Name: Tarafından geliştirilmesi Fare İç Kulak için Gen Transferi In Vivo Elektroporasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 2 s
Description: Öğrenin fare iç kulağında gelişim biyolojisi ve işitme araştırmaları için in utero gen transferi yöntemini. Laparotomi, mikroenjeksiyon ve elektroporasyon teknikleriyle gen fonksiyonlarını canlı ortamda çalışın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz aslında başvuru 11 sayfa 130 çıktı mikroenjeksiyon pipeti üretim rakamı yayınlamak için izin Humana Basın teşekkür ederim; videografisi için Larry Dlugas ve Steven Wong, Eğitim İletişim OHSU Bölümü, video tasarım ve düzenleme için Larry Dlugas; Adam M. Ç &#39;Quinn, Kıdemli Tasarımcısı, teknik şematik sağlamak için özel yatay laminer akış kaput ve Les Goldsmith tasarımı için Trion / Envirco; Victor Monterroso, OG, Yüksek Lisans, Doktora ve Tom Chatkupt, DVM, Karşılaştırmalı Tıp OHSU Bölümü, rehberlik için bizim ile hayvan bakım protokolü, cerrahi teknikler ve profilaktik analjezi rejimi; Marcel Perret-Gentil, DVM, MS, veteriner dikiş teknikleri üzerine sadaka paylaşmak için; bizim Adobe Premiere Pro video mikroskopi bilgisayar iş istasyonu tasarımı için Edward Porsov, MS, ve Leah Beyaz ve LNS Jonas Hinckley (Portland, OR) Captioning. Bu çalışma Sağırlık ve Othe Ulusal Enstitüsü bağışları ile desteklenmiştirr İletişim Bozuklukları: DC R01 008.595 ve DC R01 008.595-04S2 (JB) ve P30 DC005983 (Oregon İşitme Araştırma Merkezi Çekirdek Grant, Peter Gillespie, Proje Yürütücüsü).

