Name: Tarafından geliştirilmesi Fare İç Kulak için Gen Transferi In Vivo Elektroporasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 2 s
Description: Öğrenin fare iç kulağında gelişim biyolojisi ve işitme araştırmaları için in utero gen transferi yöntemini. Laparotomi, mikroenjeksiyon ve elektroporasyon teknikleriyle gen fonksiyonlarını canlı ortamda çalışın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz aslında başvuru 11 sayfa 130 çıktı mikroenjeksiyon pipeti üretim rakamı yayınlamak için izin Humana Basın teşekkür ederim; videografisi için Larry Dlugas ve Steven Wong, Eğitim İletişim OHSU Bölümü, video tasarım ve düzenleme için Larry Dlugas; Adam M. Ç &#39;Quinn, Kıdemli Tasarımcısı, teknik şematik sağlamak için özel yatay laminer akış kaput ve Les Goldsmith tasarımı için Trion / Envirco; Victor Monterroso, OG, Yüksek Lisans, Doktora ve Tom Chatkupt, DVM, Karşılaştırmalı Tıp OHSU Bölümü, rehberlik için bizim ile hayvan bakım protokolü, cerrahi teknikler ve profilaktik analjezi rejimi; Marcel Perret-Gentil, DVM, MS, veteriner dikiş teknikleri üzerine sadaka paylaşmak için; bizim Adobe Premiere Pro video mikroskopi bilgisayar iş istasyonu tasarımı için Edward Porsov, MS, ve Leah Beyaz ve LNS Jonas Hinckley (Portland, OR) Captioning. Bu çalışma Sağırlık ve Othe Ulusal Enstitüsü bağışları ile desteklenmiştirr İletişim Bozuklukları: DC R01 008.595 ve DC R01 008.595-04S2 (JB) ve P30 DC005983 (Oregon İşitme Araştırma Merkezi Çekirdek Grant, Peter Gillespie, Proje Yürütücüsü).

