Bir Aracı Olarak Korelatif Işık ve Elektron Mikroskobu (CLEM) microinjected Moleküller ve Ökaryotik Alt hücresel Hedefler Visualize'a

Aşağıdaki deneyin genel amacı, floresan olarak etiketlenmiş küçük molekülleri veya proteinleri kültürlenmiş bir memeli hücresinin sitoplazmasına sokmak ve mikrometreden multi nanometre çözünürlüğe kadar indüklenen morfolojik değişiklikleri gözlemlemektir. Bu, ilk olarak memeli hücrelerinin ızgaralı cam örtü kızakları üzerinde kültürlenmesi ve bunlara floresan olarak etiketlenmiş küçük bir molekül veya ilgilenilen protein ile mikro enjekte edilmesiyle elde edilir. Daha sonra, hücreler formaldehit içine sabitlenir ve floresan mikroskobu kullanılarak gözlemlenir ve görüntülenir.

Daha sonra hücreler glutaraldehit ile sabitlenir, kesitlere ayrılır, boyanır ve elektron mikroskobu kullanılarak görüntülenir. Son olarak, parlak alan floresan ve elektron mikroskobu sırasında çekilen görüntüler birleştirilir ve hizalanır. Sonuç olarak, bu görüntülerin korelasyonu, araştırmacının, ilgilenilen küçük molekül veya protein tarafından indüklenen yüksek çözünürlüklü bozulmaları görüntülemesine izin verir.

Merhaba, ben Dr.Evan Reddick, Dallas'taki Texas Üniversitesi Güneybatı Tıp Merkezi'ndeki mikrobiyoloji bölümünde Dr.Neil Alto'nun laboratuvarındayım. Bugün size M Clem prosedürü veya mikroenjeksiyon korelasyonlu ışık ve elektron mikroskobu hakkında konuşacağım. Bu prosedürün mikroenjeksiyon veya mikroskopi gibi bağımsız tekniklere göre ana avantajı, burada birlikte gerçekleştirilmeleri ve ızgaralı cam kapak kaymasının kullanımına yardımcı olmalarıdır.

Araştırmacıların protokolün farklı bölümlerinde aynı hücreye geri dönmelerini sağlayan bu ızgaralı kapak fişidir. Ek olarak, bu teknik araştırmacıya, çok çeşitli enjekte edilebilir küçük moleküllerden veya ilgilenilen proteinlerden hücre altı mimari değişiklikleri gözlemleme ve bunu mikrometreden çoklu nanometre çözünürlüğe kadar yapma yeteneği verir. Mikroenjeksiyon kültürüne hazırlanmak için, normal sıçan böbreği veya ölümsüzleştirilmiş rahim ağzı kanseri hücreleri gibi, fotoğrafla kazınmış cam ızgaralı kapak fişleri üzerine yapıştırılmış iki canlı hücre tabağı, hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe eder.

Kullanılacak deneysel zaman çizelgesine bağlı olarak, hücrelerin eş akıcılığını ayarlayın. Tamamen birleşik bir plaka, elektron mikroskobunda mikro enjekte edilen hücrelerin tanımlanmasını çok zorlaştıracaktır. Bu nedenle, tohum hücreleri gibi kısa bir deney gününde yaklaşık %50 co akıcılığına ve yaklaşık %25 co akıcılığına ulaşırlar.

Daha uzun bir deney gününde, floresan etiketli protein DNA'sını veya küçük molekülleri uygun tamponda 50 mikrolitrelik bir son hacme hazırlayın. Tercih edilen Fluor ofor'a bağlı olarak, Texas kırmızısı veya kaskad mavisi gibi bir izleme boyası ekleyin. Mililitre başına 0,5 ila bir miligram konsantrasyon ekleyin.

Çözeltiyi 0.22 mikronluk bir santrifüj filtreden süzün. Üreticinin yönergelerini kullanarak mikroenjeksiyon iğnelerini çektikten sonra, bir iğnenin arka ucuna mikrolitre çözelti için dikkatlice pipetleyin. İğneyi, ters çevrilmiş bir mikroskoba bağlı ticari bir mikroenjeksiyon cihazının mikro manipülatör koluna yükleyin.

Ters çevrilmiş mikroskobun tabak tutucusuna bir tabak kültürlenmiş hücre yerleştirin. Fotoğrafla kazınmış bir ızgara içinde büyüyen hücreleri bulun ve ızgaraların alfanümerik tanımlayıcısını not edin. Bu, sonraki tüm adımlarda kullanılacaktır.

Mikroenjeksiyon için örtü kaymasının merkezine yakın yapıştırılmış hücrelerin seçilmesi ve çevreye yakın olanlardan kaçınılması önemlidir. Bu, ilgilendiğiniz hücrelerin daha sonra elektron mikroskobu için kullanılacak olan epon reçinesi merkez parçasına verimli bir şekilde aktarılmasını sağlayacağı için önemlidir Manuel, enjeksiyon kolunu kapak kaymasının üzerine manuel olarak indirin ve uç hücrelerin yüzeyine hafifçe temas edene kadar iğneyi indirmek için mikro manipülatörü kullanın. Yaklaşık% 50 Co akıcılığında büyütülen hücreler için seçilen ızgaradaki diğer her hücreye mikro enjekte edin, 600 mikrometre kare ızgara başına yaklaşık 80 hücre bekleyin, bu da yaklaşık 30 ila 40 deneysel ve kontrollü hücreden oluşan bir N verecektir.