1. Ventral Laparotomi <ol><li> Sodyum pentobarbital anestezik solüsyonu (gram vücut ağırlığı başına 7.5 uL) intraperitoneal enjeksiyonu ile; olan embriyoların embriyonik günde 11.5 (vajinal fiş algılandığında gün öğleden embriyonik gelişimin günlük 0.5 E11.5) altındadır baraj uyutmak. Anestezik solüsyonu Çalışma; mutlak etanol, 100 uL, 65 mg / mL sulu magnezyum sülfat (uterin tonu modüle) arasında 320 uL, 50 mg / mL sodyum pentobarbital çözeltisinin 180 uL ve propilen glikol 400 uL (sahip araç karışabilir sulu ve organik bileşenleri). </li><li> Ağrılı uyaranlara testleri yapılarak anestezi bütünlüğü değerlendirin: pençe sıkmak; kuyruk tutam, yanak ve burun kılı dokunma ve göz kırpma yanıtı. Kornealara steril oftalmik merhem uygulayın. </li><li> Suprapubik bölgeden makası ile göğüs kafesi ve ince bir bıçak (Oster # 40 bıçak) için karın kürk Tıraş. % 70 etanol ile karın,% 10 povidon iyot (Betadine), bir dezenfektend% 70 etanol, sırayla. Yer steril bir örtü üzerine fare karın tarafı aşağı ve sonra 2-5 dakika için bir ısıtma yastığı veya sıcak plaka (37 ° C) ayarlanır. </li><li> Top uçlu makasla ventral orta hat karın cildi sarın. 10-14 mm kesi uzatın. Linea alba, karın duvarının ventral orta hat boyunca bir avasküler, beyaz bağ dokusu bandı tanımlayın. Top uçlu makas ile linea alba kesilirken ve kesi 10-14 mm uzatmak. Hemen önceden ısıtılmış (37 ° C) Laktatlı Ringer solüsyonu ile karın sulanması. </li><li> Implantasyon sitelerde aşırı basınç uygulamadan halka forseps ile rahmin iki boynuzu yansıtmak. Ön ısıtması, Laktatlı Ringer solüsyonu ile dış kaynaklardan laparotomi sulayın. </li></ol> 2. Transuterine Mikroenjeksiyon <ol><li> 12-16 μ: aşağıdaki özelliklere sahip bir kalın duvarlı, borosilikat cam kapiller mikroenjeksiyon pipeti fabricatem dış çapı ve 20 derece eğimli. ; Basıncı = 200; hız = 46;; = 0 çekin zamanı = 100) ısı = rampa testi artı 3 ünite: küçük kutu filamanlı bir Sutter P-97 pipet çektirmenin, aşağıdaki programı kullanın. Sutter BV-10 beveler ile, geniş çaplı pipetler için 104C (altın) aşındırıcı disk kullanın. Kalsiyum fosfat 3-4 mikrogram / uL de plazmid Pastör pipetiyle ifade (pH 7,2-7,4) tamponlu tuz. 30 saniye boyunca yavaşça konsantre DNA, vortex ile kristal hızlı yeşil ekleyin ve 10 saniye boyunca 10.000 g dönerler. Görsel enjeksiyonunun etkinliğini izlemek için gerekli hızlı yeşil minimum tutar ampirik olarak belirlenir. DNA / hızlı yeşil çözümü ile eğimli pipet dolgu. Basınçlı enjektör (Picospritzer kaynak gazı olarak&gt;% 99 saf azot kullanarak) pipet sahibine yüklü mikroenjeksiyon pipeti bağlayın. </li><li> Düşük yoğunluklu, kendi implantasyon site içinde embriyo görselleştirmek için halojen ışık ile rahim Transillüminasyonda. Bea tanımlayınting kalp, beyin veziküller, bacak tomurcukları, arka beyin arasında doğmakta olan 4. ventrikül ve göz. Ön ısıtması ile her 2 dakika, hidrasyon korumak için Ringer çözeltisi laktatlı rahim sulayın. Embriyo yönlendirme ve anatomik yukarıda belirtildiği tanımlamak için rahim üzerinde hafif basınç uygulayın. </li><li> Orient embriyo anterior ve posterior dalları kanadını otocyst bulunduğu mezenkimal toprakları birincil baş damarı tespit etmek. Uygun otocyst rahim transillüminasyon tarafından görülemez. Otocyst damarın ana gövde ile birlikte, bir Amerikan futbol sahası üzerinde dikey veya goalposts şekli oluşturan, primer baş venin anterior ve posterior dalları arasındaki ortasında bulunur. Otocyst sabitlenmesini ortasındadır. </li><li> Otocyst ve olası konumu ile uyumlu bir yörünge içinde rahim yoluyla enjeksiyon pipeti yerleştirin. Uter geçtikten sonra bir kez mikroenjektör darbeliBizim izleyici boya ve pipet yaklaşık konumunu görselleştirmek için. Mikrometre kontrol altında pipet Advance ve derinlik değerlendirmek için tekrar darbe. Ayrıca sürekli yanal baş mezenşim ve nabız içine pipet ilerlemek. Başarılı otocyst hedefleme dorsale endolenfatik kanal ve tarak Vestibül kabuk şekli konik şekli ortaya çıkaracaktır. Rahim üzerinde baskı bırakın, tek hareketle embriyo / uterustan pipet çıkarın ve hemen ısıtması ile rahim sulanması, Ringer çözeltisi laktatlı. </li></ol> 3. Vivo olarak Elektroporasyon <ol><li> Laktatlı Ringer solüsyonu ile rahim sulayın. Taze uygulanmış laktatlı Ringer çözeltisi elektriksel çift kürek tarzı elektrotlara rahim gereklidir. Laktatlı Ringer ile elektrot tungsten yüzeyleri nemlendirin. Elektrotlar yolunda Merkezi enjekte otocyst. Yavaşça elektroporasyon pa rahim sıkıştırmakddles. Katod enjekte otocyst ve anot uninjected otocyst bitişik uterus duvarı ile temas halinde olduğu lateral uterus duvar ile temas halindedir. Elektroporatörün üzerine ayak pedalı anahtarı ile bir kare dalga darbe tetikler. Elektroporasyon parametreler şunlardır: puls başına 43 volt ve 950 msn interpulse gecikme az 5, 50 ms darbe. Puls teslim hemen sonra rahim sulanması. 60-100 mAmps Otik epitel ataları transferinde yeterlidir: doku teslim mevcut kaydedin. Enjekte edilir ve baraj başına 4-6, E11.5 embriyolar electroporate. </li><li> Olan iç kulaklarında olan bu embriyoların 4. ventriküle sulu floresan dekstran (Alexa Fluor 488 plazmid ifade bir yeşil floresan proteini kodlayan eğer plazmid ifade bir kırmızı floresan proteini veya Alex Fluor 594 kodlar varsa) ikinci bir bağımsız transuterine mikroenjeksiyon gerçekleştirin doğru enjekte edilir ve puls başına akımının en az 60 mAmps de olduelektroporasyon sırasında yürekli. Floresan dekstran ardbeyin doğumda tespit edilebilir ve iç kulak (3.5) embriyogenez sırasında manipüle edildi yavrularının seçimi sağlayacaktır. </li><li> Laktatlı Ringer ile laparotomi sulayın. Karın boşluğuna laparotomi yeniden takın. Ön ısıtması, Laktatlı Ringer çözeltisi 2-4 ml ile rahim boşluğuna boşaltır ve taşma steril örtüyü üzerine kesi dışarı akmasını sağlar. Kuru, steril malzeme ile dökümlülüğü değiştirin. Olmayan bir kesici iğne ve bir 6-0 emilebilir sütür ile karın duvarı dikin. Biz karın duvarı hem de deri için, her dikiş kilitleme, çalışan bir dikiş tercih. </li><li> Barajlar &#39;kürk kurulayın ve deri altı enjeksiyon yoluyla bir non-steroid anti-inflamatuar gibi Meloksikam gibi yönetmek. Steril bir örtü üzerinde önceden ısıtılmış kurtarma kafesine baraj dönün. Monitör ve kanlı akıntı için barajlar &#39;solunumda, yara yeri açıklığı ve vajina kaydedin. Kanama ra olduğunuyeniden ama mevcut ve hız kesmeden eğer o anestezi altında iken, baraj euthanize. O bilinç ve ambulasyon girişimleri kavuşur zaman unutmayın. O yeme ve içme belirtileri gösterir ve yuva inşa etmeye başlamıştır fare koloniye baraj dönün. Genellikle, bu 12 saat içinde gerçekleşir. </li><li> Doğumda (postnatal gün 0), flaş bir GFP veya Texas Red filtresi ile stereofluorescence mikroskop kullanarak floresan dekstran algılamak için çöp her yavru ile arka beyin bölgesi uygun şekilde ayarlayın. Sadece emziren baraj ardbeyin etiketleme gösterilecek bu yavrulardan dönün. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/3653/3653fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1.. Gelişmekte cochlea&#39;ya Elektroporasyon aracılı gen transferi. E11.5 otocyst (darbe tra bir ifade plazmid kodlama gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) ve electroporated ile enjekte edildiparametreler: Beş, 50 msn / nabız ve 950 msn interpulse gecikme) az 43 volt bakliyat. Otocyst koklea ortasında açmak yoluyla tabanından EGFP ifade gösteren E11.5 enjekte edildi ve electroporated yavru postnatal günde 6 (P6) A) bir temsilci iç kulak. Koklea lateral duvarında orta dönüş ve apeks sadece çıkarıldı. Apeks doğuran E11.5 ataları transfekte değildi. B) koklea İmmünoboyama Tüm mount (A) saç hücre belirteci ile, miyozin 7a (Myo7a), bu EGFP ifade Corti organı yörüngesini takip eder ve fena halde saç hücresi taşıyan duyusal epitel yerleştiğini gösterir. Otocyst E11.5 enjekte edildi ve electroporated bir E18.5 embriyo C) bir temsilci iç kulak. Lazer konfokal projeksiyon Myo7a pozitif duyusal kıl hücrelerinin EGFP ifade gösterir. EGFP expressio belirten Corti E18.5 organ koklear duyu epiteli D) Lazer konfokal projeksiyonn iç saç hücrelerinde (IHC), dıştaki saç hücreleri (OHC), iç falankslarında hücreleri (IPC), ayak hücreleri (PC), ve Deiters &#39;hücreleri (dc). (B) &#39;de ölçekli çubuğu (A) için de geçerlidir.

