Germ-free Mouse Aşamalı Kolonizasyon sırasında Karaciğer metabolik değişiklikler Değerlendirilmesi ¹ H-NMR Spektroskopi

Bu prosedürün amacı, ilerleyici bir kolonizasyonun konak hepatik metabolizması üzerindeki etkisini değerlendirmektir. Bu, önce mikropsuz farelerin aşamalı olarak kolonize edilmesiyle gerçekleştirilir. Kolonizasyon süreci, NMR spektroskopisi ile mikrobiyal kobolitlerin idrarla atılımı değerlendirilerek izlenir.

Kolonizasyon sürecinin izlenmesini takiben, fareden bir karaciğer biyopsisi toplanır ve metabolik profilleme için hazırlanır. Hepatik metabolik profil daha sonra tahribatsız yüksek çözünürlüklü sihirli açılı eğirme NMR spektroskopisi kullanılarak sağlam biyopsiden elde edilebilir. Sonuç olarak, proton NMR spektroskopisinin bu kullanımı, enerji ve oksidatif stres yolları gibi metabolik yollarda yer alan çeşitli metabolitleri ortaya çıkarır.

Dolayısıyla bu deney, kolonizasyon sırasında karaciğer fonksiyonları hakkında fikir verebilir. Böbrek gibi sistem üzerinden de uygulanabilir. Hayvanları kolonileştirmek için, mikropsuz fareleri izolatörlerden çıkarın ve onları, kontrol görevi gören geleneksel hayvanların önünde bir filtre ile donatılmış kafeslerde geleneksel bir yetiştirme odasında barındırın.

Daha sonra, kontrol konvansiyonel kafesinden alınan üç günlük bir çöpün yarısını mikropsuz hayvanların çöpüyle karıştırın, fareyi tüpün üzerinden tutarak 1.5 mililitrelik bir mikro tüpte idrar toplayın ve bağırsağa hafifçe masaj yaparak yardım edin. Beş milimetrelik bir NMR probu ile elde etmek için en az 20 mikrolitre gereklidir, ancak metabolik profilleme kalitesini artırmak için 30 mikrolitre kullanılması önerilir. İdrarı hemen sıvı nitrojen içinde dondurun, NMR analizine kadar en az eksi 40 santigrat derece saklayın.

NMR alımından önce, ağır suda 0.2 molar sodyum fosfat tampon çözeltisi hazırlayın. Bir milimolar TSP içeren pH 7.4, 30 mikrolitre idrarı 30 mikrolitre sodyum fosfat tamponu ile karıştırın. Karışık çözeltinin 50 mikrolitresini, metal bir iğne ile donatılmış 50 mikrolitrelik bir cam şırınga kullanarak 1.7 milimetrelik bir NMR kılcal tüpe aktarın.

Kabarcıklardan kaçınmaya dikkat edin. Kılcal adaptörü, idrar örneğini içeren kılcal damarın üzerine yerleştirin ve beş milimetrelik bir NMR probu için 2,5 milimetrelik bir NMR mikro tüpüne yerleştirin. Bu tüp kombinasyonu, spektral elde etmek için standart bir beş milimetre NMR tüpü olarak kullanılabilir.

Bu gösteride, verileri toplamak için daha gelişmiş üç adet 700 megahertz NMR spektrometresi kullanılmıştır. Yazılı protokolde tartışılan parametreleri kullanarak bir boyutlu proton NMR Spektrumu elde edin. NMR edinimini takiben, yazılı protokolde tartışıldığı gibi hayvanların ötenazisini takiben dışarı çekmek için kılcal adaptörü hafifçe vidalayarak kılcal damarı 2,5 milimetre NMR tüpünden çıkarmak için ekstraksiyon çubuğunu kullanın.

Karaciğer biyopsisi için hazırlanın. Kontaminasyonu önlemek için alkol içeren herhangi bir ürün kullanmayın ve aletleri su veya tuzlu su solüsyonu kullanarak yıkayın. Tekrarlanabilir biyopsiler için sol lobdan karaciğer biyopsileri toplayın.

