Name: Organotipik Dilim Kültürleri Purkinje Hücre Dendritik Morfoloji Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Öğrenin, organotipik dilim kültürlerinde Purkinje hücrelerinin dendritik morfolojisini nicel olarak değerlendirmek için bu protokolü kullanın. MGLR1 aktivasyonunun dendritik ağaç gelişimi üzerindeki etkilerini inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Basel Üniversitesi, Biomedikal Bölümü, ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (31003A-116624) tarafından desteklenmiştir.

1. Organotipik Serebellar Dilim Kültürleri kurma Serebellar kesit kültürlerinde doğum sonrası elde edilen statik inkübasyon yöntem kullanılarak 8 10 P (8) fare yavrular hazırlanır. Laboratuvarımızda, biz B6CF1 fare kullanın. Bazı deneylerde, aynı zamanda transjenik fareler Purkinje hücreleri seçici olarak EGFP ifade eden kullanılmıştır. Dilim kültürlerin hazırlanması 6 farenin yavru bir çöp için fare yavru, yani 3 saat başına yaklaşık 30 dakika sürer. Tüm adımları steril cerrahi aletler ile laminar akış tezgahı steril koşullar altında yürütülmektedir. <ol><li> P8 fare yavruların serebellum stereomikroskopta kullanarak buz hazırlama orta (MEM (Gibco Katalog No 11012) glutamax 1:100, pH 7.3) içinde beyin disseke edilir. </li><li> Serebellum McIlwain doku kıyıcı kullanarak sagital yönde 350 mikron kalınlığında dilimler halinde kesilir. </li><li> Dilimleri Millipore hücre kültürü ekler (approx.6 dilim yerleştirilirinsert, Millipore PICM03050) başına s ve 0.75 ml başına iyi inkübasyon ortamı (MEM 48.35 ml, 25 ml Eagle Medium, 25 ml at serumu, 1 ml glutamax I, bir steril% 10 glikoz, 0,65 ml ile 6 oyuklu plakalar içerisinde inkübe edilir 37.% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosfer içinde solüsyon, pH 7.3) ° C. Bütün doku kültür reaktifler Gibco, Invitrogen edildi. </li><li> Farmakolojik tedaviler genellikle kültür ortamı için istenen konsantrasyonda ilaç ekleyerek in vitro (DIV3) içinde 3 gün sonra başlamıştır. Forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) ve (RS) -3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG) Tocris, UK edildi. Birçok ilaç, bir stok çözelti (örneğin, PMA) hazırlamakla DMSO ya da etanol kullanımını gerektirdiğinden çözücünün toplam miktarı (çukur başına 7.5 ul)% 1 aşmayacak kültür ortamına eklenen dikkat edilmelidir. Ilaç kültür ortamı her 2. veya 3. günün değişikliği ile birlikte yenilenir. </li></ol> 2. Fiksasyon ve ImmunosOrganotipik Serebellar Dilim Kültürleri temi Beyincik önemli bir avantajı antikorlar spesifik ve parlak anapara serebellar nöronların, yani Purkinje hücreleri ve granül hücreleri leke olduğunu kullanılabilir olmasıdır. Purkinje hücre dendritik morfoloji anti-kalbindin D28K ile immünboyama ortaya çıkabilmektedir. <ol><li> Kültürlerin tespit için, kültür ortamı çıkarılır ve 0.1 M fosfat tampon (pH 7.4) içinde soğuk bir% 4 paraformaldehit ve 3 ml iyi zar bağlı serebellar dilimleri ile Millicell sokmasını içeren göre dikkatli bir şekilde ilave edilmiştir. Kültürler, daha sonra gece boyunca sabit sabitleştirici kaldırılır ve kültürler fosfat tamponu ile yıkanır. </li><li> Immünboyama için aşağıdaki antikorlar kullanılır: tavşan anti-kalbindin D-28K (Swant, Bellinzona, İsviçre) 1:1000 az seçici seçici granu görselleştirmeye yönelik 1:500 de Purkinje hücreleri ve monoklonal anti-Neun (Chemicon, Millipore) görselleştirmek içinle hücreleri 12. Tavşan anti-GFP Abcam, UK yapıldı. Floresan ikincil Alexa antikorlar Molecular Probes, Invitrogen vardı. </li><li> Kültürler 0.1 M fosfat tampon solüsyonu (engelleme) içinde% 3 normal keçi serumu +% 0.3 TritonX100 ekleyerek permeabilize ile bloke edilir. Anti-kalbindin D28K ve anti-bloke etme Neun çözelti içinde seyreltilir ve kültürler hafif karıştırma altında bir gece boyunca 4 ° C&#39;de antikorlarla içeren engelleme çözeltisi ile inkübe edilir. Tüm seyreltmeler% (v / v) olarak gösterilmiştir, Triton X100, pipetle kolaylaştırmak için sırayla bir% 10 stok çözelti alınır. </li><li> Kültürler 0.1 M fosfat tamponu ile 3x durulanır ve daha sonra uygun bir ikinci antikor, örneğin, keçi anti-tavşan Alexa 568 ve keçi anti-fare Alexa 488 ile inkübe edilir +% 0.1 TritonX100 az 2 saat süreyle 0.1 M fosfat tamponu içinde 1:500 seyreltilmiş oda sıcaklığı. Kültürler daha sonra 0.1M fosfat tamponu ile 3x durulanır. </li><li> Lekeli dilimler kültür kaldırılıriyi bir fırça ile ve Superfrost artı cam slaytlar üzerine monte edilir ve uygun bir montaj aracı, örneğin Mowiol ile kaplandı. Kültürler artık Epifloresans ekipman ile düzenli bir mikroskop veya bir konfokal mikroskop ile görülebilir. </li></ol> 3. Organotipik Dilim Kültürleri Bireysel Purkinje Hücrelerinin görüntüleniyor <ol><li> Calbindin D28k ile immünboyama sonra, Purkinje hücreleri tam sitoplazması parlak dendrit ve akson içeren lekeli. Purkinje hücre tabakası Purkinje hücreleri içinde oluşan yoğun bir hizalama nedeniyle, en Purkinje hücreleri ve dendritik milleri zor bir tek hücrenin tam bir dingil çalışma yapma örtüşen edilir. Bununla birlikte, hazırlama işlemi sırasında bazı Purkinje hücreleri arasında hücre ölümü nedeniyle pek çok kültür, bazı alanlarda Purkinje