<ol><li>Gillespie, P. G., Muller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+by+hair+cells%3A+models%2C+molecules%2C+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms.</a> Cell. 139, 33-44 (2009).</li>
<li>Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+and+morphogenesis+of+the+vertebrate+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear.</a> Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).</li>
<li>Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell+fate+in+the+sensory+epithelia+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).</li>
<li>Ohyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+is+necessary+for+patterning+the+sensory+and+nonsensory+regions+of+the+developing+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea.</a> J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).</li>
<li>Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+is+required+for+the+generation+of+hair+cells+and+supporting+cells+in+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).</li>
<li>Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+auditory+hair+cells+produced+in+the+mammalian+cochlea+by+in+utero+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer.</a> Nature. 455, 537-541 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%22">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals</a>. , 8th edn, The National Academy Press. (2010).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).</li>
<li>Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+electroporation+theories%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Biol.+Eng.+Comput%22%5BJournal%5D)">Membrane electroporation theories: a review.</a> Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li>
<li>Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-mediated+gene+transfer+to+the+developing+mouse+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear.</a> Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).</li>
<li>Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+mouse+inner+ear+and+origin+of+its+sensory+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs.</a> J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).</li>
<li>Sher, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+and+postnatal+development+of+the+inner+ear+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse.</a> Acta. Otolaryngol. , Suppl 285. 1-77 (1971).</li>
<li>Sheffield, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vector+tropism+for+supporting+cells+in+the+developing+murine+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea.</a> Hear Res. 277, 28-36 (2011).</li>
<li>Bedrosian, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+delivery+of+recombinant+viruses+to+the+fetal+murine+cochlea%3A+transduction+characteristics+and+long-term+effects+on+auditory+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function.</a> Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).</li>
<li>Reisinger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+functional+equivalence+of+otoferlin+and+synaptotagmin+1+in+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis.</a> J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).</li>
<li>Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Gateway+to+MultiSite+Gateway+in+one+recombination+event%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event.</a> BMC Mol. Biol. 7, 46(2006).</li>
<li>Perret-Gentil, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerret-Gentil%2C+M+%22Principles+of+Veterinary+Suturing%22">Principles of Veterinary Suturing</a>. , The University of Texas at San Antonio. Forthcoming.</li>
<li>Oesterle, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOesterle%2C+A+%22P-1000+%26+P-97+Pipette+Cookbook%22">P-1000 & P-97 Pipette Cookbook</a>. , Sutter. (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Gelişmekte olan fare iç kulağa gen transferi: Fare iç kulak postimplantation gelişim 12,13 ilk haftasında kulak taslakları gelişir. Embriyonik günde 9.5 (E9.5) tarafından, taslakları invajine ve otocyst 2 adı verilen bir sıvı dolu vesikül dönüştü. Vezikül içinde kulak öncüleri olgun iç kulak içinde duyusal ve duyunun hücreleri gibi vestibüler ve işitsel epitelde mekanik hassas kıl hücreleri innerve nöronlar doğurur. Geç evrelerinde olarak, iç kulak membranöz labirent karmaşık, 3 bo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Mikro Sterilizasyon Kutusu </td><td> ROBOZ </td><td> RS-9900a </td><td> 8X8.5X1.25 inç </td></tr><tr><td> Bilye uçlu makas </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 14109-09 </td><td></td></tr><tr><td> Halka forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11106-09 </td><td> 4.8mm ID/6mm OD </td></tr><tr><td> Adson Doku Forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11027-12 </td><td></td></tr><tr><td> İğne sürücüsü </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 12502-12 </td><td></td></tr><tr><td> Alerji Şırınga Tepsi </td><td> Becton Dickison </td><td> 305536 </td><td></td></tr><tr><td> Sütür 6-0 </td><td> Syneture </td><td> GL-889 </td><td> 0.7 metrik gastrointestinal sütür </td></tr><tr><td> Ringer USP </td><td> Baxter </td><td> 2B2323 </td><td></td></tr><tr><td> Hızlı yeşil </td><td> Sigma Aldrich </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikat cam kılcal </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 30-0053 </td><td></td></tr><tr><td> Nembutal Sodyum Çözüm </td><td> OVATION Pharmaceuticals Inc </td><td> NDC 67386-501-52 </td><td></td></tr><tr><td> MgSO4.7H2O </td><td> Fisher Scientific </td><td> M63-500 </td><td></td></tr><tr><td> Propilen glikol </td><td> Fisher Scientific </td><td> P355-1 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> E7023-500 </td><td></td></tr><tr><td> Meloksikam </td><td> Boehringer Ingeheim </td><td> ADA 141-219 </td><td></td></tr><tr><td> Mikropipet Çektirme </td><td> Sutter Aletleri </td><td> P-97 </td><td> FB255B kutusu filament; Sutter araçlardan Pipet Yemek danışın </td></tr><tr><td> Mikroelektrod Beveler </td><td> Sutter Aletleri </td><td> BV-10 </td><td> Büyük pipetler için 104C beveling diski; teorisi beveling için kullanım kılavuzuna başvurun </td></tr><tr><td> Mikropipet tutucu </td><td> Warner Aletleri </td><td> MP-S15T </td><td> Picospritzer tüp için 1,5 mm dış çaplı, pipet ve kadın basınç portu için. </td></tr><tr><td> Cımbız tarzı elektrot </td><td> Protech International Inc </td><td> CUY650P5 </td><td> 5 mm dış çapı </td></tr><tr><td> Kare Dalga Elektroporatör </td><td> Protech International Inc </td><td> CUY21EDIT </td><td> Footpedal önerilen </td></tr><tr><td> PICOSPRITZER III </td><td> Parker Hannifin </td><td> 051-0500-900 </td><td> Footpedal önerilen </td></tr><tr><td> Manuel Kontrol Mikromanipülatör </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 640056 </td><td></td></tr><tr><td> Yatay laminer akış temiz tezgah </td><td> Envirco </td><td></td><td> LF 630-10.554 için özel modifikasyonlar. Kaput şematik için ek bilgilere bakın. </td></tr><tr><td> Leica stereofluorescence Lumencor SOLA Hafif bir motor ile mikroskobuyla diseksiyon </td><td> Bartels ve Stout ve Lumencor </td><td> Lumencor SOLA Hafif bir motor ile MZ10F </td><td> MZ10F odaklanmak ve SOLA ışık motor tetiklemek için Footpedals tavsiye edilir </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 Dextran </td><td> Invitrogen </td><td> D22913 </td><td> 10mg/ml, sulu </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Dextran </td><td> Invitrogen </td><td> D22910 </td><td> 10mg/ml, sulu </td></tr><tr><td> Enviro-dri </td><td> Çoban Özel Papers </td><td></td><td> <a href="http://www.ssponline.com" target="_blank">www.ssponline.com</a> </td></tr></tbody></table>

tarafından geliştirilmesi fare İç kulak için gen transferi<em&gt; in vivo</em&gt; elektroporasyon

