Tali Görüntü Tabanlı Sitometre kullanarak GFP İfade ve Canlılık Değerlendirilmesi

Bu video, tally görüntü tabanlı sitometreyi kullanarak GFP eksprese eden hücrelerde hücre canlılığını belirlemek için bir prosedürü göstermektedir. GFP transdüksiyonlu hücreler, tüm ölü hücreleri propidyum iyodür ile kırmızıya boyayan tally canlılık kiti ölü hücre kırmızısı kullanılarak boyanır, hücreler bir çetele hücresel analiz slaydına pipetlenir ve parlak alan ve kırmızı ve yeşil floresan görüntülerini alan ve analiz eden sitometreye yüklenir. Histogramlar daha sonra geleneksel akış sitometrisi ile karşılaştırıldığında hücre sayısını, hücre boyutu PI floresan yoğunluğunu ve GFP floresan yoğunluğunu görüntülemek için oluşturulur.

Tali, hücre canlılığı ve ekspresyonu ile ilgili benzer veriler sağlayabilir. Bununla birlikte, bu görüntü tabanlı sitometri, incelenen hücre popülasyonu hakkında ek görsel bilgi sağlar. Bu tekniğin akış sitometrisi veya floresan mikroskobu gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, çetele görüntü tabanlı sitometrenin hücre örneğiniz hakkında aynı anda hem nicel hem de görsel bilgi sağlamasıdır.

Ek olarak, sayım cihazının kullanımı daha kolaydır, daha ucuzdur ve bir akış sitometresi veya floresan mikroskobundan daha küçük bir ayak izine sahiptir. Bu, araştırmacıların tezgah üzerinde GFP eksprese eden hücrelerde canlılık gibi kantitatif tahlilleri hızlı bir şekilde gerçekleştirmelerine olanak tanır. Bu prosedürde, mililitrede 10 ila altı hücrenin bir katı konsantrasyonda U2 OS hücreleri, propidyum iyodür ile ölü hücreleri sürdürmek için nükleer hedefli hücre ışığı GFP viral yapısı ile transdüksiyon yapıldı ve hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini yeni bir mikro santrifüj tüpüne transfer etti.

Test için mililitre başına bir kez 10 ila beşinci ila bir kez 10 ila yedinci hücreler arasında bir konsantrasyonun önerildiğine dikkat edin, ancak konsantrasyonun kesin olması gerekmez. Ardından, bir mikrolitre tally ölü hücre kırmızı reaktifi ekleyin. Daha sonra karıştırmak için kısaca girdaplayın, boyama reaktifini ve hücre karışımını oda sıcaklığında karanlıkta bir ila beş dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, hemen tally görüntü tabanlı sitometre üzerinde analize devam edin. Çetele, cihaz için özel olarak tasarlanmış tek kullanımlık plastik hücresel analiz slaytları kullanır. Slaytı yüklemek için her zaman slaytı kenarlarından tuttuğunuzdan emin olun.

25 mikrolitre numuneyi yarım ay şeklindeki numune yükleme alanlarından birine yavaşça pipetleyin. Burada, boyanmamış nont transdüksiyonlu kontrol hücreleri A odasına yüklenir ve boyanmış GFP eksprese eden hücreler, GFP eksprese eden hücrelerde bir canlılık testi yapmak B.To odaya yüklenir, sitometrenin ana ekranında G-F-P-R-F-P'ye dokunun. Test seçenekleri daha sonra sağda görünecektir, GFP artı canlılığı seçin.

Cihaz daha sonra numune serisini adlandırmak için numune serisinin adlandırılması gerekip gerekmediğini soracaktır. Şimdi isme basın. Ardından dokunmatik ekranı kullanarak numune serisinin adını yazın ve kaydet'e basın, tally sitometresi otomatik olarak ölçüm ekranına ilerleyecektir.

Ardından, arka plan floresansını ölçmek için, burada görülebileceği gibi ölçüm ekranının sağ alt yarısındaki arka plan sekmesine basın. Varsayılan ayar, dokuz hücre alanının görüntüleneceğini gösterir. Şimdi kontrol numunesi cihazdan uzağa bakacak şekilde, sürgüyü durana kadar yükleme portuna sokun.

Arka plan ekranına kuvvet uygulamayın, yeni lekesiz hücre kontrolü eklemek için basın. Slayt otomatik olarak cihaza çekilecek ve hücrelerin canlı bir görüntüsü ekranda görüntülenecektir. Odaklama düğmesini kullanarak, odaklama sırasında hücreleri uygun görüş düzlemine getirin.

Kırmızı yakınlaştırma düğmesini dört x veya 16 x'e kaydırın. Hücre popülasyonunu daha iyi görmek için, hücrelerin her birinin etrafında parlak bir hale ile eşit şekilde karanlık olması gerekir. Burada gösterildiği gibi, hücrelerin arka planı ile kenarları arasındaki geçiş bulanık olduğunda ve bu nedenle hücre sınırları iyi tanımlanmadığında hücreler eksik sayılabilir.

