Name: Dan Ekstrasellüler Akışkan Vampiric İzolasyonu Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Öğrenin Caenorhabditis elegans'ta ekstraselüler sıvı izolasyonu ve RNAi sinyal iletimini mikroenjeksiyon tekniğiyle inceleme yöntemini. Bu teknik sistemik gen susturma mekanizmalarını anlamak için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Hunter laboratuar işbirlikçi doğasını kabul etmek ister ve bu tekniğin geliştirilmesi mümkün ve eğlenceli hale faydalı tartışma ve yardım için kendilerine teşekkür ederim. Biz Nigel Delaney ve solucan ve bakteriyel suşları için Caenorhabditis Genetik Merkezi teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri CPH GM089795 hibe ile desteklenmiştir.

<ol><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Stable+Transgenic+C.+elegans+Using+Microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).</li>
<li>Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+GMP-dependent+protein+kinase+EGL-4+controls+body+size+and+lifespan+in+C+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 controls body size and lifespan in C elegans.</a> Development. 130, 1089-1099 (2003).</li>
<li>Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+cell+lineage+following+laser+ablation+of+cells+in+the+somatic+gonad+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 87, 286-300 (1981).</li>
<li>Hegreness, M., Shoresh, N., Hartl, D., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+equivalence+principle+for+the+incorporation+of+favorable+mutations+in+asexual+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An equivalence principle for the incorporation of favorable mutations in asexual populations.</a> Science. 311, 1615-1617 (2006).</li>
<li>Labrousse, A., Chauvet, S., Couillault, C., Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+is+a+model+host+for+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans is a model host for Salmonella typhimurium.</a> Curr. Biol. 10, 1543-1545 (2000).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome. Biol. 2, (2001).</li>
<li>Min, K., Kang, J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+feeding+RNAi+method+for+simultaneous+knock-down+of+more+than+one+gene+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A modified feeding RNAi method for simultaneous knock-down of more than one gene in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechniques. 48, 229-232 (2010).</li>
<li>Zhuang, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specificity+of+Caenorhabditis+elegans+Enhanced+RNAi+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans Enhanced RNAi Mutants.</a> Genetics. 188 (1), 235-237 (2011).</li>
<li>Way, J. C., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mec-3%2C+a+homeobox-containing+gene+that+specifies+differentiation+of+the+touch+receptor+neurons+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mec-3, a homeobox-containing gene that specifies differentiation of the touch receptor neurons in C. elegans.</a> Cell. 54, 5-16 (1988).</li>
<li>Kamath, R. S., Fraser, A. G., Dong, Y., Poulin, G., Durbin, R., Gotta, M., Kanapin, A., Bot, N. L. e, Moreno, S., Sohrmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li>
<li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+RNAi+in+C.+elegans+requires+the+putative+transmembrane+protein+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1.</a> Science. 295, 2456-2459 (2002).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz burada model organizma C&#39;den ekstrasellüler sıvı izolasyonu ve karakterizasyonu sağlayan yeni bir yöntem sundu elegans. Tekniği ekstrasellüler sıvı toplam hacmi artırmak için donör solucanlar genetik veya fiziksel manipülasyon ile başlar. Hücre dışı sıvı daha sonra bir modifiye mikroenjeksiyon tekniği kullanılarak izole edilir. Solucanlar işlem sırasında halen solucanlar tutmak için kuru agaroz pedleri kullanarak mikroenjeksiyon için monte edilmiştir. Pad fiziksel eki hidrostatik yerde solucan ...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Gün</strong</td&gt;<td<strong&gt; Solucan Hazırlık</strong</td&gt;<td<strong&gt; Malzeme Hazırlık</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -7 Veya öncesinde</td&gt;<td&gt; Temiz tutun, iyi beslenen<em&gt; Clr-1 (e1745)</em&gt; Ve N2 solucanlar</td&gt;<td&gt; Enjeksiyon yastıkları, NGM plakalar, NGM + Carb / IPTG plakaları, OP50 LB stok Yap</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -6</td&gt;<td</td&gt;<tdLB RNAi gıda&gt; Streak + Carb</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -5</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; RNAi gıda ile gecede 3 mL inoküle</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -4</td&gt;<td&gt; RNAi plaka embriyolar Taşı</td&gt;<td&gt; Tohum RNAi plakası</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -3</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -2</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -1</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 0</td&gt;<td&gt; 4 saat boyunca 25 ila solucanlar Shift</td&gt;<td&gt; Tahlil plakaları olun</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; NGM plakalar temizlemek için solucanlar Taşı</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; Vampiric transferi</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; Alıcı Kurtar</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; +1</td&gt;<td&gt; Transferi Alıcı kaldır</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; +2</td&gt;<td&gt; Puan Döl</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tablo 1.</strong&gt; Malzeme hazırlama zaman çizelgesi.</p&gt;<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Ekipman</strong</td&gt;<td<strong&gt; Şirket</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog numarası</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pikolitrelik Basınç Enjektör</td&gt;<td&gt; Warner Aletleri</td&gt;<td&gt; 65-0001 (PLI-100)</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Flaming / Brown mikropipet Çektirme</td&gt;<td&gt; Sutter Aletleri</td&gt;<td&gt; P97</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axiovert 200</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"<strong&gt; Reaktifler</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Madeni Yağ</td&gt;<td&gt; EM Bilim</td&gt;<td&gt; MX1560-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22x50 no 1 ½ Kapak Cam</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SeaKem LE Agaroz</td&gt;<td&gt; Lonza</td&gt;<td&gt; 50004</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Borosilikat Cam Kapilerde</td&gt;<td&gt; Dünya Precision Instruments</td&gt;<td&gt; 1B100F-4</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sodyum hipoklorit solüsyonu (% 5 mevcut Klor)</td&gt;<td&gt; JT Baker</td&gt;<td&gt; 9416-01</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"<strong<em&gt; C. elegans</em&gt; Ve Bakteriyel Suşlarının</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; Clr-1 (e1745) II</em&gt;<sup&gt; 9</sup</td&gt;<td&gt; Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)</td&gt;<td&gt; CB3241</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; GLP-1</em&gt; RNAi vektör<sup&gt; 10</sup&gt;</td&gt;<tdBioscience&gt; Kaynak (Ahringer Besleme Library)</td&gt;<td&gt; F02A9.6</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; Pal-1</em&gt; RNAi vektör<sup&gt; 11</sup&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; PHC187</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; OP50-GFP<sup&gt; 5</sup&gt;</td&gt;<td&gt; Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)</td&gt;<td&gt; OP50-GFP</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; YFP<em&gt; E. coli</em&gt;<sup&gt; 4</sup&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; MC4100-YFP</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tablo 2.</strong&gt; Özel reaktifleri ve ekipmanlar.</p