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

; Kesecik ve kesecik içinde makulaları ve kıvrılmış kokleadaki Corti organı semisirküler kanalların ampullae 3 krista: memelilerin iç kulağının 6 farklı duyusal epitel vardır. Krista ve makulaları Corti organı işitsel saç hücreleri 1 işitme için birincil dönüştürücüler ise mekanik uyarıcılar, denge, özel anlamda hizmet etmek için transdüksiyonu vestibüler saç hücreleri içerir. Semisirküler kanallar ve koklea bu duyusal epitel ve morfonogenezi Hücre kaderi şartname fare gebeliğin ikinci haftasında gerçekleşecek ve büyük ölçüde doğumdan 2,3 önce tamamlanır. Fare iç kulak gelişim çalışmaları rutin hücresel ve / veya morfolojik fenotipleri 4,5 moleküler temelini anlamak için farklı embriyonik ya da doğum sonrası aşamalarında transgenik embriyolar hasat tarafından yürütülmektedir. Biz utero gelişmekte fare iç kulak veren gen transferi hipotez &lt;/ Em&gt; kazanç ve kayıp fonksiyon-çalışmaları bağlamında memelilerin iç kulağının gelişimi 6 altında yatan genetik mekanizmalar sorgulama için geleneksel fare transgenesis için ücretsiz bir yaklaşımı temsil ediyor. Ventral laparatomi) 1, 2) transuterine mikroenjeksiyon; ve in vivo elektroporasyon 3): Gelişmekte olan fare iç kulağa gen misexpression çalışmalar yapmak, deneysel paradigma burada gösterdiği üç genel adım içine giderir. Ventral laparotomi implante embriyo 7 deneysel erişmek için rahim dışsallaştırılmasını izin veren bir fare hayatta bir cerrahi tekniktir. Transuterine mikroenjeksiyon otik vezikül veya otocyst lümenine plazmid ifade tanıtmak Eğimli, cam kılcal mikropipetler kullanılmasıdır. Vivo elektroporasyon progenitör hücreler 8-10 içine plazmid ifade sürmek için kare dalga, akım darbeleri uygulamasıdır. 11 her adımla ilgili ayrıntılı notlar yer. Fare deneysel embriyolojik teknikleri nesir öğrenmek ve hareketsiz görüntüleri tek başına zor olabilir. Bu çalışmada, biz gen transferi prosedürü 3 adım göstermektedir. En önemlisi, biz nasıl tam olarak göstermek için dijital video mikroskopi dağıtmak: 1) anne karnında embriyo yönünü belirlemek; 2) otocyst için enjeksiyon hedefleme için embriyo edinenlerin; 3) embriyonik gün 11.5 olarak otocyst içine izleyici boya solüsyonu ile karıştırılarak DNA microinject ve 12.5; doğumda doğum sonrası seçim için ve 5) etiket electroporated embriyolar; 4) enjekte otocyst electroporate. Ortak metodolojik hataları önlemek için nasıl tartışmak;; otocyst mistargeting en sık nedenler resimsel bir kılavuz; başarıyla transfekte iç kulaklarında temsilcisi örnekler sağlamak ve utero g bir yazmak için mevcut esaslarıene transferi hayvan bakım protokolü.

Fare iç kulak olan gelişim programı gebelikte özenli bir taslakları kaynaklı duyu organıdır. Biz bir tanımlamak<em&gt; Utero</emÜç adımdan oluşan&gt; gen transferi tekniği: fare ventral laparatomi, transuterine mikroenjeksiyon ve<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroporasyon. Biz kritik deney embriyolojik tekniklerini göstermek için dijital video mikroskobu kullanın.

Tarafından geliştirilmesi Fare İç Kulak için Gen Transferi<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektroporasyon

Memeli iç kulağında 6 farklı duyusal epitel bulunur: semisirküler kanalların ampullalarında 3 krista; utrikül ve sakkül içerisinde makulalar ve...