hücreleri daha düşük bir yoğunluğa sahip bulunmaktadır. Bu tür alanlarda, diğer c ile örtüşmeyen bir tam dendritik çardak ile Purkinje hücreleri bulmak mümkündürarşın. Bu hücrelerde, dendritik çardak görülebilir ve Golgi boyama karşılaştırılabilecek kalitede analiz. Beyincik Purkinje hücreleri Calbindin D28K eksprese eden tek hücre tipi olduğundan hücreler de Purkinje hücreleri olarak tanımlanır. </li><li> Alternatif bir yöntem B6 türetilen kültürleri kullanmaktır; FVB-Tg (Pcp2-EGFP) 146.244Yuza / J farelerde (burada Pcp2-EGFP fareler denilen Jackson, laboratuarlar edinilebilir) Purkinje hücre belirli L7 organizatörü 11 altında EGFP ifade eden. Böyle dilim kültürlerde yaşayan Purkinje hücreleri EGFP ifadesi ile görülebilmesi. Bu zaman içinde bir tek hücre dendritik morfoloji takip etmek de mümkündür. Alternatif olarak, tespit sonrası, EGFP-Purkinje hücreleri ifade eden bir anti-GFP antikor ile immünhistokimyasal edilebilir. Her iki yöntem de boyama dendrit, hücre gövdeleri ve organotipik kültürlerinin Purkinje hücre aksonları için uygundur. Pcp2-EGFP farelerde L7 promotörü her Purkinje hücre içinde ifade edilir ve v olduğu olmadığındanfareler (Kapfhammer, veriler gösterilmemiştir) arasında Purkinje hücreleri ifade sıklığında ariations Bu farelerden elde edilen kültürlerin daha kolay diğer Purkinje hücre dendritik ağaçlar ile örtüşen dendritik ağaçlar var Purkinje hücreleri görselleştirmek ve ölçmek için yapmak dilimleyin. Dendritik ağaçlar örtüşen komşu Purkinje hücreleri ifade GFP (Şekil 1A, B) değil, ne zaman böyle dendritik ağaçlar ayrı ayrı izlenebilir. </li></ol> 4. Purkinje Hücre Dendritik Ağaç büyüklüğü ve Şube Nokta Ölçümü <ol><li> Dendritik ağaç büyüklüğü. Ağaç diğer hücreler ile çakışan değilse, Purkinje hücreleri floresan etiketleme ile, belirli bir hücre dendritik ağacının kolaylıkla ölçülebilir. Calbindin immun etiketleri tüm Purkinje hücreleri için, dendritik ağaçlar örtüşmeyen ile hücreleri tespit etmek zor olabilir. Bu durumda, Pcp2-EGFP kullanılması yeterli Purkinje hücre kimlik kolaylaştırmak için tavsiye edilirörtüşmeyen dendritik ağaçlar s. Bir örtüşmeyen dendritik ağaç ile bir Purkinje hücre tespit edildikten sonra, bu 20x lens ile görülür ve bir resim, bir dijital kamera ile kaydedilmiştir. Bu görüntü daha sonra bir görüntü analiz programı ile analiz edilebilir. Biz modu (Şekil 2A) ölçümünde sihirli değnek aracını kullanarak tek bir fare tıklaması ile hücre dendritik ağaç anahat sağlar Image Pro artı kullanın. Program daha sonra dendritik ağacın kapsadığı ve MS Excel aktarır alanı hesaplar. Verilerin istatistiksel analizi GraphPad Prism yazılımı (bkz. aşağıda) ile yapılır. </li><li> Şube noktalarının sayısı. Purkinje dendritik hücre ağaç dalı noktası yüksek dallı ve ince morfolojisi sayesinde el ile sayılır gerekir. Purkinje hücreleri 20x görüntü dosyası, Photoshop kullanarak ekran en kapsar ki bu gibi büyütülür. Sonra her dal noktası sayılır ve parlak bir nokta (Şekil 2B) ile işaretlenmiştir. </li></ol> Kültür periyodu boyunca Purkinje dendritik hücre ağaç gelişimini izlemek Purkinje hücreleri özellikle EGFP ifade Pcp2-EGFP fareler elde Organotipik kesit kültürlerinde kültür içinde birkaç gün esnasında, tek tek hücrelerin morfolojisi çalışma sağlar. Bu şekilde, kültür periyodu boyunca dendritik ağacının büyüme ve gelişme çok iyi belgelenmiş edilebilir. Yaşam tespit Purkinje hücreleri 10x objektif ile kültür periyodu boyunca her 2. veya 3. günü fotoğraflandı. Bu düşük güç hedefi flüoresan ışık ile aydınlatma nedeniyle hücrelere fototoksik hasarı önlemek ve en aza indirmek için seçildi. Şekil 3 yaşayan kültürlerin fotoğraflandı Purkinje hücre iki örnek gösterilmektedir. Ilk olarak hücre in vitro (Şekil 3, AC) içinde 7 gün kadar in vitro olarak 2 gün izlenmiştir. Açıktır ki dendritiBu süre içinde bu hücrenin c ağacı birçok yeni şube büyür ve boyutu genişletir. İkinci örnekte, bir in vitro hücre Purkinje (Şekil 3, DF) içinde 4-11 gün izlenmiştir. DIV4 mevcut küçük dendritik ağaç bu dönemde önemli ölçüde genişletir. Her iki örnek de Purkinje hücreleri ve dendritik ağacın en gerçekten kültür içinde gelişti kültür periyodu sonunda mevcut olduğunu göstermektedir. Purkinje hücre dendritik ağacın Kalkınma PKC veya mGluR1 stimülasyon tarafından inhibe edilir Organotipik serebellar dilim kültürleri 11 gün boyunca kültüre edildi. Kültürlerin bazı kültürlerde tespit edilene kadar PMA (50 nM), PKC veya DHPG (10 uM), bir agonist mGluR1 uyarıcı bir forbol ester, ya ile muamele edildi, in vitro olarak, 2. günde başlayarak. Her iki bileşik Purkinje dendritik hücre büyümesi 7, 8, 9, 5 inhibe eden ve sınırlamak için daha önceden gösterilmiştir.Tedavi edilmeyen kontrol olarak kesitler Purkinje hücreleri, anti-GFP (Şekil 4D) ile immün göre, anti-Calbindin immün (Şekil 4A) veya EGFP eksprese Purkinje hücreleri ile kültürlerinde ya da görünür hale getirildi Tipik bir büyük ve çok dallı dendritik ağaç geliştirilmiştir. PMA ile tedavi kültürlerde dendritik ağacın morfolojisi derinden değişmiş oldu. Dendritler kalınlaşmış çıktı ve sadece birkaç kısa yan dalları vardı. Pek çok Purkinje hücreleri, kontrol kültürleri içinde farklı olarak, bir