Kilitli Nükleik Asit Sitometrisi-floresan Yerinde Hibridizasyon (LNA akış FISH): Bakteriyel Küçük RNA Algılama Yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, tekil bakteriyel hücrelerde bakteriyel RNA ekspresyonunu tespit etmektir. Bu işlem, öncelikle beş prim ucunda biotin TEG modifikasyonuna sahip bir kilitli nükleik asit veya LNA probu tasarlanarak gerçekleştirilir. Bakteriyel hücreler daha sonra fikse edilip dathyl, perkarbonat veya dsy ile işlem görüp ardından permeatize edildiğinde, RNA denatüre edilir ve LNA probu hibridize olur.

Üçüncü olarak, hücreler yıkanır, bloklanır ve boyanır. Son olarak, hücresel floresans akış sitometrisi ile ölçülür. Nihayetinde, RNA ekspresyonundaki değişimler zaman içinde ve popülasyonlar arasında değerlendirilebilir.

Bu yöntem, tek bir hücre içindeki RNA türlerinin göreceli varlığı ve bolluğu ile bu ekspresyonun homojen veya heterojen popülasyonlar içinde ne derece değiştiğine ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem şu anda bakteriyel küçük RNA ekspresyonunu izlemek için kullanılsa da, teorik olarak potansiyel olarak herhangi bir hücre tipindeki RNA'yı tespit etmek için kullanılabilir. LNA prob dizisini tasarladıktan sonra, probun yalnızca ilgilenilen SRNA veya mRNA'ya özgü olduğundan emin olmak için blast kullanın.

Prob sipariş edilirken, LNA oligonükleotidinin beş prime ucuna biotin TEG modifikasyonu ekleyin. Biotin etiketlemesi, soyulmuş avid ve di konjugatı ile hibridizasyon sonrası boyama için gereklidir. Yönteme üç negatif kontrol dahil edilmelidir; bunlardan birincisi, hibridizasyon sırasında LNA probunun eklenmediği LNA kontrolüdür.

İkinci adım, LNA probunun hedef SRNA ile hibridize olduğu ancak floresan boyanın yokluğu nedeniyle hibridizasyon olayının tespit edilmediği bir boyasız kontroldür. Ve üçüncü olarak, spesifik olmayan hibridizasyonu izlemek amacıyla, mevcut olmayan veya eksprese edilmeyen bir SRNA'yı hedefleyen bir LNA probu kullanan, eksprese edilmeyen SRNA veya mRNA kontrolüdür; ilgili bakteriden 1 × 10⁸ hücre hasat ederek bunları 1,5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne aktararak başlayın. Ardından, santrifüj işleminden sonra bakteri hücrelerini 2300 ×g'de beş dakika boyunca çöktürün.

Süpernatantı dökerek değil, pipetleme yoluyla uzaklaştırın. Ardından, pelletini 400 µL PBS içinde yeniden süspanse edin, 400 µL PFA asetik asit PBS fiksasyon çözeltisi ekleyin ve hücreleri iyice karıştırın. Şimdi süspansiyonu 25 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.

Hücreleri tekrar santrifüjle çöktürdükten beş dakika sonra bir kez vorteksleyin. Bu işlemde 4.500 ×g hızında iki dakika boyunca santrifüj yapın. Peleti 400 µL PBS ile iki kez yıkayın.

Son olarak, peleti 400 µL PBS içinde yeniden süspande edin ve fiksasyonu tamamlanmış hücreleri dört derece sıcaklıkta yedi güne kadar saklayın. Her bir fiksle bakteri hücresi örneğine, taze hazırlanmış %1'lik dsy çözeltisinden 400 µL ekleyerek başlayın. Ardından, hücre çözeltilerini pipetleme yoluyla iyice karıştırın.

Bu karışımı 25 °C'de 12 dakika boyunca inkübe edin ve ardından hücreleri 400 µL PBS ile iki kez yıkadıktan sonra, hücrelere 800 µL taze hazırlanmış lizozim solüsyonu ekleyin. Hücre lizozim solüsyonunu vorteksleyerek iyice karıştırın ve hücreleri 25 °C'de ara ara karıştırarak 30 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri santrifüjle çöktürdükten sonra, pelletin üzerine 800 µL taze hazırlanmış proteinaz K solüsyonu ekleyin ve yeniden süspande edilen hücre solüsyonunu pipetleyerek iyice karıştırın.

Hücreleri 25 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin ve inkübasyon süresinin ortasında vorteksleyin; hücreleri santrifüjleyip 400 µL PBS ile yıkadıktan sonra hücreleri başka bir 400 µL PBS içinde yeniden süspande edin ve süspansiyondan 100 µL'yi dört ayrı 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne ekleyin, ardından hücreleri peletleyin ve süpernatantları atın. Şimdi dört örneğin her birini, her birinde 100 µL hibridizasyon tamponu olacak şekilde 60 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin. Hibridizasyonu takiben, hücrelerin viskoz hibridizasyon solüsyonundan uzaklaştırılmasını sağlamak için hibridizasyon karışımına 1 mL SSC plus tween 20 veya SSCT ekleyin.

