklamasıyla hücrenin dendritik ağacının ana hatlarının belirlenmesine olanak tanır.

Ölçüm modundaki sihirli değnek aracı kullanılarak, program önce dendritik ağaç tarafından kaplanan alanı hesaplar ve bunu Ms.Xl'e aktarır. Ardından, dal noktalarının sayısı için verilerin istatistiksel analizi GraphPad Prism yazılımı ile yapılır. Kinji hücre ENDR ağacının oldukça dallı ve ince morfolojisi nedeniyle, bunların manuel olarak sayılması gerekir. Kinji hücrelerinin 20x görüntü dosyası, Adobe Photoshop kullanılarak ekranın büyük bir kısmını kaplayacak şekilde yakınlaştırılır.

Ardından her dallanma noktası sayılır ve kırmızı bir nokta ile işaretlenir. Dendritik ağacın büyümesini izlemek için tanımlanan bikini hücreleri tekrar tekrar fotoğraflanmıştır. İkinci bölünmeden yedinci bölünmeye kadar, dendritlerin dallanmasında sürekli bir büyüme gerçekleşmiştir.

4. günde 11. güne kadar, dendritik ağ önemli ölçüde genişlemişti. Burada, pKC veya mglR1 tarafından bikini hücresi dendritik ağ gelişiminin inhibisyonuna dair örnekler verilmiştir; A ve D stimulasyonlarında, iyi gelişmiş bir dendritik ağa sahip tedavi edilmemiş kontrol hücreleri gösterilmektedir. Dokuz günlük PMA tedavisinden sonra, BNE'de gösterildiği üzere, dendritler kalınlaşmış görünmekte ve dendritik ağın boyutu güçlü bir şekilde azalmaktadır.

Öte yandan, CNF'ler, dokuz günlük DHPG uygulamasından sonra dendritik ağacın boyutunun büyük ölçüde azaldığını göstermektedir. PMA uygulamasının aksine, primer ve sekonder dendritler üzerinde çok sayıda çok ince ve kısa yan dallar mevcuttu.

Buradaki nicel ölçümler, hem üstteki sütun grafiğinde dendritik ağaç boyutunun hem de alttaki sütun grafiğinde dallanma noktası sayısının PMA veya DHPG uygulaması sonrası önemli ölçüde azaldığını göstermektedir; kontrol grubundaki dendritik ağaçlar ile işlem görmüş kültürlerden alınan Purkinje hücrelerinin dendritik ağaçları arasındaki farklar anlamlıdır. Bu prosedürü takiben, dendritik ağaç morfolojisindeki değişikliğin fonksiyonel etkileri gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla elektrofizyoloji gibi ek yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, organotipik serebellar dilim kültürlerinin nasıl hazırlanacağı ile Purkinje hücrelerinin ve morfolojisinin nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.