birincil dendrit hücresi vücut kaynaklanan ile, artık tek kutuplu, fakat iki veya daha fazla primer dendritler (Şekil 4B, E) geliştirmiştir. Dendritik ağacın kapsadığı topraklar belirgin (bkz. aşağıda) düşürülmüştür. Benzer bir durum DHPG işlenmiş kültürler mevcut idi. Purkinje hücreleri ve dendritik ağaç boyut olarak önemli ölçüde azaltılmıştır ve dallanma belirgin bir şekilde (Şekil 4C, F) azalmıştır. Bununla birlikte, bazı Qualität da vardıive farklar PMA ile tedavi edilen kültürler ile karşılaştırıldığında. Orada dendritik dalların hiçbir kalınlaşma oldu ve birincil dendrit sinyalizasyon olaylar benzer fakat aynı olmayabilir PMA ve DHPG işlenmiş purkinje hücrelerinde devam düşündürmektedir (Şekil 4C, F) pek çok kısa ikincil dendrit taşıdı. Yukarıda tarif edildiği gibi Purkinje dendritik hücre ağaç boyut ve kantitatif değerlendirme için dal noktası Kantitatif değerlendirme, Purkinje dendritik hücre ağaç ve Purkinje hücre başına dallanma noktaları sayısı boyut ölçülür. En az üç bağımsız deneyin sonuçları bir araya toplanmış ve 20 hücreleri en az bir analiz edilmesi gerekmektedir. Kontrol deneyleri için dendritik ağaçlarıyla kaplı alanın ortalaması belirlenir ve% 100 olarak ayarlayın ve diğer deneyler için değerler buna göre yüzde değerler olarak ifade edilir edilir. Verilerin istatistiksel analizi GraphPad Prism yazılımı ile yapılır. Biz değil Çünkübelirlenen tüm değerleri bir Gauss dağılımı parçası olduğunu varsayıyorum, biz ölçülen değerlerin böyle bir dağıtım düşünmeyin istatistiksel testler kullanabilirsiniz. İstatistiksel anlamlılık için birden fazla koşul ve test karşılaştırarak, biz GraphPad Prism in Dunn son test uygulanan örneğin, gibi rütbe-tabanlı istatistikleri için post hoc testleri için uygun bir prosedür takip Kruskal-Wallis testi, kullanın. Sonuçlar genellikle çubuk grafikler halinde sunulmuştur. Böyle bir İstatistiksel değerlendirme için bir örnek Şekil 5 &#39;de verilmiştir. Dendritik ağaç büyüklüğü analizi (Şekil 5A) ve Purkinje hücre başına şube noktaları (Şekil 5B) sayısını iki kontrol koşulu ve DHPG veya PMA tedavisi arasında belirgin farklılıklar göstermektedir. Her iki parametre de Kruskal-Wallis testine göre p &lt;0.001 istatistiksel açıdan anlamlı farklıydı. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig1.jpg" /> Figu1 yeniden. Purkinje hücre EGFP-etiketli. Pcp2-EGFP farelerde tüm purkinje hücrelerinde ekspres EGFP. Bu nedenle, bazı Purkinje hücre dendritik ağaçlar (pozitif, A gösterildiği EGFP kanalda negatif gösterilen anti-Calbindin boyama onlar ekspres EGFP (A EGFP kanalı) ve dendritik ağaçlar örtüşen komşu Purkinje hücreleri yok olduğunda ayrı ayrı izlenebilir B kırmızı kanal içinde). Ölçek bar = 50 mikron. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/3637/3637fig2.jpg" /> Şekil 2. Purkinje hücreleri ve dendritik parametrelerin ölçümü. (A). Dendritik ağacın boyutu kolayca Görüntü analiz yazılımı Image Pro tek bir fare tıklaması ile Purkinje hücre anahat izleme artı sihirli değnek aracını kullanarak ölçülebilir. Sihirli değnek aracı hücre soma ve dendritik dalları dahil tüm dendritik ağaç tamamen hattı ile çevrili olduğu gibi kullanılır. (B). Dal noktası sayısı olduğu couPurkinje hücre görüntüleri elle nted. Her şube noktası sarı bir nokta ile işaretlenir. Ölçek bar = 50 mikron. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig3.jpg" /> Şekil 3. Purkinje hücre dendritik ağacın gelişimini izleme. Tespit Purkinje hücre dendritik ağacın büyümesini izlemek için art arda fotoğraflandı. (AC): Bir Purkinje hücre dendritik ağaç DIV7 kadar in vitro (DIV) 2 gün büyüyen ve gelişen. Bu kültürün dönemde dendritler sürekli büyüme ve dallanma vardır. (DF): Bir Purkinje hücre dendritik ağaç DIV11 kadar DIV4 büyüyen ve gelişen. Dendritik ağaç bu kültürün dönemde önemli ölçüde genişletir. Ölçek bar = 50 mikron. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/3637/3637fig4.jpg" /> Şekil 4. Purkinje hücre dendritik ağacın Kalkınma PKC veya mGluR1 stimulati tarafından inhibe edilir(A), (D):. gelişmiş bir dendritik ağaç Tedavisiz kontrol hücreleri. (B), (E): PMA tedavi dendrit 9 gün sonra ortaya çıkar ve kalınlaştırılmış dendritik ağaç kuvvetle boyutlu olarak azalır. Hücreler genellikle polarizasyon kaybeder ve bipolar (E) olur. (C), (F): DHPG tedavi 9 gün sonra, dendritik ağaç büyük ölçüde boyut olarak azalır. PMA tedavisinde aksine, pek çok ince ve kısa yan dallar birincil ve ikincil dendrit bulunurlar. Hücreler genellikle polarizasyon kaybeder ve bipolar (F) olur. (- F D) Pcp2-EGFP fareler elde edilen kültürlerde - (C A) ve EGFP-İfade ile Purkinje hücreleri, anti-Calbindin immün ile görüntülenmiştir. Ölçek bar = 50 mikron. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3637/3637fig5.jpg" /> Şekil 5,. Purkinje hücre dendritik ağaç büyüklüğü ve dallanma. Nicel ölçümler kantitatif değerlendirilmesi gösteriyor ki dendritik ağaç büyüklüğü (üst çubuk grafik) ve numbe hemdallanma noktaları (alt çubuk grafik) r büyük ölçüde PMA veya DHPG tedaviden sonra azalır. Kontrolü dendritik ağaçlar ve tedavi kültürlerden Purkinje hücre dendritik ağaçlar arasındaki farklar p ile önemli &lt;0.001 idi.