dan ekstrasellüler akışkan vampiric İzolasyonu<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Genetik uysal model organizma C. elegans büyüme ve küçük boyutu kolaylığı, kısa döl süresi olarak etkin, biyolojik soruları sayısız içgörüler sağladı. Bu küçük boyutlu olsa da, diğer model sistemlerde bulunan teknik yaklaşımlar bir dizi izin vermemesi. Örneğin, memeli sistemlerinde ve bitkilerde aşılama teknikleri, kan transfüzyonları dolaşım sistemi bileşimi ve sinyalizasyon sorular sorarak etkinleştirdiğinizde. Son zamanlarda doğrudan test edilmesi imkansız kadar solucanın dolaşım sistemi, pseudocoelom vardır. Hücrelerarası sinyalizasyon ve dolaşım sistemi kompozisyon C. soruları cevaplamak için elegans araştırmacılar geleneksel genetik analiz, hücre / doku spesifik kurtarma ve mozaik analizi döndü. Bu teknikler hücreler arasında ne olup bittiğini anlaması için bir araç sağlar, ancak ekstrasellüler moleküllerin tanımlanması ve karakterizasyonu evrensel olarak geçerli değildir. Burada biz ne sunuyoruzdoğrudan tahlil C. pseudocoelomic sıvı WLY geliştirilmiş tekniği elegans. Tekniği ekstraselüler sıvı hacmini artırmak için genetik veya fiziksel manipülasyon ile başlar. Daha sonra hayvanların ince bir denge basıncı kontrolü sağlayan bir mikroenjeksiyon kulesi kullanarak bir vampir ters mikroenjeksiyon tekniği tabi tutulur. Ekstrasellüler sıvı izolasyonundan sonra, toplanan sıvı diğer hayvanların içine transferi ile ya da moleküler araçlar ile tayin edilebilir. Bu tekniğin etkinliğini göstermek için bir sistemik RNAi yanıtı sırasında tahlil ekstraselüler sinyal molekülleri, uzun dsRNA belirli bir örnek için ayrıntılı bir yaklaşım sunmak. Sistemik RNAi karakterizasyonu prensibi örnek bir kanıtı olsa da, biz dolaşım sistemi bileşimi ve sinyalizasyon soruları çeşitli cevaplamak için adapte olarak bu tekniği görmek.