Jane, Ling Wang, Han Jang ve John Burgandy, Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi, Oregon İşitme Araştırma Merkezi tarafından hazırlanan in Vivo Elektroporasyon ile Gelişen Fare İç Kulağına aktarımı gerçekleştirdi. Merhaba. Benim adım John Burgandy. Laboratuvarım, Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi bünyesindeki Oregon İşitme Araştırma Merkezi'nde bulunmaktadır.Benim adım Ang. Johns laboratuvarında poster sunan biriyim. Ayrıca Johns laboratuvarında araştırma asistanı olarak görev yapıyorum.Sunumumuz dört bölüme ayrılmıştır. Birincisi ventral laparotomidir. Sodyum pentobarbital bazlı anesteziyi, anestezinin yeterliliğinin nasıl test edileceğini, kornea korumasını, cerrahi alanın hazırlanmasını, dezenfeksiyonu, fare sağkalım cerrahisi veri sayfasını, cerrahi seti, deri ve karın duvarı boyunca ventral orta hat insizyonunu ve uterus kornularının eksternalizasyonunu gösteriyoruz.İkinci bölüm trans-uterin mikroenjeksiyondur. Embriyonun trans-illuminasyonunu, embriyonun yeniden yönlendirilmesini, mikroenjeksiyonu, pipet hazırlanmasını ve embriyonik gün 11.5 ile embriyonik gün 12.5'te otikte mikroenjeksiyonu gösteriyoruz. Üçüncü bölüm in vivo elektroporasyondur.Ped tipi elektrot yerleşimini ve embriyonik 11,5. gün fare O asistinin elektroporasyonunu gösteriyoruz. Dördüncü bölüm temsili sonuçları içermektedir. Geç embriyonik ve erken postnatal koklealarda GFP ekspresyonunu gösteriyoruz.Bu işlem, embriyonik gün 11,5'te Otis'e ekspresyon plazmidinin in vivo elektroporasyonu ile gerçekleştirilmiştir; birinci bölüm: ventral laparotomi. Anne, boyun arkasındaki deri, kuyruk ve sol arka ekstremite tutularak güvenli bir şekilde sabitlenir. Abdomen %70 etanol ile silindikten sonra, sodyum pentobarbital bazlı anestezik ile intraperitonal enjeksiyon uygulanır.Anestezinin etki etmesi için fare, dört ila beş dakika boyunca kendi kafesinde tutulur. Anestezinin yeterliliğini değerlendirmek için ayak ve kuyruk sıkıştırma testleri uygulanır. Bu anne fare kuyruk sıkıştırmasına yanıt olarak titrer ve zararlı uyaranlara karşı tepkisiz hale gelmeden önce iki dakika daha bekletilmesi gerekir.Korneaların kurumasını önlemek için gözlere steril oftalmik pomad uygulanır. Kürk ve deri döküntülerinin yayılmasını en aza indirmek için cerrahi alanı kimyasal bir çeker ocak içerisinde hazırlarız. Karın duvarını örten cildi açığa çıkarmak için kürkler ince bir bıçakla tıraş edilir.Kılların tamamen temizlenmesi, operasyon sonrası insizyonun iyileşmesini kolaylaştırır. Karın derisinin dezenfeksiyonu; %70 etanol, Betadine ve %70 etanol ile ardışık geçişler yapılarak gerçekleştirilir. Her zaman rostralden kaudale doğru silme işlemi yapın ve her seferinde yeni bir cerrahi pamuk veya pamuklu aplikatör kullanın.Her geçişte, damın tepkisiz olduğundan emin olmak için dezenfeksiyon sırasında solunumların derinliğini ve kalitesini değerlendiririz. İkinci %70 etanol geçişinden sonra, damı hemen ventral yüzeyi aşağı gelecek şekilde steril bir örtü üzerine yerleştirdik ve ısınması için iki ila üç dakika boyunca ısıtmalı bir ped üzerine koyduk. Bu süre, fare sağkalım cerrahi kayıt formuna ameliyat öncesi verileri kaydetmek için uygun bir zamandır. Fare sağkalım cerrahi veri formumuzu ek bilgi olarak ekledik.Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım komitenizin; ameliyat öncesi, ameliyat sırası ve ameliyat sonrası verileri nasıl izleyeceğinizi görebilmesi için veri sayfasını ve hayvan bakım protokolünüzü eklemeyi düşünün. Her cerrahi denek için bir kayıt sayfası dolduruyoruz. Kemirgenler için genellikle zorunlu olmasa da cerrahi işlemleri steril bir ortamda gerçekleştirmeyi tercih ediyoruz.Çalışma yüzeyi, üfleyici motor ve plenum gövdesinden ayrıdır, böylece kullanıcıya herhangi bir titreşim iletilmez. Mikroenjeksiyon sırasında, in utero gen transferini kolaylaştırmak için laminar akışlı kabinimizde yaptığımız modifikasyonların bir şemasını ek bilgi olarak sunduk; temel değişiklikler düşük watt zorlaması ve raylı aydınlatma kesikleri ile cihaz güç kabloları için gizli prizler ve aksesuar elektrik devreleri için bir yönlendirme yoludur. Cerrahi set; elektrikli laktatlı ringer IV torbası, sıcak banyo, XY, Z manipülatörü, stereo floresan diseksiyon mikroskobu, fiber optik ışık kaynağı ve cerrahi aletlerden oluşmaktadır.Mikroenjektörü tetiklemek, elektroporasyon yapmak ve odaklanmak için ayak pedalları kullanılır. Cerrahi kapsamdaki aletler bir otoklavda sterilize edilir. Aletler, fareler arasında cam boncuk sterilizatörü kullanılarak veya iğne tutucu yeniden otoklavlanarak yeniden sterilize edilmelidir.Balli makas, halka pens ve vasküler pensler temel araçlardır. Ventral orta hat insizyonu yapın, cildi vasküler pens ile tutun ve integumenti uçları yuvarlatılmış makasla eksize edin, insizyonu 10 ila 14 Millimeters mesafeye uzatın. Linea alba olarak adlandırılan beyaz avasküler bağ dokusu bandını ve abdomenin ventral orta hattını tanımlayın, linea albayı uçları yuvarlatılmış makas ile kesin.Bağırsağa veya inguinal yağ yastıkçıklarına zarar vermemeye dikkat ederek; karnı derhal steril, önceden ısıtılmış laktatlı ringer çözeltisi ile yıkayın. Ciltteki ve karın duvarındaki insizyon bölgelerini kanama açısından değerlendirin.Varsa, künt penslerle yapılan direkt baskı hafif kanamayı durduracaktır; sağ ve sol uterus kornularını halkalı uçlu penslerle dışarı çıkarın. Sağ uterus kornusunu pensin halkalı bir ucuyla nazikçe yakalayın ve uterusu orta hat insizyonuna doğru çekin. Uterusun kancalanmasını kolaylaştırmak için boşta kalan elinizle dişinin yan tarafını nazikçe manipüle edin.Pensler, rahimi sıkıştırmak ve dışarı çekmek için asla kullanılmamalıdır. Bu işlem rahim damar yapısına veya embriyolara zarar verebileceğinden, dışsallaştırma prosedürünü sol rahim kornusu için tekrarlayın. Dışsallaştırılan rahim kornuslarını derhal önceden ısıtılmış lakte Ringer çözeltisi ile yıkayın ve rahimle birlikte dışarı çıkmışlarsa inguinal yağ pedlerini veya bağırsakları nazikçe geri yerleştirin.Bu durumla sık karşılaşılmaz. İkinci bölüm: uterine mikroenjeksiyon. Anne hayvan, uzun çalışma mesafeli objektifin altına yerleştirilir ve yumuşak kablolu bir fiber optik ışık uterine duvara karşı konumlandırılır.Embriyonun yöneliminin belirlenmesini kolaylaştırmak için uterus, boşta kalan elin bir parmağıyla hafifçe bastırılır. Fiber optik kablodan gelen ışık, embriyo yönelimini doğru şekilde değerlendirmek için gereken en düşük yoğunlukta olmalıdır.Yoğun ışık, uterusa ısı ileterek komplikasyonlara neden olabilir. Fiber optik ışığı ve uterusu bir elimizle tutarken, boşta kalan elimizdeki bir parmağı kullanarak embriyoyu nazik palpasyon ile yeniden konumlandırıyoruz. Aşağıdaki üç video microscopy EC klibinde ve uterusta gözlemlenen yaygın embriyo oryantasyonlarını gösteriyoruz.