<ol><li>Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+TrkB+for+synapse+elimination+in+developing+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells.</a> Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).</li>
<li>Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoid-related+orphan+receptor+alpha+controls+the+early+steps+of+Purkinje+cell+dendritic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retinoid-related orphan receptor alpha controls the early steps of Purkinje cell dendritic differentiation.</a> J. Neurosci. 26, 1531-1538 (2006).</li>
<li>Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+control+of+dendritic+growth+and+development+of+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular control of dendritic growth and development of cerebellar Purkinje cells.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 39, 131-182 (2004).</li>
<li>Kapfhammer, L. C. Cerebellar slice cultures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKapfhammer%2C+LC+%22Protocols+for+Neural+cell+culture%22">Protocols for Neural cell culture</a>. Doering, J. P. , 4th edition, Springer Protocols Handbooks. 285-298 (2010).</li>
<li>Gugger, O. S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+size+of+the+dendritic+tree+does+not+protect+Purkinje+cells+from+excitotoxic+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Reduced size of the dendritic tree does not protect Purkinje cells from excitotoxic death.</a> J. Neurosci. Res. 88, 774-783 (2010).</li>
<li>Li, J., Gu, X., Ma, Y., Calicchio, M. L., Kong, D., Teng, Y. D., Yu, L., Crain, A. M., Vartanian, T. K., Pasqualini, R., Arap, W., Libermann, T. A., Snyder, E. Y., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mediates+Purkinje+cell+dendritic+development+via+lysyl+oxidase+propeptide+and+NF-%CE%BAB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">mediates Purkinje cell dendritic development via lysyl oxidase propeptide and NF-κB signaling.</a> Neuron. 68, 45-60 (2010).</li>
<li>Metzger, F., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+activity+modulates+dendritic+differentiation+of+rat+Purkinje+cells+in+cerebellar+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C activity modulates dendritic differentiation of rat Purkinje cells in cerebellar slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 12, 1993-2005 (2000).</li>
<li>Schrenk, K., Kapfhammer, J. P., Metzger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+dendritic+development+of+cerebellar+Purkinje+cells+in+slice+cultures+from+protein+kinase+C%3F-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Altered dendritic development of cerebellar Purkinje cells in slice cultures from protein kinase C?-deficient mice.</a> Neuroscience. 110, 675-689 (2002).</li>
<li>Sirzen-Zelenskaya, A., Zeyse, J., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+class+I+metabotropic+glutamate+receptors+limits+dendritic+growth+of+Purkinje+cells+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activation of class I metabotropic glutamate receptors limits dendritic growth of Purkinje cells in organotypic slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 24, 2978-2986 (2006).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Purkinje+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting+from+transgenic+mice+that+express+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein.</a> Eur. J. Neurosci. 14, 57-63 (2001).</li>
<li>Weyer, A., Schilling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+cell+type-specific+expression+of+the+neuronal+marker+NeuN+in+the+murine+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Developmental and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuN in the murine cerebellum.</a> J. Neurosci. Res. 73, 400-409 (2003).</li>
</ol>

