Bir Aracı Olarak Korelatif Işık ve Elektron Mikroskobu (CLEM) microinjected Moleküller ve Ökaryotik Alt hücresel Hedefler Visualize'a

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kültürlenmiş bir memeli hücresinin sitoplazmasına floresan işaretli küçük moleküller veya proteinlerle giriş yapmak ve indüklenen morfolojik değişiklikleri mikrometre ile çok nanometre çözünürlükte gözlemlemektir. Bu işlem, öncelikle memeli hücrelerinin ızgaralı cam lameller üzerinde kültürlenmesi ve ardından ilgili floresan işaretli küçük molekül veya proteinin hücrelere mikroenjeksiyon yoluyla aktarılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, hücreler formaldehit ile fikse edilir ve floresan mikroskobu kullanılarak gözlemlenip görüntülenir.

Ardından hücreler glutaraldehit ile fikse edilir, kesitleri alınır, boyanır ve elektron mikroskobu kullanılarak görüntülenir. Son olarak, parlak alan floresan ve elektron mikroskobisi sırasında alınan görüntüler birleştirilir ve hizalanır. Nihayetinde, bu görüntülerin korelasyonu, araştırmacının ilgilenilen küçük molekül veya protein tarafından indüklenen pertürbasyonları yüksek çözünürlükte görüntülemesine olanak tanır.

Merhaba, ben Dallas'taki Texas Southwestern Tıp Merkezi Üniversitesi mikrobiyoloji bölümünde, Dr. Neil Alto'nun laboratuvarında çalışan Dr. Evan Reddick. Bugün size M Clem prosedüründen, yani mikroenjeksiyon korelatif ışık ve elektron mikroskobisinden bahsedeceğim. Bu prosedürün, mikroenjeksiyon veya mikroskopi gibi tek başına uygulanan tekniklere göre temel avantajı, bu işlemlerin ızgaralı bir cam lamel yardımıyla koordineli bir şekilde gerçekleştirilmesidir.

Araştırmacıların protokolün farklı aşamaları boyunca aynı hücreye geri dönmelerini sağlayan şey, bu ızgaralı lameldir. Ayrıca bu teknik, araştırmacıya çok çeşitli enjekte edilebilir küçük moleküller veya ilgi duyulan proteinler aracılığıyla indüklenen hücresel mimari değişiklikleri gözlemleme imkanı sunar ve bunu mikrometre ile çoklu nanometre çözünürlükte gerçekleştirmeye olanak tanır. Mikroenjeksiyon hazırlığı için, normal sıçan böbreği veya ölümsüzleştirilmiş serviks kanseri hücreleri gibi kültür hücrelerini, canlı hücre kaplarına sabitlenmiş foto-dağlama yöntemiyle hazırlanmış cam ızgaralı lameller üzerine ekleyin; hücreleri 37 °C ve %5 CO2 ortamında inkübe edin.

Kullanılacak deneysel zaman çizelgesine bağlı olarak, hücrelerin konfluensini ayarlayın. Tamamen konfluent bir plak, mikroenjeksiyon yapılmış hücrelerin elektron mikroskobunda tanımlanmasını çok zorlaştıracaktır. Bu nedenle, hücreleri kısa süreli bir deneyin gerçekleşeceği günde yaklaşık %50 konfluense, daha uzun deneylerde ise yaklaşık %25 konfluense ulaşacak şekilde ekimleyin.

Daha uzun süren bir deneyin yapıldığı gün, floresan işaretli protein, DNA veya küçük molekülleri uygun tampon içerisinde 50 µL son hacme gelecek şekilde hazırlayın. Seçilen florofora bağlı olarak, Texas red veya cascade blue gibi bir takip boyası ekleyin. 0,5 ile 1 mg/mL arasında bir konsantrasyon ekleyin.

Çözeltiyi 0,22 mikronluk bir santrifüj filtresinden süzün. Üretici kılavuzlarını kullanarak mikroenjeksiyon iğnelerini çektikten sonra, iğnenin arka kısmına dikkatlice birkaç mikrolitre çözelti pipetleyin. İğneyi, ters mikroskoba bağlı ticari bir mikroenjeksiyon cihazının mikromanipülatör koluna yerleştirin.

Kültürlenmiş hücrelerin bulunduğu bir petri kabını ters mikroskobun kap tutucusuna yerleştirin. Fotoğrafla aşındırılmış bir ızgara içinde büyüyen hücreleri bulun ve ızgaraların alfanümerik tanımlayıcısını not edin. Bu tanımlayıcı, sonraki tüm adımlarda kullanılacaktır.

Mikroenjeksiyon için, lamelin merkezine yakın konumda yapışmış hücrelerin seçilmesi ve çevreye yakın olanlardan kaçınılması önemlidir. Bu durum, hedef hücrelerinizin daha sonra elektron mikroskobunda kullanılacak epon reçine merkez parçasına verimli bir şekilde aktarılmasını sağlamak açısından kritiktir. Enjeksiyon kolunu manuel olarak lamelin üzerine indirin ve mikro manipülatörü kullanarak, iğnenin ucu hücrelerin yüzeyine hafifçe değene kadar aşağı indirin. Seçilen ızgara içindeki her iki hücreden birine mikroenjeksiyon yapın; yaklaşık %50 konfluensle büyütülmüş hücreler için 600 square micrometer boyutundaki ızgara başına yaklaşık 80 hücre beklenir, bu da yaklaşık 30 ila 40 deneysel ve kontrol hücresinden oluşan bir N sayısı sağlayacaktır.