İzleyici, trans-aydınlatma sırasında gördüğümüz mikroskobik görünümü görecektir; ancak siyah beyaz trans-aydınlatma, uterusun içindeki embriyonun in vivo oryantasyonunun tespit edilmesine olanak tanır. Bu örnekte embriyo, ventral yüzeyi izleyiciye dönük olacak şekilde baş aşağı pozisyondadır. Uterusu ileri geri hareket ettirerek sağ ve sol arka üyeleri, kuyruğu ve sol göz kefalonunu tespit edebiliriz.Bu Örnekte, embriyo yine baş aşağı pozisyondadır ancak anterior posterior eksene göre yaklaşık 90 derece döndürülmüştür. Uterusu nazikçe ileri geri hareket ettirerek, sol arka ekstremiteyi ve sol ön ekstremiteyi tanımlayan kürek şekillerini görebiliriz. Arka beyin de belirgindir.Embriyo, sol tarafı izleyiciye bakacak şekilde dik bir pozisyondadır. Oluşmakta olan dördüncü ventrikül, arka beyinde parlak bir bölge olarak tespit edilebilir. Sol göz sefalonu, sol ön ekstremite ve sol arka ekstremiteler de belirgindir.Rahime uygulanan hafif baskı, beyaz ve siyah yıldızla sırasıyla işaretlenmiş olan primer baş veninin ana gövdesinin ve ön ve arka dallarının tespitini sağlamak için embriyoları hafifçe yeniden yönlendirir. Göreceğimiz üzere, Otis, primer baş veninin ön ve arka dallarının orta noktasında yer alır. Otis'in kendisi, transilüminasyon yoluyla uterus üzerinden görülemez.İki ardışık video mikroskopi klibinde, embriyoyu Otis destek ünitesine mikroenjeksiyon için nasıl yeniden konumlandıracağımızı gösteriyoruz. Amaç, başın lateral bölgesinde otis konumunun belirlenmesine olanak tanıyan embriyonik işaretleyicileri tanımlamaktır. Temel amacımız, primer baş venini tanımlayabilmek için embriyoyu dorsal pozisyondan lateral pozisyona getirmektir.Mezensefalon, dördüncü ventrikül ve sol ön ekstremite dorsal pozisyonda belirgindir. Uterusa uygulanan hafif basınç, embriyonun yönelimini dorsalden laterale kaydırır. Sol göz, sefalon, mezensefalon ve dördüncü ventrikül kolayca görülebilmektedir.Yıldızla belirtilen primer baş veni ve onun posterior dalı da belirgindir. Primer baş veninin anterior dalı net bir şekilde saptanmamıştır. Amacımız, uterine mikroenjeksiyon için uygun olan daha yüksek büyütme altında primer baş venini tanımlayabilmek için embriyoyu yönlendirmektir.Bu lateral perspektifte uterus damarları, decidual band ve sol göz görülmektedir. Uterusa uygulanan hafif basınç embriyonun pozisyonunu değiştirir, böylece dördüncü ventrikül ve sol göz tespit edilebilir. Asterik ile işaretlenmiş olan primer baş veni ve posterior dalı; primer baş veni ve dalları, Amerikan futbolu kale direklerinin şeklini oluşturur.Otik vezikül uterus üzerinden görülemez, ancak desteklerin merkezinde yer alır. Lynn, bir embriyo için enjeksiyon sekansını başlatmıştır. Uterusu trans-illüminasyonla aydınlatır, mikroenjeksiyon için embriyoyu yeniden yönlendirir ve fast green ile doldurulmuş mikroenjeksiyon pipetini görüş alanına getirir.Mikroenjeksiyon pipeti, bir X, Y, z mikro manipülatör tarafından tutulan bir pipet tutucuya takılıdır. Manipülatör manyetik standı, mikroenjeksiyon pipetinin zahmetsizce kaba konumlandırılmasına olanak tanıyan Teflon tabanlı bir çelik plakaya sabitlenmiştir. İğne, manipülatör üzerindeki ileri mikrometre kontrol düğmesi uygun şekilde kullanılarak ilerletilir.Erken Otis evresindeki fare embriyosuna yapılacak travmatik mikroenjeksiyon için özel olarak hazırlanmış pipetler gereklidir. Yatay bir pipet çekici kullanarak kalın duvarlı borosilikat cam kapiler tüpleri çekeriz. A'da gösterilen sonuçtaki pipet, B'de ok ucuyla belirtilen yaklaşık 14 ila 16 mikron dış çap konumundan pensle manuel olarak kırılır. C'de gösterilen pipetin kaba kırılma yüzeyi pürüzlü ve kırılgandır.Mikroenjeksiyon pipeti uçlarını keskinleştirmek için pipeti yaklaşık 20 derecelik bir açıyla eğimli şekilde kesiyoruz; Panel D'de görüldüğü üzere mikroenjeksiyon pipetlerinin çekilmesi ve eğimli kesilmesi için gerekli parametreler ek metinde sağlanmıştır. Sonraki iki video mikroskopi klibinde, embriyonik 11,5 ve 12,5. günlerdeki fare otik kistine mikroenjeksiyon işlemini gösteriyoruz. Amacımız, embriyonik 11,5. gündeki fare otik kistlerine uterus içi mikroenjeksiyonu göstermektir.Öncelikle, doğru hedeflenmiş bir enjeksiyonun nasıl göründüğünü net bir şekilde göstermek için uterus mevcut değilken otikleri enjekte ediyoruz. Ardından, gerçek trans-uterin mikroenjeksiyonu gerçekleştiriyoruz. Bu ilk enjeksiyon için, visseral kesenin dışarı çıkmasına izin vermek amacıyla uterus boylamasına kesilmiş ve visseral vitellus kesesinin üzerindeki desidüal bant kaldırılmıştır.Plasenta rahimle bağlantılı kalmaya devam eder ve embriyo canlıdır. Rahmin odaksal olarak çıkarılmasıyla dördüncü ventrikül, primer baş veni ve onun anterior ile posterior dalları, pipet ve beyaz renkte kistin yaklaşık konumu görülmektedir. Bu enjeksiyon dizisinin başlangıcında, visseral vitellus kesesi vaskülaritesinde kan akışı tespit edilir.Pipet, visseral vitellus kesesi boyunca ilerletilir ve dai, osis notuna, dorsalde endolenfatik kanala ve otiklerin dikmelerin merkezindeki konumuna enjekte edilir. Otik, primer kafa veninin anterior ve posterior dallarının ortasındadır; embriyonik 11,5. gün fare otiklerine uterus içi mikroenjeksiyon yapılması, otik kistin konumunu tahmin etmek için primer kafa veninin ve dallarından en az birinin tespit edilmesini gerektirir.Bu şematik örnekteki hedefimizde, primer baş veninin hem anterior hem de posterior dalları saptanmış ve OUC bölgesi beyazla