Hayvan deneyleri 24 Kasım 1986 (86/609/EEC) ve Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi uyarınca yapılmış ve incelenmiş ve İsviçre makamları tarafından izin verildi. Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var.

Yöntemler organotipik serebellar dilim kültürlerde Purkinje hücre dendritik gelişimini incelemeye yarayan ve nicelik dendritik ağaç büyüklüğü ve dendritik dallanma noktaları sayısını ölçerek Purkinje hücre dendritik genişleme değerlendirmek izin Burada sunulan. Tabii ki, Purkinje hücre dendritler daha kapsamlı ve sofistike bir kantitatif analiz, toplam dendritik uzunluğunu belirlerken bir Sholl analizlere ya da dendritik ağacın fraktal boyut belirleyerek, örneğin mümkündür. Bu tür bir analiz için genellikle elle Örneğin...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Doku kültürü Uçlar </td><td> Millipore </td><td> PICM 03050 PICM ORG50 </td><td> PICMORG50 ekler düşük bir ağız var ve bir mikroskop canlı kültürleri inceleyen izin </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 11012044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax 1 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 35050038 </td><td></td></tr><tr><td> Bazal Medum Kartal </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 41010026 </td><td></td></tr><tr><td> At serumu </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 26050070 </td><td></td></tr><tr><td> Forbol 12-myristate 13-asetat (PMA) </td><td> Tocris </td><td> 1201 </td><td></td></tr><tr><td> (RS) -3,5-Dihidroksi-fenilglisin (DHPG) </td><td> Tocris </td><td> 0342 </td><td></td></tr><tr><td> Tavşan anti-kalbindin D-28K </td><td> Swant </td><td> CB38 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Neun, klon A60 </td><td> Chemicon, Millipore </td><td> MAB377 </td><td></td></tr><tr><td> Tavşan anti-GFP </td><td> Abcam </td><td> Ab290 </td><td></td></tr></tbody></table>

