Tarafından geliştirilmesi Fare İç Kulak için Gen Transferi In Vivo Elektroporasyon

Fare iç kulak olan gelişim programı gebelikte özenli bir taslakları kaynaklı duyu organıdır. Biz bir tanımlamak

Jane, in Vivo, elektroporasyon Ling Wang, Han Jang ve John Burgandy, Oregon İşitme Araştırma Merkezi, Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi ile Gelişmekte Olan Fare İç Kulağına transfer oldu. Benim adım John Burgandy. Laboratuvarım, Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi'ndeki Oregon İşitme Araştırma Merkezi'nde.

Benim adım Ang. Johns laboratuvarında bir posterim. Ben Ang ayrıca Johns laboratuvarında araştırma görevlisi olarak çalışıyorum.

Sunumumuz dört bölüme ayrılmıştır. Birincisi ventral laparotomidir. Sodyum kalemi, barbital bazlı anestezi, anestezinin yeterliliğinin nasıl test edileceği, kornea koruması, cerrahi alanın hazırlanması, dezenfeksiyon fare sağkalım cerrahisi veri sayfası, deri ve karın duvarı boyunca cerrahi süit ventral orta hat insizyonu ve uterus boynuzlarının dışsallaştırılmasını gösteriyoruz.

İkinci kısım transuterin mikroenjeksiyondur. Embriyonik gün 11.5 ve embriyonik gün 12.5'te embriyo, embriyo, yeniden oryantasyon, mikroenjeksiyon, pipet, fabrikasyon ve mikroenjeksiyonun Otis'e trans aydınlatmasını gösteriyoruz. Üçüncü kısım in vivo elektroporasyondur.

Kürek tarzı elektrot yerleşimini ve embriyonik gün 11.5 fare O yardımının elektroporasyonunu gösteriyoruz. Dördüncü bölüm temsili sonuçlardır. Geç embriyonik ve erken postnatal koklealarda GFP ekspresyonunu gösteriyoruz.

Bu, embriyonik gün 11.5 birinci kısım ventral laparotomide ekspresyon plazmidi ile Otis'in in vivo elektroporasyonundan kaynaklandı. Baraj, boynun, kuyruğun ve sol arka bacağın arkasındaki deriyi kavrayarak güvenli bir şekilde tutulur. Karın %70 etanol ile sürüntü alındıktan sonra intraperitoneal sodyum pentobarbital bazlı anestezik enjeksiyonu uygulanır.

Fare, anestezinin etki etmesine izin vermek için dört ila beş dakika boyunca ev kafesinin içine yerleştirilir. Anestezinin yeterliliğini değerlendirmek için ayak ve kuyruk tutamları kullanılır. Bu baraj, kuyruk sıkışmasına tepki olarak kapanır ve zararlı uyaranlara tepkisiz hale gelmeden önce iki dakikaya daha ihtiyaç duyar.

Korneaları kurumaya karşı korumak için gözlere steril oftalmik merhem uygulanır. Kürk ve kepeğin yayılmasını en aza indirmek için ameliyat bölgesini kimyasal bir çeker ocakta hazırlıyoruz. Kürk, karın duvarını kaplayan cildi ortaya çıkarmak için ince bir bıçakla traş edilir.

Kürkün tamamen çıkarılması, ameliyat sonrası kesiğin iyileşmesini kolaylaştırır. Karın derisinin dezenfeksiyonu,% 70 etanol Betadin ve% 70 etanolün alternatif geçişleri ile sağlanır. Her zaman rostraldan coddle'a kaydırın ve yeni bir cerrahi pamuk topu veya pamuk uçlu aplikatör kullanın.

Her geçiş için, barajın tepkisiz olduğundan emin olmak için dezenfeksiyon sırasında solunumun derinliğini ve kalitesini değerlendiriyoruz İkinci %70 etanol geçişinden sonra, lanet olası ventral yüzeyi hemen steril bir örtü üzerine yerleştirdik ve onu ısıtmak için iki ila üç dakika boyunca ısıtılmış bir ped üzerine koyduk. Bu, ameliyat öncesi verileri fare hayatta kalma cerrahisi kayıt sayfasına kaydetmek için uygun bir zamandır. Ek bilgi olarak fare hayatta kalma cerrahisi veri sayfamızı ekte sunuyoruz.

Kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitenizin ameliyat öncesi ve ameliyat sonrası verileri nasıl izleyeceğinizi görebilmesi için veri sayfasını ve hayvan bakım protokolünüzü dahil etmeyi düşünün. Her cerrahi konu için bir kayıt sayfası dolduruyoruz. Ameliyatı steril bir ortamda yapmayı tercih ediyoruz, ancak bu genellikle kemirgenler için gerekli değildir.