Model organizma<em&gt; C. elegans</em&gt; Pasif bir dolaşım sistemi olarak pseudocoelomic sıvısı kullanır. Bu sıvı Doğrudan testi daha önce mümkün olmamıştır. Burada doğrudan tahlil ekstrasellüler boşluğa bir roman tekniği sunmak ve ilke örnek bir kanıtı olarak RNAi yanıtı sırasında sistemik susturulması sinyalleri kullanır.

Dan Ekstrasellüler Akışkan Vampiric İzolasyonu<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Genetik olarak işlenebilir bir model organizma olan C. elegans, kısa nesil süresi sayesinde çok sayıda biyolojik sorunun aydınlatılmasına olanak sağlamıştır...

Bu prosedürün genel amacı, RNAi sinyalleşmesiyle ilgili sorular gibi, psödo sıvı bileşimi ve fonksiyonuna dair soruları yanıtlamak için hücre dışı sıvıyı izole etmektir. Bu işlem, öncelikle solucanların dsRNA eksprese eden bakterilerle beslenmesiyle gerçekleştirilir; bu durum, kolayca puanlanabilen bir RNAi fenotipi ile sonuçlanır. Ardından, solucanların RNAi susturma sinyallerini vücut boyunca yaymalarına izin verilir.Ardından, mevcut hücre dışı sıvının toplam hacmi artırılır. Son olarak, hücre dışı sıvıyı çekmek için bir mikroenjeksiyon iğnesi kullanılır ve bu sıvı RNAi naif bir solucana enjekte edilir. Nihayetinde, RNAi susturma sinyallerinin varlığı, enjekte edilen solucanların progenilerinin skorlanması yoluyla gösterilebilir.Bu yöntem sayesinde, sadece sistemik RNAi hakkında değil, aynı zamanda çeşitli hücreler arası sinyal iletim yolları hakkında da bilgi sağlamak amacıyla hücre dışı sıvının bileşimini analiz edebiliriz. Genel olarak, bu tekniğe yeni başlayan kişiler, çalışılması gereken hız nedeniyle zorluk yaşayacaklardır. Donör solucanları hazırlamak için, LB artı CARIL plaklarında tek koloniler halinde dsRNA eksprese eden clear one E 1745 çizgi ekim bakterileri kullanılı

vampiric-isolation-of-extracellular-fluid-from-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, tüm solucanları FACS veya sağlam hücrelerin immünopresipitasyonu için uygun tek hücreli bir süspansiyona ayırmak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Caenorhabditis elegans'ın Tek Hücre Ayrışması: Canlı Hücreleri İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Kaynak: Petersen, C. ve ark., Model Nematod Caenorhabditis elegans'ın Doğal Mikrobiyotasının İzolasyonu ve Karakterizasyonu. J. Vis. Exp. (2022)Bu video, Caenorhabditis elegans ile ilişkili bakteri türlerinin izolasyonu ve yetiştirilişini göstermektedir. C. elegans'ın boncuk bazlı lizisi ve ardından seçici kültürleme, çeşitli mikrobiyal suşların daha ileri analiz için izole edilmesini sağlar.

Caenorhabditis elegans ile ilişkili bakterilerin izolasyonu ve yetiştiriciliği

Bu video, Caenorhabditis elegans'tan floresan olarak işaretlenmiş nöronların izolasyonunu göstermektedir. Kolinerjik nöronlarda floresan proteinle kaynaşmış veziküler transmembran taşıyıcıları eksprese etmek için tasarlanmış transgenik solucanlardan bir hücre süspansiyonu elde edilir. Floresan olarak işaretlenmiş nöronlar daha sonra floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) kullanılarak izole edilir ve kültürde tutulur.