organotipik dilim kültürleri purkinje hücre dendritik morfoloji analizi

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Onlar sagital düzlemde kesinlikle odaklı ve küçük kemirgenler 3 Postnatal dönemde çoğunlukla geliştiren etkileyici bir dendritik ağaç var çünkü Purkinje hücreleri, dendritik gelişim eğitimi için cazip bir model sistem vardır. Dahası, çeşitli antikorların anti-Calbindin D28K ile tüm işlemleri dahil olmak üzere, seçici olarak ve yoğun bir etiket Purkinje hücreleri, en yaygın olarak kullanılan hangi kullanılabilir. Canlı hücrelerde dendritlerin görüntülemek için, Purkinje hücreleri 11 seçici EGFP ifade farelerde Jackson laboratuarlar aracılığıyla mevcuttur. Purkinje hücre dendritik ağacın dendritik genişleme çoğu aslında kültür periyodu 4 sırasında yer alıyor, çünkü Organotipik serebellar dilim kültürlerin hücreleri Purkinje hücre dendritik gelişim kolay deneysel manipülasyon sağlar. Biz burada organotypi yetiştirilen Purkinje hücre dendritik morfoloji görüntüleme ve analiz için kısa, güvenilir ve kolay protokolü sunarızc serebellar dilim kültürleri. Birçok amaç için, Purkinje dendritik hücre ağaç hakkında nicel bir değerlendirme arzu edilir. Biz hızla ve kolayca anti-kalbindin lekeli serebellar dilim kültürleri tespit edilebilir iki parametre, dendritik ağaç büyüklüğü ve şube nokta numaraları, burada odak. Bu iki parametre Purkinje hücre dendritik ağacın değişikliklerin güvenilir ve hassas bir ölçü verir. Protein Kinaz C (PKC) aktivatör PMA ve dendritik gelişme farklılıklar görüntülenmiştir ve nicel değerlendirildi olduklarını göstermek metabotropik glutamat reseptör 1 (mGluR1) ile tedavi örnek kullanılması. Geniş bir dendritik ağaç, seçici ve yoğun immun yöntemler, dendritik mekanizmaları ifşa ettiği için Purkinje hücreleri güçlü bir model sistem haline Purkinje hücre spesifik EGFP ifadesi ile dendritik büyüme ve bir fare modeli dönemini kapsayacak organotipik dilim kültürlerin varlığının kombinasyonu gelişme.