Çöktürme işleminden sonra, hücre pelletlerine 200 µL formamid SSCT çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın. Ardından numuneleri bir ısıtma bloğunda 65 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Şimdi karışıma 1 mL SSCT ekleyin ve hücreleri tekrar çöktürdükten sonra hücreleri 500 µL SSCT içinde yeniden süspande edin ve hücre çözeltisini ısıtma bloğunda 40 dakika boyunca inkübe edin.

Çökeltme işleminden sonra,lehimlenmiş hücre pelletlerine 200 µL bloklama tamponu ekleyin ve hücreleri 25 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Çökeltme işleminden sonra, boyasız kontrol için hücre pelletlerine tekrar 50 µL şeritlenmiş avid ve boya çözeltisi ekleyin ve hücreleri iyice karıştırın. 50 µL bloklama tamponu ekleyin.

Tüpleri alüminyum folyo ile ışıktan koruyarak, tüm örnekleri bir termo mikser içinde sürekli karıştırma ile 25 °C'de 12 dakika daha inkübe edin. Ardından, hücreleri bir kez 500 µL SSCT tamponu ile ve bir kez 400 µL PBS plus tween 20 veya PBST ile yıkayın. Süpernatanları uzaklaştırdıktan sonra, biotinillenmiş antis, strippin ve PBS'den 100 µL ekleyerek 25 °C'de ara ara karıştırma ile 30 dakika bekletin; bu antikor, önceki adımda eklenen strippin DI konjugatına bağlanacaktır.

Ardından, hücreleri çöktürüp 400 µL PBST ile iki kez yıkadıktan sonra, hücrelere 50 µL soyulmuş avid ve boya çözeltisi ekleyerek ikinci kez boyama yapın ve iyice karıştırın. Bu adım, boyasız kontrol için hibritlenmiş LNA probu başına sinyal çıkışını artırır. Tekrar, sadece 50 µL bloklama tamponu ekleyin ve ardından tüm tüpleri bir termo mikserle sabit karıştırma uygulayarak 25 °C'de 12 dakika boyunca inkübe edin.

Boya çözeltisi ile inkübasyondan sonra, hücreleri bir kez daha 500 µL SSCT tamponu ile ve ikinci yıkamadan sonra bir kez 400 µL PBST ile yıkayın. Pelleti 200 µL PBST içinde yeniden süspanse edin ve hücreleri akış sitometrisi analizine hazır olana kadar 4 °C'de saklayın; daha küçük bakteriyel hücreler için, çekirdek boyutunu azaltmak amacıyla akış sitometresindeki akış hızını yavaşa ayarlayın. Ayrıca, ileri saçılma (forward scatter) eşik kesme değerlerine sahip akış sitometreleri için, küçük bakteriyel hücrelerin tespit edildiğinden emin olmak amacıyla kesme değerini mümkün olduğunca düşük tutun.

Az önce açıklanan koşullar kullanıldığında, etkili bir şekilde fikse edilmiş ve permeabilize edilmiş hücrelerin bir örneği buradaki akış sitometrisi nokta grafiğinde gösterilmiştir. Permeabilizasyon için hücre popülasyonu küçük ve homojendir, bu da az sayıda hücre agregatı olduğunu göstermektedir. Ancak, daha yüksek lizozim konsantrasyonları kullanıldığında, hücrelerin agrege olma olasılığı daha yüksektir ve bu nokta grafiğinde görüldüğü gibi, daha büyük partiküllere işaret eden artmış ileri saçılım (forward scatter) değerleri sergilerler.

Burada, başarılı bir LNA flow fish deneyinden elde edilen akış sitometrisi verilerine bir örnek gösterilmiştir. Histogram, üç negatif kontrol ile birlikte bir hedef SRNA'nın spesifik saptamasını göstermektedir. Mor renkteki boya içermeyen (no die) negatif kontrol en düşük floresansı verirken, bunu sırasıyla mavi ve kırmızı renklerdeki LNA içermeyen (no LNA) ve eksprese edilmemiş SRNA negatif kontrolleri takip etmektedir.

Son olarak, SRNA spesifik LNA probu içeren örnek, siyah renkte en yüksek floresan sinyalini verir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik doğru şekilde uygulandığı takdirde yaklaşık altı saat içinde tamamlanabilir. Ayrıca bu teknik, R-T-P-C-R ile karşılaştırıldığında daha fazla bilgi sağlamakta ve daha maliyet etkin bir yöntem sunmaktadır.

Bu prosedürün ardından, çoklu RNA saptamasını mümkün kılmak için diğer HAPS'lerle etiketlenmiş ek problar hazırlanabilir ve hibridizasyon adımı sırasında eklenebilir.I.