Enjeksiyondan sonra, floresan mikroskobisi gerçekleştirmek için kabı istenen süre boyunca tekrar inkübatöre yerleştirin. Büyütme ortamını dökün ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içindeki formaldehit ile sabitleyin. Sabitleyiciyi bir kez XPBS ile değiştirin.

Ardından, seçilen ızgaranın düşük ve yüksek büyütmede beş ila 10 adet aydınlık alan görüntüsünü alarak hücrelerin düzenini belgeleyin. Mikroenjeksiyon yapılmış hücreleri tanımlamak için, inert enjeksiyon boyasının eksitasyon ve emisyon dalga boylarında floresan görüntüler alın. Bir konfokal mikroskop kullanarak, daha önce görüntülenen aynı ızgara içindeki mikroenjeksiyon yapılmış hücrelerin yüksek büyütmede bir görüntü yığını (Z-stack) toplayın.

Floresan görüntülerin, elektron mikroskobu kullanılarak tanımlanacak olan hücre altı yapılarla ilişkilendirilebilmesi için yüksek büyütme gereklidir. Konfokal görüntüleme işleminden sonra, lamel kaldırıcı bir sıvı kullanarak lameli kap diyerek ayırın ve lameli, hücreli yüzeyi yukarı gelecek şekilde bir adet XPBS içeren taze bir kültür kabına yerleştirin. Elektron mikroskobu işlemine geçiniz.

Standart EM protokollerini takip edin. Örnekleri sabitlemek, boyamak veledehidrate etmek için epon reçinesi hazırlayın ve lameli, hücre tarafı aşağı gelecek şekilde epon reçinesiyle dolu bir tüpün üzerine yerleştirin. Reçinenin 60 °C'de 24 saat boyunca polimerize olmasını sağlayın.

Kapak lamını epoksi reçineden ayırmak için, lamı hızla sıvı azot içerisine daldırın. Bu işlem, 60 °C'den -196 °C'ye ani bir sıcaklık şoku yaratacaktır.

Laminer camı reçine tüpünden yerinden çıkarın. Beş ila 10 dakika bekleyin ve ardından laminer camdan arınmış olan tüpü geri alın. Bir diseksiyon mikroskobu altında, ilgilenilen ızgarayı belirlemek için reçinenin yüzeyini inceleyin.

Steril bir jilet veya skalpel kullanarak, epon bloğu yalnızca ilgilenilen ızgaranın bloğun tepesinde kalacağı şekilde tıraşlayın; tıraşlanmış bloktan ultra mikrotom ile seri kesitler alın. Standart protokolleri kullanarak, kesitleri kontrastlamak için uranil asetat ve kurşun sitrat kullanın. Daha önce çekilmiş yüksek çözünürlüklü floresan görüntülerini temel alarak, hücrelerin göreceli konumlandırmasını kılavuz olarak kullanıp istenen hücreleri elektron mikroskobunda yeniden bulun.

Elektron mikrografında, floresan sinyaline karşılık gelen ilgi bölgelerini belirleyin. Hangi floresan Zack görüntüsünün hangi EM kesitine karşılık geldiğini saptamak için heterokromatin konumu ve nükleer zar gibi referans noktalarını kullanın. Image J veya Adobe Photoshop gibi bir görüntüleme programı ile görüntüleme yaparken, floresan görüntünün opaklığını %50'ye düşürün ve ilgili TEM görüntüsünün üzerine yerleştirin.

Gösterilen ölçeği ayarlayarak görüntüleri hizalayın. Mikroenjeksiyon ve korelatif ışık ve elektron mikroskobisi sonuçları burada yer almaktadır. Bu görüntü, lazerle oyulmuş cam ızgaralı bir lam üzerinde büyüyen NRK hücrelerinin brightfield mikrografını göstermektedir.

Enjekte edilen hücreleri içeren ızgarayı tanımlamak için kullanılan b ve m arka plan harflerine dikkat edin. Oklar, elektron mikroskobu ile tanımlanan ve görüntülenen iki hücreyi göstermektedir. Burada, mikroenjeksiyon yapılan hücreleri tanımlamak için kullanılan inert takip boyası cascade blue'nun floresan görüntüsü yer almaktadır.

Burada, amin etiketli küçük molekülün aydınık alan ve floresan sinyallerinin üst üste bindirilmiş görüntüsü yer almaktadır. Bu panel, enjekte edilmiş bir hücrenin aydınık alan, floresan ve elektron mikroskopi görüntülerinin korelasyonunu temsil etmektedir. Ok ucu, bu panelde daha yüksek büyütmede görüntülenen floresan puncta'ları göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, mikroenjeksiyon CLEM (korelatif ışık ve elektron mikroskopisi) prosedürünü kullanarak, ilgilenilen bir proteinin nasıl mikroenjekte edileceğini ve bu proteinin neden olduğu hücre altı morfolojik değişikliklerin nasıl takip edileceğini iyi bir şekilde anlamış olmalısınız.