Germ-free Mouse Aşamalı Kolonizasyon sırasında Karaciğer metabolik değişiklikler Değerlendirilmesi ¹ H-NMR Spektroskopi

Bu prosedürün amacı, progresif kolonizasyonun konakçı hepatik metabolizması üzerindeki etkisini değerlendirmektir. Bu, öncelikle germ-free farelerin progresif olarak kolonize edilmesiyle gerçekleştirilir. Kolonizasyon süreci, mikrobiyal ko-metabolitlerin idrarla atılımının NMR spektroskopisi ile değerlendirilmesi yoluyla izlenir.

Kolonizasyon sürecinin izlenmesinin ardından, fareden bir karaciğer biyopsisi alınır ve metabolik profilleme için hazırlanır. Ardından, tahribatsız yüksek çözünürlüklü sihirli açı döndürmeli (magic angle spinning) NMR spektroskopisi kullanılarak, sağlam biyopsiden hepatik metabolik profil elde edilebilir. Sonuç olarak, proton NMR spektroskopisinin bu kullanımı, enerji ve oksidatif stres yolları gibi metabolik yolaklarda yer alan çeşitli metabolitleri ortaya çıkarır.

Böylece bu deney, kolonizasyon sırasındaki karaciğer fonksiyonları hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca böbrek gibi sistemler aracılığıyla da uygulanabilir. Hayvanları kolonize etmek için, germ-free fareleri izolatörlerden çıkarın ve kontrol grubu olarak hizmet eden konvansiyonel hayvanların önünde bir filtre bulunan kafeslerde, konvansiyonel bir bakım odasında barındırın.

Ardından, kontrol konvansiyonel kafesinden alınan üç günlük bir altının yarısını, germ-free hayvanların altıyla karıştırın; fareyi tüpün üzerinde tutarak ve bağırsakları nazikçe masajlayarak idrarı 1,5 mililitrelik bir mikro tüpe toplayın. Beş milimetrelik bir NMR probu ile veri elde etmek için minimum 20 µL gereklidir, ancak metabolik profilleme kalitesini artırmak için 30 µL kullanılması önerilir. İdrarı hemen sıvı azotta şok dondurun ve NMR analizine kadar en az -40 °C'de saklayın.

NMR ölçümü öncesinde, ağır su içerisinde 0.2 molar sodyum fosfat tampon çözeltisi hazırlayın. pH 7.4 değerinde ve bir millimolar TSP içeren bu çözeltiden 30 mikrolitre sodyum fosfat tamponunu, 30 mikrolitre idrar ile karıştırın. Karıştırılan çözeltiden 50 mikrolitreyi, metal iğne uçlu 50 mikrolitrelik bir cam şırınga kullanarak 1.7 milimetrelik bir NMR kapiler tüpüne aktarın.

Kabarcık oluşmamasına dikkat edin. Kapiler adaptörü, idrar örneği içeren kapilerin üzerine yerleştirin ve bunu 5 milimetrelik bir NMR probu için olan 2,5 milimetrelik bir NMR mikro tüpüne yerleştirin. Tüplerin bu kombinasyonu, spektral veri toplama işlemi için standart bir 5 milimetrelik NMR tüpü olarak kullanılabilir.

Bu gösterimde, verileri toplamak için bir Bruker Advanced Three 700 megahertz NMR spektrometresi kullanılmıştır. Yazılı protokolde tartışılan parametreleri kullanarak tek boyutlu proton NMR spektrumlarını elde edin. NMR veri toplama işleminin ardından, yazılı protokolde tartışılan hayvanların ötanazisini takiben, kılcal adaptörü nazikçe vidalayarak kılcal boruyu 2,5 milimetrelik NMR tüpünden çıkarmak için ekstraksiyon çubuğunu kullanın.

Karaciğer biyopsisi için hazırlık yapın. Kontaminasyonu önlemek için alkol içeren herhangi bir ürün kullanmayın ve araçları su veya salin solüsyonu ile yıkayın. Tekrarlanabilir biyopsiler için karaciğer biyopsilerini sol loptan toplayın.