işaretlenmiştir. Embriyonun daha gerçekçi bir sunumu, primer baş veninin ana gövdesinin dallarından yalnızca biriyle birlikte saptandığı durumdur ve gösterilen örnekte primer baş veninin yalnızca posterior dalı görülmektedir; ancak bu durum otiklerin konumunu yorumlamak için yeterlidir. PT uterus boyunca ilerletilir ve otiklerin içine boya enjekte edilir.Boyanın amniyotik boşluktan temizlenmesi için 30 saniye bekleriz; bu noktada endolenfatik kanalı dorsalde ve vestibülü görebiliriz. Bu görünümde anatomik perspektif sağlamak amacıyla, az önce enjeksiyon yaptığımız embriyonun düşük büyütmeli bir görüntüsüyle işlemi tamamlarız; burada dördüncü ventrikül, sol göz ve uterus vaskülarizasyonu görülmektedir. Embriyonik 12. gündeki fare otik kistine trans- ve mikroenjeksiyon ile arka beynin yeni oluşan dördüncü ventrikülüne mikroenjeksiyonu gösteriyoruz.Transillüminasyon, bu sol lateral görünümde primer baş veninin yanı sıra gözün de tespit edilmesine olanak tanır. Pipet, uterus üzerinden otik veziküle doğru ilerletilir ve lümenini doldurmak için boya enjekte edilir. Dördüncü ventriküle enjeksiyon yapmak için, arka beynin dorsal görünümünü elde etmek amacıyla embriyoyu 90 derece döndürürüz.Enjekte edilen sol kist şu an sol taraftadır. Pipet uterus boyunca ilerletilir ve fast green ile lor karıştırılır. Konjuge dekstran dördüncü ventriküle enjekte edilir.Enjekte edilen boya hacminin in vivo ortamda orta beyne girmediğine dikkat edin. Dekstran lokalizasyonunu dördüncü ventrikülde doğrulamak için enjeksiyondan sonra floresans değerlendirmesi yapılır. Ardından embriyo, dorsal pozisyondan lateral pozisyona yeniden yönlendirilir.Bu lateral görünümde endolenfatik kanal, dördüncü ventrikülün hemen ventralindedir. In vivo floresan görüntüleme, dekstranın dördüncü ventriküldeki lokalizasyonunu doğrular. Doğumda, epi-floresan mikroskop kullanarak yavruların dördüncü ventrikülünde yeşil floresan olup olmadığını tarıyoruz.Arka beyinlerinde yeşil floresan bulunan yavrular, embriyogenez üçüncü bölüm in vivo elektroporasyon sırasında manipüle edilmiş bir iç kulağa sahiptir. Kist ekspresyon plazmidi ile doldurulduktan sonra, uterus önceden ısıtılmış laktatlı ringer çözeltisi ile taze olarak yıkanır. Transillüminasyon, ODU kistinin elektrot alanında merkezlenmesini kolaylaştırır.Fiber optik ışığın metal başlığı uterus yüzeyinden geri çekilir. Kare dalga darbe trenini başlatmadan önce, bir sonraki video mikroskopi klibinde in vivo tam bir elektroporasyon döngüsünü gösteriyoruz. Embriyonik gün 11,5 fare otik kistinin elektroporasyonu, palet tipi elektrotların uterusa nazikçe yerleştirilmesini gerektirir.Bu örnekte, sol otik kist ekspresyon plazmidi ile doldurulmuş ve uterus taze laktatlı ringer çözeltisi ile yıkanmıştır. Katot, doldurulmuş otik kiste göre lateral olarak konumlandırılmış ve anot ise medial olarak yerleştirilmiştir; elektroporasyon sekansının başlangıcında otik kist, ped alanının merkezindedir. Uterus nazikçe sıkıştırılır ve kare dalga puls treni bir ayak pedalı anahtarıyla başlatılır.İdeal olarak, darbe başına 60 ila yüz miliamper akım uygulanır. Ardından uterus serbest bırakılır ve derhal yıkanır. Yeni yıkanmış uterus, ring penset ile hafif baskı uygulanarak karın boşluğuna geri döndürülür.Uterus içeri alındıktan sonra, abdominal kavite yaklaşık dört ml laktatlı ringer çözeltisi ile yıkanır; abdominal cerrahi sonrası normalden daha az su içecek olan damın hidrasyonunu korumaya yardımcı olmak için abdominal kavitede yaklaşık bir ml laktatlı ringer bırakılır. Karın duvarı ve ardından cilt, bir iğne tutucu kullanılarak emilebilir sütürle kapatılır. Kullandığımız iğne tutucunun, kapatma işlemini kolaylaştıran yerleşik bir makası bulunmaktadır.Hem karın duvarı hem de deri için sürekli dikiş yöntemini tercih ediyoruz. İnsizyon bölgesinde ek destek sağlamak amacıyla her iki dikişte bir kilit atıyoruz. Anne hayvanı iyileşme kafesine yerleştirmeden önce cilt altına nonsteroid antiinflamatuar bir ilaç uyguluyoruz.Kurumunuzun hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından hangi profilaktik analjeziklerin tercih edildiği konusunda veteriner personelinizle istişare edin. Anne hayvan, steril bir örtüye sarılarak ısıtmalı iyileşme kafesinin tabanına yerleştirilir. İyileşme kafesi; yuva malzemesi, gizlenme için kırmızı bir tüp, laboratuvar yemi ve bir su şişesi içerir.Kafes, cerrahiden sonraki sabah üst kısmına bir filtre başlığı takılarak yeniden kurulur. Anne hayvan bakımlı görünmektedir, hareketlidir ve kafesin açık olan üst kısmını incelemek için arka ayakları üzerinde dengede durabilmektedir. Karındaki sütür hattı temiz ve kurudur; ayrılma, kızarıklık veya şişlik belirtisi göstermemektedir.Utero gen transferi için hayvan bakım protokolü geliştirmeyi ele alan bir belge ekledik. Bu belge, hayvan bakım ve kullanım komitenizle istişare ederek kuruma özgü bir protokol tasarlarken faydalı olabilecek ifadeler içermektedir. Dördüncü bölüm, temsilci sonuçlar.Temsili sonuç panelleri A ve B, embriyonik 11,5. günde Otis'e geliştirilmiş yeşil floresan protein ekspresyon plazmidi enjekte edilen ve ardından elektro- işlemi uygulanan, postnatal altıncı günündeki bir yavrudan alınan temsili bir kokleayı göstermektedir. Koklear yan duvar, orta kısımdan ve apeksden çıkarılmıştır. Sadece kokleanın bazal kısmından orta kısmına kadar GFP ekspresyonu mevcuttur ve bu ekspresyon, panel B'de gösterilen tüy hücresi markeri myosin seven A'nın dağılımını takip etmektedir. Panel C, embriyonik günün düşük büyütmeli konfokal projeksiyonunu göstermektedir.18.5 günlük fare organi di Corti, myosin seven A antikoru ile immün boyanmıştır; transfekte hücreler organi di Corti boyunca dağılmıştır. Panel D, embriyonik 18.5 gün fare organi di Corti'nin cin.Seven ile boyanmış yüksek büyütmeli konfokal projeksiyonunu göstermektedir.İç ve dış tüy hücrelerinde, interphalangeal hücrelerde, sütun hücrelerinde ve TER hücrelerinde GFP ekspresyonu tespit edilir. Embriyonik gün 11,5'te Otis'e gerçekleştirilen elektroporasyon aracılı gen transferi, cochlea organı içindeki tüm bileşen hücre tiplerini oluşturan progenitörleri transfect eder.