Çalışma yüzeyi, fan motorundan ve plenum muhafazasından ayrıdır, bu nedenle kullanıcıya herhangi bir titreşim iletilmez. Mikroenjeksiyon sırasında, utero gen transferini kolaylaştırmak için laminer akış başlığımızda yaptığımız değişikliklerin bir şemasını ek bilgi olarak ekledik, temel değişiklikler düşük wat zorluğu ve ray aydınlatma kesikleri ve cihaz güç kabloları için gizli prizler ve aksesuar elektrik devreleri için bir yönlendirme yoludur. Cerrahi süit, elektrikli emzirme zilleri IV torbası, ılık banyo, XY, Z manipülatörü, stereo floresan, diseksiyon mikroskobu, fiber optik ışık kaynağı ve cerrahi aletlerden oluşur.

Mikro enjektörü tetiklemek için ayak pedalları kullanılır, elektro perter odağa girer. Kapsam cerrahi aletler bir otoklavda sterilize edilir. Aletler, bir cam boncuk sterilizatörü kullanılarak veya iğne sürücüsünün yeniden otoklavlanmasıyla fareler arasında yeniden sterilize edilmelidir.

Balli, makas, halka forseps ve vasküler forseps temel araçlardır. Ventral orta hat kesisi, cildi vasküler forseps ile kavrayın ve bilyeli uçlu makasla bütünlüğü çıkarın, insizyonu 10 ila 14 Milimetre uzatın. Linea alba adı verilen bağlı dokunun beyaz avasküler bandını tanımlayın ve karnın ventral orta hattını bilyeli uçlu makasla lineer alba'yı kesin.

Bağırsakları veya kasık yağ yastıkçıklarını çentiklememeye dikkat edin. Karnı hemen steril Prewarm emzirilmiş zil çözeltisi ile sulayın. Derideki ve karın duvarındaki kesi yerlerini kanama açısından değerlendirin.

Künt forseps ile direkt basınç, varsa küçük kanamaları durduracak, sağ ve sol uterus boynuzlarını halka uçlu forseps ile dışsallaştıracaktır. Forcep'in halkalı bir ucuyla sağ uterus boynuzunu nazikçe yakalayın ve uterusu orta hat insizyonuna doğru çekin. Uterusun takılmasını kolaylaştırmak için barajın yan tarafını nazikçe manipüle etmek için serbest elinizi kullanın.

Forseps asla rahmi sıkıştırmak ve dışarı çekmek için kullanılmaz. Bu, rahim damar sistemine veya embriyolara zarar verebileceğinden, sol rahim boynuzu için dışsallaştırma prosedürünü tekrarlayın. Yeni dışsallaştırılmış uterus boynuzlarını önceden ısıtılmış emzirilmiş zil solüsyonu ile hemen sulayın: inal yağ yastıkçıklarını veya bağırsakları uterusla dışsallaştırmaları durumunda nazikçe yeniden yerleştirin.

Bu durumla çok sık karşılaşılmaz. İkinci bölüm: rahim mikro enjeksiyonu. Baraj, uzun çalışma mesafesi hedefinin altına yerleştirilir ve uterus duvarına yumuşak bir kablo fiber optik ışık yerleştirilir.

Rahim, serbest elin bir parmağıyla hafifçe bastırılır. Embriyonun oryantasyonunun tanımlanmasını kolaylaştırmak. Fiber optik kablodan gelen ışık, embriyo oryantasyonunu doğru bir şekilde değerlendirmek için gereken en düşük yoğunlukta olmalıdır.

Yoğun ışık, rahime ısı iletebilir ve bu da komplikasyonlara neden olabilir. Fiber optik ışığı ve uterusu bir elimizde tutuyoruz ve embriyoyu nazikçe palpasyonla yeniden konumlandırmak için serbest elimizde bir parmak kullanıyoruz. Aşağıdaki üç videoda mikroskopi ile EC klipleri ve uterus tarafından gözlemlenen yaygın embriyo yönelimlerini gösteriyoruz.

İzleyici, trans aydınlatma sırasında gördüğümüz mikroskobik görünümü görecektir, ancak uterusun siyah beyaz trans aydınlatması, embriyonun yöneliminin in vivo olarak tespit edilmesine izin verir. Bu örnekte, embriyo, ventral yüzeyi izleyiciye bakacak şekilde baş duruşu pozisyonundadır. Rahmi ileri geri hareket ettirerek sağ ve sol arka bacakları, kuyruğu ve sol göz sefalonunu tespit edebiliriz.