Biz organotipik serebellar dilim kültürlerde yetişen bireyin Purkinje hücre dendritik ağacın morfolojisi görüntülemek ve kantitatif tayini için izin veren bir protokol mevcut. Bu protokol, Purkinje dendritik hücre gelişme mekanizmaları üzerinde çalışmalar teşvik etmek için tasarlanmıştır.

Organotipik Dilim Kültürleri Purkinje Hücre Dendritik Morfoloji Analizi

Purkinje hücreleri, son derece etkileyici ve kesin olarak ... olan dendritik ağaçları nedeniyle, dendritik gelişimin incelenmesi için cazip bir model sistemdir.

Bu prosedürün genel amacı, çeşitli deneysel koşullar altında burkini hücresi dendritik ağacının gelişimini analiz etmektir. Bu, öncelikle postnatal fare serebellumunun organotipik kesit kültürlerinin kurulmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, kesit kültürleri çeşitli deneysel koşullar altında kültüre edilir.Örneğin, MGL R one agonistlerinin etkisini test edin, ardından kültürleri sabitleyin ve anti Calbindin immün boyama ile bireysel Purkinje hücrelerinin morfolojisini ve dendritik ağaçlarını ortaya çıkarın. Son adım, kontrol veya deneysel koşullar altında büyütülen Purkinje hücrelerinin dendritik ağaçlarını analiz etmektir; bu analiz, immün boyalı Purkinje hücrelerinin floresan mikroskobisi ile gerçekleştirilir ve dendritik ağaçlarının boyutunun ve dallanmasının kantitatif değerlendirmesi, nörotransmitter reseptörünün, özellikle de MGL R one aktivasyonunun, Purkinje hücresi dendritik ağaç gelişimini derinlemesine etkilediğini göstermektedir.Bu tekniğin temel avantajı, kültür süresi boyunca Purkinje hücre uçlarının neredeyse tamamının uzamasının gerçekleşmesidir; böylece, dendritik ağaç gelişimi gibi oldukça karmaşık bir konu in vitro ortamda incelenebilir. Bu yöntem, aktivitenin nör

the-analysis-purkinje-cell-dendritic-morphology-organotypic-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu piramidal nöronların elektriksel kayıtlar yapma amaçlı bir Organotipik kültür neokortikal dilim hazırlama hazırlamak ve sürdürmek için bir protokoldür.

Neokorteks bir Organotipik Dilim Hazırlık Tüm Hücre Kaydı

Bu video, bir fare yavrusunun beyninden serebellar organotipik dilimler elde etmek ve bu dilimleri in vitro  serebellar gelişimi taklit etmek için besinler ve büyüme faktörleriyle desteklenmiş ortamda kültürlemek için bir tekniği göstermektedir.Ek olarak, spesifik serebellar dilimler bir test bileşiği ile muamele edilir ve bileşiğin nöroprotektif yeteneği bir immünofloresan boyama tekniği kullanılarak analiz edilir.

Organotipik Serebellar Dilim Kültürlerinde Purkinje Hücre Sağkalımının Analizi

Ön beyin ve beyincik dilim kültür sistemini kullanarak NG2 hücrelerini ve oligodendrositleri incelemek için bir teknik açıklanmıştır.  Bu yöntem, doku sitomimarisini korurken hücre dışı ortamın kolayca manipüle edilebildiği oligodendrosit soyu içindeki hücrelerin çoğalma ve farklılaşma dinamiklerinin incelenmesine izin verir.