1. Ventral Laparotomi <ol><li> Sodyum pentobarbital anestezik solüsyonu (gram vücut ağırlığı başına 7.5 uL) intraperitoneal enjeksiyonu ile; olan embriyoların embriyonik günde 11.5 (vajinal fiş algılandığında gün öğleden embriyonik gelişimin günlük 0.5 E11.5) altındadır baraj uyutmak. Anestezik solüsyonu Çalışma; mutlak etanol, 100 uL, 65 mg / mL sulu magnezyum sülfat (uterin tonu modüle) arasında 320 uL, 50 mg / mL sodyum pentobarbital çözeltisinin 180 uL ve propilen glikol 400 uL (sahip araç karışabilir sulu ve organik bileşenleri). </li><li> Ağrılı uyaranlara testleri yapılarak anestezi bütünlüğü değerlendirin: pençe sıkmak; kuyruk tutam, yanak ve burun kılı dokunma ve göz kırpma yanıtı. Kornealara steril oftalmik merhem uygulayın. </li><li> Suprapubik bölgeden makası ile göğüs kafesi ve ince bir bıçak (Oster # 40 bıçak) için karın kürk Tıraş. % 70 etanol ile karın,% 10 povidon iyot (Betadine), bir dezenfektend% 70 etanol, sırayla. Yer steril bir örtü üzerine fare karın tarafı aşağı ve sonra 2-5 dakika için bir ısıtma yastığı veya sıcak plaka (37 ° C) ayarlanır. </li><li> Top uçlu makasla ventral orta hat karın cildi sarın. 10-14 mm kesi uzatın. Linea alba, karın duvarının ventral orta hat boyunca bir avasküler, beyaz bağ dokusu bandı tanımlayın. Top uçlu makas ile linea alba kesilirken ve kesi 10-14 mm uzatmak. Hemen önceden ısıtılmış (37 ° C) Laktatlı Ringer solüsyonu ile karın sulanması. </li><li> Implantasyon sitelerde aşırı basınç uygulamadan halka forseps ile rahmin iki boynuzu yansıtmak. Ön ısıtması, Laktatlı Ringer solüsyonu ile dış kaynaklardan laparotomi sulayın. </li></ol> 2. Transuterine Mikroenjeksiyon <ol><li> 12-16 μ: aşağıdaki özelliklere sahip bir kalın duvarlı, borosilikat cam kapiller mikroenjeksiyon pipeti fabricatem dış çapı ve 20 derece eğimli. ; Basıncı = 200; hız = 46;; = 0 çekin zamanı = 100) ısı = rampa testi artı 3 ünite: küçük kutu filamanlı bir Sutter P-97 pipet çektirmenin, aşağıdaki programı kullanın. Sutter BV-10 beveler ile, geniş çaplı pipetler için 104C (altın) aşındırıcı disk kullanın. Kalsiyum fosfat 3-4 mikrogram / uL de plazmid Pastör pipetiyle ifade (pH 7,2-7,4) tamponlu tuz. 30 saniye boyunca yavaşça konsantre DNA, vortex ile kristal hızlı yeşil ekleyin ve 10 saniye boyunca 10.000 g dönerler. Görsel enjeksiyonunun etkinliğini izlemek için gerekli hızlı yeşil minimum tutar ampirik olarak belirlenir. DNA / hızlı yeşil çözümü ile eğimli pipet dolgu. Basınçlı enjektör (Picospritzer kaynak gazı olarak&gt;% 99 saf azot kullanarak) pipet sahibine yüklü mikroenjeksiyon pipeti bağlayın. </li><li> Düşük yoğunluklu, kendi implantasyon site içinde embriyo görselleştirmek için halojen ışık ile rahim Transillüminasyonda. Bea tanımlayınting kalp, beyin veziküller, bacak tomurcukları, arka beyin arasında doğmakta olan 4. ventrikül ve göz. Ön ısıtması ile her 2 dakika, hidrasyon korumak için Ringer çözeltisi laktatlı rahim sulayın. Embriyo yönlendirme ve anatomik yukarıda belirtildiği tanımlamak için rahim üzerinde hafif basınç uygulayın. </li><li> Orient embriyo anterior ve posterior dalları kanadını otocyst bulunduğu mezenkimal toprakları birincil baş damarı tespit etmek. Uygun otocyst rahim transillüminasyon tarafından görülemez. Otocyst damarın ana gövde ile birlikte, bir Amerikan futbol sahası üzerinde dikey veya goalposts şekli oluşturan, primer baş venin anterior ve posterior dalları arasındaki ortasında bulunur. Otocyst sabitlenmesini ortasındadır. </li><li> Otocyst ve olası konumu ile uyumlu bir yörünge içinde rahim yoluyla enjeksiyon pipeti yerleştirin. Uter geçtikten sonra bir kez mikroenjektör darbeliBizim izleyici boya ve pipet yaklaşık konumunu görselleştirmek için. Mikrometre kontrol altında pipet Advance ve derinlik değerlendirmek için tekrar darbe. Ayrıca sürekli yanal baş mezenşim ve nabız içine pipet ilerlemek. Başarılı otocyst hedefleme dorsale endolenfatik kanal ve tarak Vestibül kabuk şekli konik şekli ortaya çıkaracaktır. Rahim üzerinde baskı bırakın, tek hareketle embriyo / uterustan pipet çıkarın ve hemen ısıtması ile rahim sulanması, Ringer çözeltisi laktatlı. </li></ol> 