Bu örnekte, embriyo yine baş duruşu pozisyonundadır, ancak ön arka eksene göre yaklaşık 90 derece döndürülmüştür. Rahmi nazikçe ileri geri hareket ettirerek, sol arka uzuvu ve uzuv için sol uzvu tanımlayan kürek şekillerini görebiliriz. Arka beyin de belirgindir.

Embriyo, sol tarafı izleyiciye bakacak şekilde dik bir pozisyondadır. Yeni ortaya çıkan dördüncü ventrikül, arka beyinde parlak bir yama olarak tespit edilebilir. Sol göz sefalonu, sol dört ekstremite ve sol arka ekstremite de belirgindir.

Rahim üzerindeki hafif baskı, birincil baş damarın ana gövdesinin ve sırasıyla beyaz ve siyah yıldızlarla işaretlenmiş ön ve arka dallarının tespit edilmesini sağlamak için embriyoları hafifçe yeniden yönlendirir. Göreceğimiz gibi, Otis, birincil kafa damarının ön ve arka dalları arasında ortada yer alır. Otis'in kendisi transillüminasyon ile uterustan görülemez.

Birbirini izleyen iki video mikroskopi klibinde, embriyonun mikroenjeksiyon için Otis yardımına nasıl yeniden yönlendirileceğini gösteriyoruz. Amaç, otisin yanal kafadaki konumunun enterpolasyonuna izin veren embriyonik yer işaretlerini tanımlamaktır. Bu nedenle, amacımız embriyoyu dorsalden lateral pozisyona yeniden yönlendirmektir, böylece birincil baş damarını tanımlayabiliriz.

Mezensefalon, dördüncü ventrikül ve ekstremite için sol dorsal pozisyonda belirgindir. Rahim üzerindeki hafif baskı, embriyonun yönünü dorsalden daha sonraya kaydırır. Sol göz sefalonu, mezensefalon ve dördüncü ventrikül kolayca belirgindir.

Birincil baş damarı ve yıldız işaretiyle gösterilen arka dalı da belirgindir. Primer baş venin ön dalı net olarak tespit edilememiştir. Amacımız yine embriyoyu ana baş venini tanımlayabilecek şekilde yönlendirmek, ancak uterus mikroenjeksiyonu için uygun olan daha yüksek büyütme altında yapmaktır.

Rahim damarları, desidual bant ve sol göz bu lateral perspektifte görülür. Rahim üzerindeki hafif baskı embriyonun pozisyonunu değiştirir, böylece dördüncü ventrikül sol gözünü tespit edebiliriz. Birincil kafa damarı ve yıldızla işaretlenmiş arka dalı, birincil kafa damarı ve dalları Amerikan futbolunun dikmelerinin şeklini oluşturur.

Otik vezikül rahim içinden görülemez, ancak dikmelerin merkezinde bulunur. Lynn, bir embriyo için bir Enjeksiyon dizisi başlattı. Rahmi trans aydınlatır, embriyoyu mikro enjeksiyon için yeniden yönlendirir ve hızlı yeşil ile doldurulmuş mikro enjeksiyon pipetini sahaya getirir.

Mikro enjeksiyon pipeti, bir X, Y, z mikrom manipülatörü tarafından tutulan bir pipet tutucusuna bağlanır. Manipülatör manyetik standı, mikroenjeksiyon pipetinin zahmetsizce kaba bir şekilde konumlandırılmasına izin veren Teflon tabanlı çelik bir plakaya tutturulmuştur. İğne, manipülatör üzerindeki ileri mikrometre kontrol düğmesi kullanılarak uygun şekilde ilerletilir.

Fabrikasyon pipetler, erken Otis evresindeki fare embriyosuna travmatik bir mikroenjeksiyon için gereklidir. Yatay bir pipet çektirme ile kalın duvarlı borosil cam kılcal boru çekiyoruz. A'da gösterilen elde edilen pipet, B'deki ok ucu ile gösterilen yaklaşık 14 ila 16 mikron dış çap konumunda forseps ile manuel olarak kırılır.

Panel D'de görüldüğü gibi pipet ucunu keskinleştirmek için pipeti yaklaşık 20 derece eğim veriyoruz, mikroenjeksiyon pipetlerini çekmek ve eğim vermek için parametreler ekteki metinde verilmiştir. Sonraki iki video mikroskopi klibinde, embriyonik 11.5 ve 12.5. günlerde fare otik yardımına mikroenjeksiyon gösteriyoruz. Amacımız embriyonik gün olan 11.5 fare otiğine uterus mikroenjeksiyonunu göstermektir.