Dokunun daha ince olduğu periferik alanlardan kaçınarak sol lobun merkezinde tutarlı bir şekilde toplayın. Safra kaçağı ihtimaline karşı safra kesesini delmemeye özen gösterin. Dokuyu hemen su veya tuzlu su çözeltisi ile yıkayın.

Biyopsileri hemen sıvı nitrojen içinde dondurun ve NMR analizine kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın HRM-A-S-N-M-R'yi ayarlamak için, üçüncü biyopsiyi bir zirkonyum rotora yerleştirin ve hacmin geri kalanını NMR kilidi için saf ağır su ile doldurun. Herhangi bir baloncuk yapmamaya dikkat edin, çünkü bunlar sonraki şimleme ve veri toplamanın kalitesini değiştirebilir. Silindirik vidayı kullanarak 50 mikrolitrelik bir Teflon ara parçası yerleştirin.

Vidasını sökün ve kısa taraftaki derinlik ölçeri kullanarak kalibre edin. İplik pimini ara parçaya yerleştirin ve tornavidayla nazikçe vidalayın. Kuru ev, bir parça doku ile herhangi bir artık su.

Ardından, kapağı rotorun üst kısmına yerleştirin ve rotor paketleyiciye yerleştirin. Kapak yerine oturana kadar sıkıca bastırın. Rotor ile kapağı arasında herhangi bir boşluk bırakılmamalıdır, optik dönüş hızının algılanmasına izin vermek için siyah işaretleyici kalem kullanılarak rotorun alt kısmının yarısını işaretleyin.

Rotor yeterince paketlendikten sonra, NMR spektrometresinin içine yerleştirin ve beş kilohertz döndürmeye başlayın. Burada. Bir bru gelişmiş üç 500 megahertz spektrometresi kullanılır. Bir CP MG darbe dizisi kullanarak proton NMR spektrumu elde edin.

Üreticinin yönergelerine göre, elde edilen NMR spektrumlarını kalibre etmek için milyonda 5.22 parçada bol miktarda alfa ve sayısal glikoz çift zirvesi kullanılabilir. Rotoru ambalajından çıkarmak için, kapak çıkarıcıyı kullanarak kapağı çıkararak devam edin, diş pimini sökün ve Teflon ara parçasını çıkarın. Silindirik vida kullanılarak, cihaz su ve deterjan kullanılarak iyice yıkanabilir.

Kolonizasyon süreci boyunca bağırsak mikrobiyal kobolitlerinin görünümü, 20 gün boyunca kolonize edilmiş bir hayvan için idrar metabolik profilinin bu proton spektrumunda açıkça gösterilmiştir. Bu hayvan, mikropsuz durumda herhangi bir uysal sülfat ve çok az miktarda fenil asetil glisin, kısaltılmış PAG ve que hücre sülfat salgılamadı. Kolonizasyon ilerledikçe, bağırsak mikrobiyotası tarafından protein metabolizmasının bu üç belirteci önemli ölçüde artar ve 20. günde bir dengeye ulaşır.

Spesifik PAG üçlü tepe noktasını entegre ederek, zaman içinde bu özel işaretleyicideki artışı ölçmek mümkün oldu. Bu diyagram, kolonizasyondan önce ve sonra iki farenin hepatik metabolik profili olan proton H-R-M-A-S-N-M-R spektroskopisi kullanılarak yedi hayvandan oluşan bir grup için kolonizasyon sırasındaki ortalama PAG konsantrasyonunu temsil eder. Bu şekil, A-M-A-S-N-M-R tabanlı metabolik profilden elde edilebilecek bilgileri iyi bir şekilde göstermektedir.

Enerjik metabolizmadan türetilen çok sayıda amino asit ve metabolit görselleştirilebilir. Bu profiller ayrıca oksidatif stres, nükleotid metabolizması ve metil amin metabolizması ile ilgili bilgileri içerir. Bu örnekte, mikropsuz farenin neredeyse hiç glikojen göstermediği ve çok düşük miktarda glikoz ve trigliserit gösterdiği çok açıktır.

Bu prosedürü takiben, mantıksal örnekleri metabolik profile göre kümelemek ve metabolik durumla ilişkili biyobelirteçleri vurgulamak için kemoterapi gibi çoklu istatistiksel araçlar uygulanabilir.