gene-transfer-to-developing-mouse-inner-ear-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

E15 Fare Embriyolar Utero İntraventriküler Enjeksiyon ve Elektroporasyon

24hpf zebrafish otocyst doğrudan morpholinos sunmak için bir yöntem geliştirilmiştir. Otik vezikül ve penetrasyon etkisi elektroporasyon lümenine morpholinos, mikroenjeksiyon, morpholinos beyin üzerinde etkisi atlayacak ve iç kulak özgü efektler elde etmek mümkün.

Enjeksiyon ve Elektroporasyon Zebra balığı Otocyst içine MIF Morpholinos Stoktan teslim İç Kulak Geliştirme etkiler

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

Kazanç ya da fonksiyon çalışmalar kaybı ya da yerine bir amaç için fare retina hücreleri içine plazmid DNA eklenmesi için bir...

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

Gelişmekte olan fare beyninin içine bir gen transferi yöntemi eşsiz bir cerrahi yöntem ve elektrotlar özel şekli ile tarif edilir. Bu benzersiz tekniği, beyin gelişimi okuyan birçok Nörobilimadamları yardımcı olacak zamansal ve mekansal plazmid DNA transfeksiyon sağlar.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

Açıklanan kulak sonrası cerrahi yaklaşım, kan kaybını ve hayvan ölümlerini en aza indirirken fare koklear skala timpanisine hızlı ve doğrudan iletim sağlar. Bu yöntem, yuvarlak pencere zarından doğum sonrası farelere moleküler, farmakolojik ve viral iletim kullanılarak koklear tedavi için kullanılabilir.

Yuvarlak Pencere Membran aracılığıyla Fare İç Kulak için virally ve Gen Teslimat Cerrahi Yöntemi

Embriyonik fare iç kulağından koklear eksplantların izolasyonunu ve kültürünü tanımlayan bir yöntem sunuyoruz.  Ayrıca, kare dalga elektroporasyon yoluyla koklear eksplantlara gen transferi için bir yöntem gösteriyoruz. Gen transfer tekniği ile birleştirilmiş in vitro eksplant kültürü, araştırmacıların gelişim sırasında gen ekspresyonunu değiştirmenin etkilerini incelemelerini sağlar.

Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi

İşitme organı işitmeye aracılık eder. Burada, gelişmekte olan tavuk işitme organında işitsel progenitör hücre proliferasyonu ve farklılaşmasını incelemek için optimize edilmiş modifiye edilmiş bir in ovo mikro-elektroporasyon yöntemi sunuyoruz.

Tavuk İşitsel Organ gen Transferi tarafından<em&gt; Ovo olarak</em&gt; Mikro-elektroporasyon

Bu çalışmada, iç kulak gen teslim yenidoğan farelerde için güvenilir bir yöntem olarak posterior semisirküler kanal yaklaşım tarif. Gen teslim posterior semisirküler kanal aracılığıyla tüm iç kulakta sıvı mümkün olduğunu göstereceğiz.

İç kulak gen teslim yenidoğan Mouse için posterior semisirküler kanal yaklaşım

Burada biz yerel ilaç dağıtım iç kulaklarına semisirküler kanal hasarı ile yetişkin ve neonatal farelerin duyma ve vestibüler işlevine izin veren canalostomy açıklayınız. Bu yöntem viral vektörler, eczacılık ve küçük moleküller fare iç kulak aşılamak için kullanılabilir.

Canalostomy yerel ilaç dağıtım yetişkin ve Neonatal farelerin iç kulaklarına bir cerrahi yaklaşım olarak

Civciv, çeşitli çalışmalar için uygun maliyetli, erişilebilir ve yaygın olarak bulunan bir model organizmadır. Burada, kuş iç kulağı gelişimi ve yenilenmesinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için bir dizi protokol detaylandırılmıştır.

Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri

Öğrenin fare iç kulağında gelişim biyolojisi ve işitme araştırmaları için in utero gen transferi yöntemini. Laparotomi, mikroenjeksiyon ve elektroporasyon teknikleriyle gen fonksiyonlarını canlı ortamda çalışın.

Tarafından geliştirilmesi Fare İç Kulak için Gen Transferi

Daha fazla video keşfet