İlk olarak, doğru hedeflenmiş bir enjeksiyonun nasıl göründüğünü açık bir şekilde göstermek için uterus mevcut olmadan otikleri enjekte ediyoruz. Daha sonra otantik trans uterin mikro enjeksiyonu gösteriyoruz. Bu ilk enjeksiyon için, viseral kesenin ekstrüde etmesine izin vermek için uterus fally kesildi, viseral yolk kesesi üzerindeki desidual bant çıkarıldı.

Plasenta rahme bağlı kalır ve embriyo canlıdır. Rahim fokal olarak çıkarıldıktan sonra dördüncü ventrikülü, primer baş venini, ön ve arka dallarını, pipeti ve kistin yaklaşık yerini beyaz renkte görürüz. Bu enjeksiyon dizisinin başlangıcında, viseral yolk kesesi vaskülatüründe kan akışı tespit edilir.

Pipet, viseral yumurta sarısı kesesi boyunca ilerletilir ve dai, osis notasına, endo lenfatik kanala dorsal olarak ve otiklerin dikmelerin merkezindeki konumuna enjekte edilir. Otikler, birincil baş veninin ön ve arka dalları arasında, embriyonik güne uterus mikro enjeksiyonu ile orta yoldadır. 11.5 Fare otikleri, otik yardımın yerini tahmin etmek için birincil baş damarının ve dallarından en az birinin tespit edilmesini gerektirir.

Bu diyagramatik örnekteki hedefimiz, birincil baş damarının hem ön hem de arka dalları, beyazla işaretlenmiş OUC bölgesi ile tespit edilir. Embriyonun daha gerçekçi bir sunumu, birincil baş damarının ana gövdesinin sadece bir dalıyla birlikte tespit edildiği ve gösterilen örneğin yalnızca birincil baş damarının arka dalının görüldüğü bir sunumdur, ancak bu, otiklerin yerini yorumlamak için yeterlidir. PT uterustan ilerletilir ve otiklere boya enjekte edilir.

Boyanın amniyotik boşluktan temizlenmesi için 30 saniye bekleriz, bu noktada endo lenfatik kanalı dorsal olarak ve vestibülü görebiliriz. Anatomik perspektif sağlamak için kistini yeni enjekte ettiğimiz embriyonun düşük büyütmeli bir görüntüsü ile sonlandırıyoruz Bu görünümde dördüncü ventrikül sol göz ve rahim damar sistemi görülüyor. Embriyonik gün 12 fare otik kistine trans ve mikroenjeksiyon ve arka beynin yeni oluşan dördüncü ventrikülüne mikroenjeksiyon gösteriliyor.

Transillüminasyon, bu sol lateral görünümde gözün yanı sıra birincil baş damarını da tespit etmemizi sağlar. Pipet rahim içinden otik veziküle ilerletilir ve lümenini doldurmak için enjekte edilir. Dördüncü ventrikülü enjekte etmek için, arka beynin dorsal görünümü için embriyoyu 90 derece döndürüyoruz.

Enjekte edilen sol kist artık sol taraftadır. Pipet rahim boyunca ilerletilir ve hızlı yeşil lor ile karıştırılır. Konjuge dekstran dördüncü ventriküle enjekte edilir.

Enjekte edilen boya hacminin in vivo olarak orta beyne girmediğine dikkat edin. Dördüncü ventrikülde dekstran lokalizasyonunu doğrulamak için enjeksiyondan sonra floresan değerlendirilir. Embriyo daha sonra dorsalden lateral pozisyona yeniden yönlendirilir.

Endo lenfatik kanal, bu yanal görünümde dördüncü ventrikülün sadece ventralidir. İn vivo floresan, dördüncü ventriküldeki dekstranın lokalizasyonunu doğrular. Doğumda, bir epi floresan kullanarak dördüncü ventrikülde yeşil floresan için yavruları tararız.

Arka beyinlerinde yeşil floresan bulunan diseksiyon mikroskobu yavruları, embriyogenez üçüncü bölüm in vivo elektroporasyon sırasında manipüle edilen bir iç kulağa sahiptir. Kist ekspresyon plazmidi ile doldurulduktan sonra, uterus önceden ısıtılmış laktasyonlu ringer solüsyonu ile taze olarak sulanır. Transillüminasyon, ODU kistinin elektrot alanında merkezlenmesini kolaylaştırır.