3. Vivo olarak Elektroporasyon <ol><li> Laktatlı Ringer solüsyonu ile rahim sulayın. Taze uygulanmış laktatlı Ringer çözeltisi elektriksel çift kürek tarzı elektrotlara rahim gereklidir. Laktatlı Ringer ile elektrot tungsten yüzeyleri nemlendirin. Elektrotlar yolunda Merkezi enjekte otocyst. Yavaşça elektroporasyon pa rahim sıkıştırmakddles. Katod enjekte otocyst ve anot uninjected otocyst bitişik uterus duvarı ile temas halinde olduğu lateral uterus duvar ile temas halindedir. Elektroporatörün üzerine ayak pedalı anahtarı ile bir kare dalga darbe tetikler. Elektroporasyon parametreler şunlardır: puls başına 43 volt ve 950 msn interpulse gecikme az 5, 50 ms darbe. Puls teslim hemen sonra rahim sulanması. 60-100 mAmps Otik epitel ataları transferinde yeterlidir: doku teslim mevcut kaydedin. Enjekte edilir ve baraj başına 4-6, E11.5 embriyolar electroporate. </li><li> Olan iç kulaklarında olan bu embriyoların 4. ventriküle sulu floresan dekstran (Alexa Fluor 488 plazmid ifade bir yeşil floresan proteini kodlayan eğer plazmid ifade bir kırmızı floresan proteini veya Alex Fluor 594 kodlar varsa) ikinci bir bağımsız transuterine mikroenjeksiyon gerçekleştirin doğru enjekte edilir ve puls başına akımının en az 60 mAmps de olduelektroporasyon sırasında yürekli. Floresan dekstran ardbeyin doğumda tespit edilebilir ve iç kulak (3.5) embriyogenez sırasında manipüle edildi yavrularının seçimi sağlayacaktır. </li><li> Laktatlı Ringer ile laparotomi sulayın. Karın boşluğuna laparotomi yeniden takın. Ön ısıtması, Laktatlı Ringer çözeltisi 2-4 ml ile rahim boşluğuna boşaltır ve taşma steril örtüyü üzerine kesi dışarı akmasını sağlar. Kuru, steril malzeme ile dökümlülüğü değiştirin. Olmayan bir kesici iğne ve bir 6-0 emilebilir sütür ile karın duvarı dikin. Biz karın duvarı hem de deri için, her dikiş kilitleme, çalışan bir dikiş tercih. </li><li> Barajlar &#39;kürk kurulayın ve deri altı enjeksiyon yoluyla bir non-steroid anti-inflamatuar gibi Meloksikam gibi yönetmek. Steril bir örtü üzerinde önceden ısıtılmış kurtarma kafesine baraj dönün. Monitör ve kanlı akıntı için barajlar &#39;solunumda, yara yeri açıklığı ve vajina kaydedin. Kanama ra olduğunuyeniden ama mevcut ve hız kesmeden eğer o anestezi altında iken, baraj euthanize. O bilinç ve ambulasyon girişimleri kavuşur zaman unutmayın. O yeme ve içme belirtileri gösterir ve yuva inşa etmeye başlamıştır fare koloniye baraj dönün. Genellikle, bu 12 saat içinde gerçekleşir. </li><li> Doğumda (postnatal gün 0), flaş bir GFP veya Texas Red filtresi ile stereofluorescence mikroskop kullanarak floresan dekstran algılamak için çöp her yavru ile arka beyin bölgesi uygun şekilde ayarlayın. Sadece emziren baraj ardbeyin etiketleme gösterilecek bu yavrulardan dönün. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/3653/3653fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1.. Gelişmekte cochlea&#39;ya Elektroporasyon aracılı gen transferi. E11.5 otocyst (darbe tra bir ifade plazmid kodlama gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) ve electroporated ile enjekte edildiparametreler: Beş, 50 msn / nabız ve 950 msn interpulse gecikme) az 43 volt bakliyat. Otocyst koklea ortasında açmak yoluyla tabanından EGFP ifade gösteren E11.5 enjekte edildi ve electroporated yavru postnatal günde 6 (P6) A) bir temsilci iç kulak. Koklea lateral duvarında orta dönüş ve apeks sadece çıkarıldı. Apeks doğuran E11.5 ataları transfekte değildi. B) koklea İmmünoboyama Tüm mount (A) saç hücre belirteci ile, miyozin 7a (Myo7a), bu EGFP ifade Corti organı yörüngesini takip eder ve fena halde saç hücresi taşıyan duyusal epitel yerleştiğini gösterir. Otocyst E11.5 enjekte edildi ve electroporated bir E18.5 embriyo C) bir temsilci iç kulak. Lazer konfokal projeksiyon Myo7a pozitif duyusal kıl hücrelerinin EGFP ifade gösterir. EGFP expressio belirten Corti E18.5 organ koklear duyu epiteli D) Lazer konfokal projeksiyonn iç saç hücrelerinde (IHC), dıştaki saç hücreleri (OHC), iç falankslarında hücreleri (IPC), ayak hücreleri (PC), ve Deiters &#39;hücreleri (dc). (B) &#39;de ölçekli çubuğu (A) için de geçerlidir.