Enjekte ettikten sonra, floresan mikroskobu gerçekleştirmek için çanağı istenen süre boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Büyüme ortamını atın ve hücreleri 10 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS'de formaldehit ile sabitleyin. Sabitleyiciyi bir XPBS ile değiştirin.

Ardından, düşük ve yüksek büyütmede seçilen ızgaranın beş ila 10 parlak alan görüntüsünü çekerek hücrelerin düzenini belgeleyin. Mikro enjekte edilen hücreleri tanımlamak için, inert enjeksiyon boya gözünün uyarma ve emisyon dalga boylarında floresan görüntüler alın. Konfokal bir mikroskop kullanarak, daha önce görüntülenen aynı ızgara içinde yüksek büyütme oranında mikro enjekte edilen hücrelerin görüntülerinden oluşan bir Zack toplayın.

Floresan görüntüleri, elektron mikroskobu kullanılarak tanımlanacak hücre altı yapılarla ilişkilendirmek için yüksek büyütme gereklidir. Konfokal görüntülemeden sonra, kapak fişini tabaktan ayırmak için bir kapak kayma çıkarma sıvısı kullanın ve hücre tarafı yukarı bakacak şekilde bir XPBS içeren taze bir kültür kabına yerleştirin. Elektron mikroskobu için işlemeye devam edin.

Standart EM protokollerini takip ettikten sonra olun. Lekeyi sabitlemek ve numuneleri kurutmak için epon reçinesi hazırlayın ve kapak kayma hücresi aşağı bakacak şekilde eon reçine dolgulu bir tüpün üzerine yerleştirin. Reçinenin 24 saat boyunca 60 santigrat derecede polimerize olmasına izin verin.

Kapak kızağını epon reçinesinden çıkarmak için. Hızlı bir şekilde sıvı nitrojenin içine daldırın. 60 santigrat dereceden eksi 196 santigrat dereceye kadar sıcaklık şoku.

Kapak kızağını reçine borusundan çıkarır. Beş ila 10 dakika bekleyin, ardından artık kapak kaymasından arınmış olan tüpü alın. Bir diseksiyon kapsamı altında, ilgilenilen ızgarayı bulmak için reçinenin yüzeyini inceleyin.

Steril bir tıraş bıçağı veya neşter kullanarak, epon bloğunu, ultra mikrotonlu bir kesim ile bloğun tepesinde yalnızca ilgili ızgara olacak şekilde kesin, kesilen bloğun seri bölümleri, standart protokolleri kullanarak bölümleri kontrastlamak için pisuar asetat ve kurşun sitrat kullanın. Hücrelerin göreceli konumlarını kılavuz olarak kullanarak elektron mikroskobunda istenen hücrelerin yerini değiştirin. Daha önce yakalanan yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleri kullanarak.

Elektron mikrografında floresan sinyaline karşılık gelen ilgili bölgeleri belirleyin. Hangi floresan Zack görüntüsünün EM dilimine karşılık geldiğini belirlemek için hetero kromatinin konumu ve nükleer zarf gibi yer işaretlerini kullanın. Şu anda Image J veya Adobe Photoshop gibi bir görüntüleme programıyla görüntülenmekte olan floresan görüntünün opaklığını %50'ye düşürün ve ilgili TEM görüntüsünün üzerine yerleştirin.

Gösterilen ölçeği ayarlayarak görüntüleri hizalayın. İşte mikroenjeksiyon ve korelasyon ışık ve elektron mikroskobundan elde edilen sonuçlar. Bu görüntü, lazerle kazınmış cam ızgaralı bir kapak kayma üzerinde büyüyen NRK hücrelerinin parlak alan mikrografını göstermektedir.

Enjekte edilen hücreleri içeren ızgarayı tanımlamak için kullanılan b ve m arka plan harflerine dikkat edin. Oklar, elektron mikroskobu ile tanımlanan ve görüntülenen iki hücreyi gösterir. Burada, mikro enjekte edilen hücreleri tanımlamak için kullanılan inert izleme boyası kaskad mavisinin floresan bir görüntüsü gösterilmektedir.

İşte amin etiketli küçük molekülün parlak alan ve floresan sinyallerinin bir katmanı. Bu panel, enjekte edilen bir hücrenin parlak alan floresan ve elektron mikroskobunun korelasyonunu temsil eder. Ok ucu, bu panelde daha yüksek büyütme oranında görüntülenen floresan puncta'yı gösterir.

Bu videoyu izledikten sonra, ilgilenilen bir proteinin nasıl mikro enjekte edileceğini ve mikroenjeksiyon Clem veya korelasyon ışığı ve elektron mikroskobu prosedürünü kullanarak indüklediği hücre altı morfolojik değişikliklerini nasıl izleyeceğinizi iyi anlamalısınız.