Floresanla Aktive Edilen Hücre Sınıflandırması ile Caenorhabditis elegans'tan Nöronların İzolasyonu

Burada, biz transgenik Caenorhabditis elegans hatları yeşil floresan protein ifade canlı nöronal hücrelerin belirli grupların basit yalıtım için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, belirli nöronlara odaklanan ex vivo çalışmaların çeşitli sağlar ve daha kısa vadeli kültür için hücreleri yalıtmak için kapasitesine sahiptir.

Roundworm Caenorhabditis elegans belirli neuron nüfus yalıtım

Bu makalede, caenorhabditis elegans hücre dışı veziküller üretmek, arındırmak ve ölçmek için yöntemler sunar.

Arınma ve Caenorhabditis elegans Ekstrasellüler Veziküllerin Analizi

Protokol, 36 saate kadar sürekli bir gıda arzı varlığında C. elegans yetiştirmek için kullanılan basit bir mikroakışkan çip tasarımını ve mikrofabrikasyon metodolojisini açıklamaktadır. Büyüme ve görüntüleme cihazı ayrıca, birkaç gün boyunca geliştirme sırasında hücresel ve hücre altı süreçlerin aralıklı uzun süreli yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar.

Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Büyümesi ve Görüntülenmesi için Basit Bir Mikroakışkan Çip

Caenorhabditis elegans'ın mikrosporidian parazit Nematocida parisii tarafından enfeksiyonu, solucanların aynı patojene karşı oldukça dirençli yavrular üretmesini sağlar. Bu, kötü anlaşılmış bir epigenetik fenomen olan kalıtsal bağışıklığın bir örneğidir. Mevcut protokol, genetik olarak izlenebilir bir solucan modelinde kalıtsal bağışıklığın incelenmesini açıklamaktadır.

Caenorhabditis elegans Mikrosporidia Enfeksiyonu Modelinde Kalıtsal Bağışıklığın İncelenmesi

Burada, Caenorhabditis elegans genomik DNA'sının ticari olarak temin edilebilen bir doku kiti kullanılarak bir veya birkaç hayvandan basit ve nispeten hızlı bir şekilde izole edilmesinin bir açıklaması sunulmaktadır. Elde edilen gDNA preparatı PCR için uygun bir şablondur.

Caenorhabditis elegans Genomik DNA'sının Küçük Ölçekli Ekstraksiyonu

Caenorhabditis elegans , biyolojideki ana model türlerden biridir, ancak neredeyse tüm araştırmalar doğal olarak ilişkili mikroplarının yokluğunda gerçekleştirilir. Burada açıklanan yöntemler, gelecekteki fonksiyonel C. elegans araştırmalarının temeli olarak ilişkili mikropların çeşitliliği hakkındaki anlayışımızı geliştirmeye yardımcı olacaktır.

Model Nematod Caenorhabditis elegans'ın Doğal Mikrobiyotasının İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Bu protokol, sıvı kültürdeki bakterilerin klirensinin ölçülmesine dayalı olarak Caenorhabditis elegans besleme hızını ölçmek için bir testi tanımlar.

Bakteriyel Klerensi Ölçerek Caenorhabditis elegans'ta Gıda Alımının Ölçülmesi

Burada, Echinococcus granulosus'tan in vitro kültür koşullarını, izolasyonu ve hücre dışı veziküllerin (EV'ler) artan oluşumunu açıklıyoruz. Küçük EV'ler, dinamik ışık saçılımı ve transmisyon elektron mikroskobu ile karakterize edildi. Kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerin tutulumu ve fenotipik modülasyonları, konfokal mikroskopi ve akış sitometrisi kullanılarak incelendi.

Echinococcus granulosus'tan Küçük Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Dendritik Hücre Alımı

Öğrenin Caenorhabditis elegans'ta ekstraselüler sıvı izolasyonu ve RNAi sinyal iletimini mikroenjeksiyon tekniğiyle inceleme yöntemini. Bu teknik sistemik gen susturma mekanizmalarını anlamak için değerli bir araçtır.

Dan Ekstrasellüler Akışkan Vampiric İzolasyonu

Daha fazla video keşfet