<ol><li>Gillespie, P. G., Muller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+by+hair+cells%3A+models%2C+molecules%2C+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms.</a> Cell. 139, 33-44 (2009).</li>
<li>Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+and+morphogenesis+of+the+vertebrate+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear.</a> Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).</li>
<li>Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell+fate+in+the+sensory+epithelia+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).</li>
<li>Ohyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+is+necessary+for+patterning+the+sensory+and+nonsensory+regions+of+the+developing+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea.</a> J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).</li>
<li>Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+is+required+for+the+generation+of+hair+cells+and+supporting+cells+in+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).</li>
<li>Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+auditory+hair+cells+produced+in+the+mammalian+cochlea+by+in+utero+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer.</a> Nature. 455, 537-541 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%22">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals</a>. , 8th edn, The National Academy Press. (2010).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).</li>
<li>Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+electroporation+theories%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Biol.+Eng.+Comput%22%5BJournal%5D)">Membrane electroporation theories: a review.</a> Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li>
<li>Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-mediated+gene+transfer+to+the+developing+mouse+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear.</a> Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).</li>
<li>Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+mouse+inner+ear+and+origin+of+its+sensory+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs.</a> J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).</li>
<li>Sher, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+and+postnatal+development+of+the+inner+ear+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse.</a> Acta. Otolaryngol. , Suppl 285. 1-77 (1971).</li>
<li>Sheffield, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vector+tropism+for+supporting+cells+in+the+developing+murine+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea.</a> Hear Res. 277, 28-36 (2011).</li>
<li>Bedrosian, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+delivery+of+recombinant+viruses+to+the+fetal+murine+cochlea%3A+transduction+characteristics+and+long-term+effects+on+auditory+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function.</a> Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).</li>
<li>Reisinger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+functional+equivalence+of+otoferlin+and+synaptotagmin+1+in+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis.</a> J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).</li>
<li>Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Gateway+to+MultiSite+Gateway+in+one+recombination+event%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event.</a> BMC Mol. Biol. 7, 46(2006).</li>
<li>Perret-Gentil, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerret-Gentil%2C+M+%22Principles+of+Veterinary+Suturing%22">Principles of Veterinary Suturing</a>. , The University of Texas at San Antonio. Forthcoming.</li>