Dokunun daha ince olduğu periferik alanlardan kaçınarak, sol lobun merkezinden tutarlı bir şekilde örnek toplayın. Safra sızıntısı riskine karşı safra kesesini delmemeye dikkat edin. Dokuyu hemen su veya salin solüsyonu ile yıkayın.

Biyopsileri hemen sıvı azot ile şok dondurun ve NMR analizine kadar eksi 80 derece santigrat sıcaklıkta saklayın. H-R-M-A-S-N-M-R hazırlığı için, üçüncü biyopsiyi bir zirkonyum rotora yerleştirin ve hacmin geri kalanını NMR kilitleme için saf ağır su ile doldurun. Sonraki şimlendirme ve veri toplama kalitesini etkileyebileceği için hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Silindirik vidayı kullanarak 50 mikrolitrelik bir Teflon ara parça yerleştirin.

Vidayı sökün ve kısa kenardaki derinlik ölçerini kullanarak kalibre edin. Diş pimini ara parçanın üzerine yerleştirin ve tornavida ile nazikçe vidalayın. Kalan tüm suyu bir parça kağıt havluyla kurulayın.

Ardından, kapağı rotorun üst kısmına yerleştirin ve rotor paketleyiciye takın. Kapak yerine oturana kadar sıkıca bastırın. Rotor ile kapağı arasında hiç boşluk kalmamalıdır; optik dönüş hızı tespitine olanak sağlamak için rotorun alt kısmının yarısını siyah keçeli kalemle işaretleyin.

Rotor yeterince doldurulduktan sonra, NMR spektrometresinin içine yerleştirin ve beş kilohertz hızda döndürmeye başlayın. Burada, Bruker Advanced Three 500 megahertz spektrometresi kullanılmıştır. CP MG puls dizisi kullanarak proton NMR spektrumu elde edin.

Üretici kılavuzuna göre, 5,22 parts per million'daki belirgin alfa ve numerik glikoz dublet piki, elde edilen NMR spektrumlarını kalibre etmek için kullanılabilir. Rotoru çıkarmak için kapak sökücüyü kullanarak kapağı çıkarın, dişli pimi sökün ve Teflon ara parçayı çıkarın. Silindirik vida kullanılarak, düzenek su ve deterjan ile iyice yıkanabilir.

Kolonizasyon süreci boyunca bağırsak mikrobiyal ko-metabolitlerinin ortaya çıkışı, 20 gündür kolonize edilmiş bir hayvanın idrar metabolik profiline ait bu proton spektrumunda açıkça gösterilmektedir. Bu hayvan, germ-free durumundayken hiç indol-sulfat ve çok düşük miktarlarda, PAG olarak kısaltılan fenilasetilglisin ve kinezul sülfat atılmamıştır. Kolonizasyon ilerledikçe, bağırsak mikrobiyotası tarafından gerçekleştirilen protein metabolizmasının bu üç belirteci önemli ölçüde artmış ve 20. günde bir dengeye ulaşmıştır.

Spesifik PAG triplet piki entegre edilerek, bu özel belirteçteki artışın zaman içinde miktar tayini yapılması mümkün olmuştur. Bu diyagram, proton H-R-M-A-S-N-M-R spektroskopisi kullanılarak yedi hayvandan oluşan bir grup için kolonizasyon sırasındaki ortalama PAG konsantrasyonunu temsil etmekte olup, iki farenin kolonizasyon öncesi ve sonrası hepatik metabolik profili elde edilmiştir. Bu şekil, A-M-A-S-N-M-R tabanlı metabolik profilden türetilebilecek bilgileri açıkça göstermektedir.

Enerjik metabolizmadan türeyen metabolitlerin yanı sıra çok sayıda amino asit görselleştirilebilir. Bu profiller ayrıca oksidatif stres, nükleotid metabolizması ve metil amin metabolizması ile ilgili bilgiler de içerir. Bu örnekte, germ-free farenin neredeyse hiç glikojen ve çok düşük miktarlarda glikoz ile trigliserid sergilediği oldukça açıktır.

Bu prosedürü takiben, metabolik profile göre mantıksal örnekleri kümelemek ve metabolik durumla ilişkili biyobelirteçleri vurgulamak amacıyla kemometri gibi çok sayıda istatistiksel araç uygulanabilir.