Fiber optik ışığın metal kafası rahim yüzeyinden geri çekilir. Kare dalga darbe trenini başlatmadan önce, bir sonraki video mikroskopi klibinde in vivo olarak tam bir elektroporasyon döngüsü gösteriyoruz. Embriyonik günün elektroporasyonu, 11.5 fare otik kisti, kürek tarzı elektrotların uterusa nazikçe yerleştirilmesini gerektirir.

Bu örnekte, sol otik kist ekspresyon plazmidi ile doldurulmuş ve uterus laktasyonlu halkalarla taze sulanmıştır. Katot, dolu otik kiste göre lateral olarak konumlandırılır ve ve ode, asyon sekansının başlangıcında medial olarak konumlandırılır, otik kist, kürek alanında ortalanır. Rahim nazikçe sıkıştırılır ve kare dalga nabız treni bir ayak pedalı anahtarı ile başlatılır.

İdeal olarak, darbe başına 60 ila yüz miliamper akım verilir. Rahim daha sonra serbest bırakılır ve hemen sulanır. Yeni sulanan uterus, halka forseps ile hafif bir baskı ile karın boşluğuna geri döndürülür.

Rahim içselleştirildikten sonra, karın boşluğu yaklaşık dört mil laktasyonlu zil sesi ile yıkanır, karın ameliyatından hemen sonra normalden daha az su içecek olan barajın hidrasyonunu korumaya yardımcı olmak için karın boşluğunda yaklaşık bir mil laktasyonlu zil sesi bırakır. Karın duvarı ve daha sonra cilt, bir iğne ucu kullanılarak emilebilir sütür ile kapatılır. İğne sürücümüz, kapatmayı basitleştiren yerleşik bir makasa sahiptir.

Hem karın duvarı hem de cilt için koşu dikişi tercih ediyoruz. Kesi yerinde ek destek sağlamak için diğer her dikişi kilitliyoruz. Barajı kurtarma kafesine yerleştirmeden önce deri altına steroid olmayan bir antienflamatuar ilaç uyguluyoruz.

Kurumsal hayvan bakım ve kullanım komiteniz tarafından hangi profilaktik analjeziklerin tercih edildiği konusunda veteriner personelinize danışın. Baraj steril bir örtü içine yerleştirilmiştir ve ısıtılmış geri kazanım kafesinin zeminine yerleştirilmiştir. Kurtarma kafesi, yuvalama malzemesi, kapak için kırmızı bir tüp, laboratuvar yemeği ve bir su şişesi içerir.

Kafes, ameliyattan sonraki sabah üstüne bir Filtre başlığı ile yeniden monte edilir. Baraj güzel bir şekilde bakımlı, yürüyor ve açık kafes üstü hakkında bilgi almak için arka bacakları üzerinde dengede durabiliyor. Karın içindeki dikiş hattı temiz, kurudur ve ayrılma, kızarıklık veya şişlik belirtisi göstermez.

Rahim gen transferi için hayvan bakım protokolü geliştirmeyi tartışan bir belge ekledik. Belge, hayvan bakım ve kullanım komitenize danışarak kuruma özel bir protokol tasarlarken faydalı olabilecek bir dil içermektedir. Dördüncü bölüm, temsili sonuçlar.

Temsili sonuçlar panelleri A ve B, Otis'e embriyonik 11.5. günde gelişmiş bir yeşil floresan protein ekspresyon plazmidi ve ardından elektro enjekte edilen doğum sonrası altıncı gün yavrusundan temsili bir koklea göstermektedir. Koklear lateral duvar orta dönem ve apeksten çıkarıldı. Kokleanın tabanından orta dönemine kadar sadece GFP ekspresyonu mevcuttur ve panel B'de gösterilen tüy hücresi işaretleyicisi miyozin yedi A'nın dağılımını takip eder.

18.5 Bir miyozin ile boyanmış corde immünosunun fare organı, yedi A antikoru transfekte edilmiş hücreler, corde organı boyunca dağıtılır. Panel D, embriyonik günün yüksek büyütmeli konfokal projeksiyonunu göstermektedir. 18.5 Corde'un fare organı Cin ile boyanmış. Yedi.

İç ve dış saç hücrelerinde, interfalangeal hücrelerde, sütun hücrelerinde ve TER hücrelerinde bir GFP ekspresyonu tespit edilir. Embriyonik gün 11.5'te Otis'e elektroporasyon aracılı gen transferi Corde organı içindeki tüm bileşen hücre tiplerine yol açan transfect progenitörleri.