<li>Oesterle, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOesterle%2C+A+%22P-1000+%26+P-97+Pipette+Cookbook%22">P-1000 & P-97 Pipette Cookbook</a>. , Sutter. (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Gelişmekte olan fare iç kulağa gen transferi: Fare iç kulak postimplantation gelişim 12,13 ilk haftasında kulak taslakları gelişir. Embriyonik günde 9.5 (E9.5) tarafından, taslakları invajine ve otocyst 2 adı verilen bir sıvı dolu vesikül dönüştü. Vezikül içinde kulak öncüleri olgun iç kulak içinde duyusal ve duyunun hücreleri gibi vestibüler ve işitsel epitelde mekanik hassas kıl hücreleri innerve nöronlar doğurur. Geç evrelerinde olarak, iç kulak membranöz labirent karmaşık, 3 bo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Mikro Sterilizasyon Kutusu </td><td> ROBOZ </td><td> RS-9900a </td><td> 8X8.5X1.25 inç </td></tr><tr><td> Bilye uçlu makas </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 14109-09 </td><td></td></tr><tr><td> Halka forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11106-09 </td><td> 4.8mm ID/6mm OD </td></tr><tr><td> Adson Doku Forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11027-12 </td><td></td></tr><tr><td> İğne sürücüsü </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 12502-12 </td><td></td></tr><tr><td> Alerji Şırınga Tepsi </td><td> Becton Dickison </td><td> 305536 </td><td></td></tr><tr><td> Sütür 6-0 </td><td> Syneture </td><td> GL-889 </td><td> 0.7 metrik gastrointestinal sütür </td></tr><tr><td> Ringer USP </td><td> Baxter </td><td> 2B2323 </td><td></td></tr><tr><td> Hızlı yeşil </td><td> Sigma Aldrich </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikat cam kılcal </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 30-0053 </td><td></td></tr><tr><td> Nembutal Sodyum Çözüm </td><td> OVATION Pharmaceuticals Inc </td><td> NDC 67386-501-52 </td><td></td></tr><tr><td> MgSO4.7H2O </td><td> Fisher Scientific </td><td> M63-500 </td><td></td></tr><tr><td> Propilen glikol </td><td> Fisher Scientific </td><td> P355-1 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> E7023-500 </td><td></td></tr><tr><td> Meloksikam </td><td> Boehringer Ingeheim </td><td> ADA 141-219 </td><td></td></tr><tr><td> Mikropipet Çektirme </td><td> Sutter Aletleri </td><td> P-97 </td><td> FB255B kutusu filament; Sutter araçlardan Pipet Yemek danışın </td></tr><tr><td> Mikroelektrod Beveler </td><td> Sutter Aletleri </td><td> BV-10 </td><td> Büyük pipetler için 104C beveling diski; teorisi beveling için kullanım kılavuzuna başvurun </td></tr><tr><td> Mikropipet tutucu </td><td> Warner Aletleri </td><td> MP-S15T </td><td> Picospritzer tüp için 1,5 mm dış çaplı, pipet ve kadın basınç portu için. </td></tr><tr><td> Cımbız tarzı elektrot </td><td> Protech International Inc </td><td> CUY650P5 </td><td> 5 mm dış çapı </td></tr><tr><td> Kare Dalga Elektroporatör </td><td> Protech International Inc </td><td> CUY21EDIT </td><td> Footpedal önerilen </td></tr><tr><td> PICOSPRITZER III </td><td> Parker Hannifin </td><td> 051-0500-900 </td><td> Footpedal önerilen </td></tr><tr><td> Manuel Kontrol Mikromanipülatör </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 640056 </td><td></td></tr><tr><td> Yatay laminer akış temiz tezgah </td><td> Envirco </td><td></td><td> LF 630-10.554 için özel modifikasyonlar. Kaput şematik için ek bilgilere bakın. </td></tr><tr><td> Leica stereofluorescence Lumencor SOLA Hafif bir motor ile mikroskobuyla diseksiyon </td><td> Bartels ve Stout ve Lumencor </td><td> Lumencor SOLA Hafif bir motor ile MZ10F </td><td> MZ10F odaklanmak ve SOLA ışık motor tetiklemek için Footpedals tavsiye edilir </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 Dextran </td><td> Invitrogen </td><td> D22913 </td><td> 10mg/ml, sulu </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Dextran </td><td> Invitrogen </td><td> D22910 </td><td> 10mg/ml, sulu </td></tr><tr><td> Enviro-dri </td><td> Çoban Özel Papers </td><td></td><td> <a href="http://www.ssponline.com" target="_blank">www.ssponline.com</a> </td></tr></tbody></table>