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

Iskemik beyin hasarı birçok açıdan üreyen veriyor entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri için bir protokol, sunulmuştur. Nöronlarda değişikliklere ek olarak neurovasculature değişiklikleri inceleyerek, bu protokol yaralanma sonrası nöral dokuda plastik değişiklikleri incelemek için çok yönlü bir araçtır.

Içinde Neurovascular Yaptırma Analizi Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler

Burada organotipik dilim kültür tekniği kullanılarak hipokampal doğum sonrası nöron incelemek için bir teknik tarif. Bu yöntem, yetişkin nöron in vitro müdahale edilebilmesini sağlar ve kültürlenmiş hipokampus farmakolojik maddelerin doğrudan uygulama için izin verir.

POSTNATAL nöron Çalışmaları için organotipik Dilim Kültürler

Burada, sütunlar ve katmanlar halinde Drosophila medulla nöronların dendritik yönlendirmesini nasıl analiz edileceğini göstermektir. iş akışı, izleme referans sütun dizisine dendritik milleri tescili için ve 3 boyutlu uzayda dendritik yapıların analizi için görüntü kalitesi ve hesaplama araçlarını geliştirmek için bir çift görünümü görüntüleme tekniği içerir.

Sütunlar ve Katmanlar dendritik Morfoloji Analizi

Bu iletişim kuralı thalamocortical akson dallanma ve synapse oluşumu organotypic cocultures, talamus ve serebral korteks eşzamanlı görüntüleme için bir yöntemi açıklar. Bireysel thalamocortical akson ve presynaptic onların terminalleri bir tek hücre çoğalmasıyla tekniği ile DsRed ve synaptophysin GFP öğesini tarafından görüntülenmiştir.

Görselleştirme Thalamocortical Axon dallanma ve sinaps oluşumunda Organotypic Cocultures

Burada fare serebellum ve miyelin kılıf immünhistokimya tarafından myelination ve remyelination merkezi sinir sisteminde mekanizmaları araştıran için uygun boyama dilim kültürler organotypic hazırlamak için bir yöntem mevcut.

Hazırlık ve Immunostaining Myelinating Organotypic serebellar dilim kültürlerin

Organotipik dilim kültürleri nörogelişimsel veya dejeneratif /rejeneratif süreçleri incelemek için güçlü bir araçtır. Burada, fare serebellar dilim kültürlerde Purkinje hücrelerinin nörogelişimsel ölüm modelleri bir protokol açıklar. Bu yöntem nöroprotektif ilaç keşfinde araştırma yada yararlı olabilir.

Organotipik Serebellar Dilim Kültürlerde Purkinje Hücre Sağkalım

Bu protokol, preklinik ilaç testi için insan kardiyak dilimlerinin kesilmesi ve kültüre edilmesi prosedürünü açıklar ve bu dilimlerden aynı anda transmembran voltajı ve hücre içi kalsiyum sinyallerini kaydetmek için optik haritalamanın kullanımını ayrıntılarıyla açıklar.

İnsan Organotipik Kardiyak Dilimlerinin Çift Voltaj ve Kalsiyum Optik Haritalaması ile Preklinik Kardiyak Elektrofizyoloji Değerlendirmesi

Serebellar Purkinje hücreleri (PC'ler), DNA hasar yanıtındaki eksikliklere karşı özellikle hassastır. SEREBELLAR organotipik kültürler içinde proteine bağlı poli (ADP-riboz) zincirlerinin boyanmasını içeren, DNA hasarına PC yanıtının dinamiklerinin görsel olarak değerlendirilmesi için bir protokol sunulmuştur.

Serebellar Organotipik Kültürler Kullanılarak Purkinje Hücrelerinde DNA Hasar Yanıtının Görüntülenmesi

Öğrenin, organotipik dilim kültürlerinde Purkinje hücrelerinin dendritik morfolojisini nicel olarak değerlendirmek için bu protokolü kullanın. MGLR1 aktivasyonunun dendritik ağaç gelişimi üzerindeki etkilerini inceleyin.

Organotipik Dilim Kültürleri Purkinje Hücre Dendritik Morfoloji Analizi

Daha fazla video keşfet