tarafından geliştirilmesi fare İç kulak için gen transferi<em&gt; in vivo</em&gt; elektroporasyon

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

; Kesecik ve kesecik içinde makulaları ve kıvrılmış kokleadaki Corti organı semisirküler kanalların ampullae 3 krista: memelilerin iç kulağının 6 farklı duyusal epitel vardır. Krista ve makulaları Corti organı işitsel saç hücreleri 1 işitme için birincil dönüştürücüler ise mekanik uyarıcılar, denge, özel anlamda hizmet etmek için transdüksiyonu vestibüler saç hücreleri içerir. Semisirküler kanallar ve koklea bu duyusal epitel ve morfonogenezi Hücre kaderi şartname fare gebeliğin ikinci haftasında gerçekleşecek ve büyük ölçüde doğumdan 2,3 önce tamamlanır. Fare iç kulak gelişim çalışmaları rutin hücresel ve / veya morfolojik fenotipleri 4,5 moleküler temelini anlamak için farklı embriyonik ya da doğum sonrası aşamalarında transgenik embriyolar hasat tarafından yürütülmektedir. Biz utero gelişmekte fare iç kulak veren gen transferi hipotez &lt;/ Em&gt; kazanç ve kayıp fonksiyon-çalışmaları bağlamında memelilerin iç kulağının gelişimi 6 altında yatan genetik mekanizmalar sorgulama için geleneksel fare transgenesis için ücretsiz bir yaklaşımı temsil ediyor. Ventral laparatomi) 1, 2) transuterine mikroenjeksiyon; ve in vivo elektroporasyon 3): Gelişmekte olan fare iç kulağa gen misexpression çalışmalar yapmak, deneysel paradigma burada gösterdiği üç genel adım içine giderir. Ventral laparotomi implante embriyo 7 deneysel erişmek için rahim dışsallaştırılmasını izin veren bir fare hayatta bir cerrahi tekniktir. Transuterine mikroenjeksiyon otik vezikül veya otocyst lümenine plazmid ifade tanıtmak Eğimli, cam kılcal mikropipetler kullanılmasıdır. Vivo elektroporasyon progenitör hücreler 8-10 içine plazmid ifade sürmek için kare dalga, akım darbeleri uygulamasıdır. 11 her adımla ilgili ayrıntılı notlar yer. Fare deneysel embriyolojik teknikleri nesir öğrenmek ve hareketsiz görüntüleri tek başına zor olabilir. Bu çalışmada, biz gen transferi prosedürü 3 adım göstermektedir. En önemlisi, biz nasıl tam olarak göstermek için dijital video mikroskopi dağıtmak: 1) anne karnında embriyo yönünü belirlemek; 2) otocyst için enjeksiyon hedefleme için embriyo edinenlerin; 3) embriyonik gün 11.5 olarak otocyst içine izleyici boya solüsyonu ile karıştırılarak DNA microinject ve 12.5; doğumda doğum sonrası seçim için ve 5) etiket electroporated embriyolar; 4) enjekte otocyst electroporate. Ortak metodolojik hataları önlemek için nasıl tartışmak;; otocyst mistargeting en sık nedenler resimsel bir kılavuz; başarıyla transfekte iç kulaklarında temsilcisi örnekler sağlamak ve utero g bir yazmak için mevcut esaslarıene transferi hayvan bakım protokolü.

Fare iç kulak olan gelişim programı gebelikte özenli bir taslakları kaynaklı duyu organıdır. Biz bir tanımlamak<em&gt; Utero</emÜç adımdan oluşan&gt; gen transferi tekniği: fare ventral laparatomi, transuterine mikroenjeksiyon ve<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroporasyon. Biz kritik deney embriyolojik tekniklerini göstermek için dijital video mikroskobu kullanın.

Tarafından geliştirilmesi Fare İç Kulak için Gen Transferi<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektroporasyon

Memeli iç kulağında 6 farklı duyusal epitel bulunur: semisirküler kanalların ampullalarında 3 krista; utrikül ve sakkül içerisinde makulalar ve...

Jane, Ling Wang, Han Jang ve John Burgandy, Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi, Oregon İşitme Araştırma Merkezi tarafından hazırlanan in Vivo Elektroporasyon ile Gelişen Fare İç Kulağına aktarımı gerçekleştirdi. Merhaba. Benim adım John Burgandy. Laboratuvarım, Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi bünyesindeki Oregon İşitme Araştırma Merkezi'nde bulunmaktadır.Benim adım Ang. Johns laboratuvarında poster sunan biriyim. Ayrıca Johns laboratuvarında araştırma asistanı olarak görev yapıyorum.Sunumumuz dört bölüme ayrılmıştır. Birincisi ventral laparotomidir. Sodyum pentobarbital bazlı anesteziyi, anestezinin yeterliliğinin nasıl test edileceğini, kornea korumasını, cerrahi alanın hazırlanmasını, dezenfeksiyonu, fare sağkalım cerrahisi veri sayfasını, cerrahi seti, deri ve karın duvarı boyunca ventral orta hat insizyonunu ve uterus kornularının eksternalizasyonunu gösteriyoruz.İkinci bölüm trans-uterin mikroenjeksiyondur. Embriyonun trans-illuminasyonunu, embriyonun yeniden yönlendirilmesini, mikroenjeksiyonu, pipet hazırlanmasını ve embriyonik gün 11.5 ile embriyonik gün 12.5'te otikte mikroenjeksiyonu gösteriyoruz. Üçüncü bölüm in vivo elektroporasyondur.Ped tipi elektrot yerleşimini

gene-transfer-to-developing-mouse-inner-ear-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

E15 Fare Embriyolar Utero İntraventriküler Enjeksiyon ve Elektroporasyon

24hpf zebrafish otocyst doğrudan morpholinos sunmak için bir yöntem geliştirilmiştir. Otik vezikül ve penetrasyon etkisi elektroporasyon lümenine morpholinos, mikroenjeksiyon, morpholinos beyin üzerinde etkisi atlayacak ve iç kulak özgü efektler elde etmek mümkün.

Enjeksiyon ve Elektroporasyon Zebra balığı Otocyst içine MIF Morpholinos Stoktan teslim İç Kulak Geliştirme etkiler

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

Kazanç ya da fonksiyon çalışmalar kaybı ya da yerine bir amaç için fare retina hücreleri içine plazmid DNA eklenmesi için bir...

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

Gelişmekte olan fare beyninin içine bir gen transferi yöntemi eşsiz bir cerrahi yöntem ve elektrotlar özel şekli ile tarif edilir. Bu benzersiz tekniği, beyin gelişimi okuyan birçok Nörobilimadamları yardımcı olacak zamansal ve mekansal plazmid DNA transfeksiyon sağlar.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

Kaynak: Denaxa, M., el al., Kemogenetik Olarak Tasarlanmış Kortikal İnternöron Progenitörlerinin Erken Doğum Sonrası Fare Beyinlerine Nakli. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, ilgilenilen geni taşıyan bir plazmit vektörünün embriyonik bir beyin dilimindeki internöron progenitörlerine enjekte edilmesi ve ardından plazmit girişi ve gen ekspresyonu için elektroporasyon prosedürünü göstermektedir. Bu modifiye edilmiş progenitörler daha sonra beyin bozukluklarını tedavi etmek için kullanılabilir.

Fare Kortikal İnternöron Progenitörlerinde Agaroz Gömülü Elektroporasyon Destekli Gen Transferi

Embriyonik fare iç kulağından koklear eksplantların izolasyonunu ve kültürünü tanımlayan bir yöntem sunuyoruz.  Ayrıca, kare dalga elektroporasyon yoluyla koklear eksplantlara gen transferi için bir yöntem gösteriyoruz. Gen transfer tekniği ile birleştirilmiş in vitro eksplant kültürü, araştırmacıların gelişim sırasında gen ekspresyonunu değiştirmenin etkilerini incelemelerini sağlar.

Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi

İşitme organı işitmeye aracılık eder. Burada, gelişmekte olan tavuk işitme organında işitsel progenitör hücre proliferasyonu ve farklılaşmasını incelemek için optimize edilmiş modifiye edilmiş bir in ovo mikro-elektroporasyon yöntemi sunuyoruz.

Tavuk İşitsel Organ gen Transferi tarafından<em&gt; Ovo olarak</em&gt; Mikro-elektroporasyon

Bu çalışmada, iç kulak gen teslim yenidoğan farelerde için güvenilir bir yöntem olarak posterior semisirküler kanal yaklaşım tarif. Gen teslim posterior semisirküler kanal aracılığıyla tüm iç kulakta sıvı mümkün olduğunu göstereceğiz.

İç kulak gen teslim yenidoğan Mouse için posterior semisirküler kanal yaklaşım

Burada biz yerel ilaç dağıtım iç kulaklarına semisirküler kanal hasarı ile yetişkin ve neonatal farelerin duyma ve vestibüler işlevine izin veren canalostomy açıklayınız. Bu yöntem viral vektörler, eczacılık ve küçük moleküller fare iç kulak aşılamak için kullanılabilir.

Canalostomy yerel ilaç dağıtım yetişkin ve Neonatal farelerin iç kulaklarına bir cerrahi yaklaşım olarak

Civciv, çeşitli çalışmalar için uygun maliyetli, erişilebilir ve yaygın olarak bulunan bir model organizmadır. Burada, kuş iç kulağı gelişimi ve yenilenmesinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için bir dizi protokol detaylandırılmıştır.

Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri

Öğrenin fare iç kulağında gelişim biyolojisi ve işitme araştırmaları için in utero gen transferi yöntemini. Laparotomi, mikroenjeksiyon ve elektroporasyon teknikleriyle gen fonksiyonlarını canlı ortamda çalışın.

Tarafından geliştirilmesi Fare İç Kulak için Gen Transferi

Daha fazla video keşfet