Hücreler, parlak merkezlere ve karanlık çevrelere sahip olduklarında fazla sayılabilir. Hücreler odak haline getirildikten sonra, lekesiz hücre kontrolünü çalıştırmak için dokunun, basın. Arka plan floresansını ölçmek için, sitometre otomatik olarak görüntüleri yakalayacak ve her görüş alanının küçük resimlerini görüntüleyecektir.

İlerleme çubuğu, analizin sürekli olarak güncellenmesini sağlar. Görüntü yakalama işlemi tamamlandıktan sonra, sitometre slaytı otomatik olarak çıkarır ve yakalanan görüntülerin analizinden elde edilen verileri sağlar. Depolanan veriler, arka plan sekmesinin açılır menüsünde görüntülenir.

Arka plan kontrol örneğine, denemeye verilen adın aynısı atanır. PI lekeli GFP transdüksiyonlu numuneyi çalıştırmak için, slaytı cihazdan çıkarın, ters çevirin ve transdüksiyon sampcihazdan uzağa bakacak şekilde yeniden yerleştirin. Örnek sekmesine basın ve ardından yeni örnek eklemek için basına dokunun.

Görüntü ekranda göründüğünde, hücreleri odağa getirmek için odak düğmesini kullanın. Daha önce olduğu gibi, örneği çalıştırmak için basına dokunun. Görüntü yakalama işlemi tamamlandıktan sonra, analizden elde edilen veriler numune sekmesinin altında görünür ve sitometre slaytı otomatik olarak uygun şekilde çıkarır.

Uyarı sinyali hücresel analiz slaytını atın. Biyolojik olarak tehlikeli atık olarak bu slaytlar tekrar kullanılamaz. Numune çalıştırıldıktan sonra, numuneye eşikler uygulanabilir.

Burada belirli hücre popülasyonlarını analiz etmek için, canlı ve ölü hücrelerin yüzdesini belirlemek için eşikleri ayarlayacağız. Örnek sekmesi altındaki GFP eksprese eden hücrelerde, GFP toplam canlılığını ifade eden canlı ve ölü hücrelerin sayısı ve yüzdesi. Ortalama hücre boyutu, sayılan hücre sayısı ve hücre konsantrasyonu görüntülenir.

Ek olarak, hücre boyutunu, yeşil floresan ve kırmızı floresansı gösteren histogram grafikleri ekranın alt kısmında görüntülenir. Hücre boyutu geçidini ayarlamak için, herhangi bir kalıntıyı dışlamak üzere hücre boyutu histogramını açmak için hücre boyutu küçük resmine dokunun. Hem büyük hem de küçük olayları hariç tutmak için mavi kaydırma çubuklarını hareket ettirin.

Kapıların içindeki hücreleri dahil etmek için uygula'ya dokunun. Analize GFP floresansını eklemek için ardından GFP histogramı küçük resmine dokunun. Açmak için.

Eşiği en kısık tepe noktasının hemen sağına ayarlamak için mavi kaydırma çubuğunu hareket ettirin. Kontrol örneğini kılavuz olarak kullanın. Bu, analizin GFP pozitif hücreleri içermesine izin verir, ancak otofloresan hücreleri hariç tutar.

Otofloresans, hücrelerdeki biyolojik moleküller excel touch uygulandığında, onaylamak ve önceki ekrana dönmek için sıklıkla gözlenir. Numune sekmesi altında görüntülenen veriler artık her iki floresan kanalı için ayarlanan kapıları ve eşiği yansıtmalıdır. Ardından, PI leke hücrelerini otofloresanstan veya numunede bulunan herhangi bir arka plandan ayırmak için, tekrar açmak için PI histogramı küçük resmine basın.

Kontrol örneği tepe noktası, histogramda gri bir tepe noktası olarak görüntülenecektir. Kırmızı tepe, numune floresansıdır. Arka plan floresansı, bu cihazda sıfır RFU değerine en yakın tepe noktası olarak görüntülenir.

PI kanalındaki arka plan floresansını ortadan kaldırmak için, eşiği ayarlamak üzere mavi kaydırma çubuğunu hareket ettirin. Bu tepe noktasını hariç tutmak için, kontrol örneğindeki gri tepe noktasını referans olarak kullanın. PI kanalındaki eşik uygun şekilde ayarlandığında, onaylamak ve önceki ekrana dönmek için uygula'ya dokunun, uyarı sinyali cihazı verileri tekrar otomatik olarak yeniden analiz edecek ve s'deki sonuçları güncelleyecektir.ample sekmesi.

Ardından, her hücrenin doğru şekilde atandığını görsel olarak onaylamak için yakınlaştırma sekmesine basın, ardından görüntünün küçük resmine basarak incelenmek üzere yakalanan bir görünüm alanını seçin. Ardından katmanlar sekmesine basın. Ardından, o kanaldan çekilen görüntüyü görüntülemek için GFP veya PI düğmesine basın.

Katmanı ekrandan kaldırmak veya katmanları üst üste bindirmek için aynı düğmeye tekrar basın, hücrelerin belirli bir kanaldan nasıl sayıldığını belirlemek için her kanala karşılık gelen düğmelere dokunun. Dokunma daireleri: Yalnızca parlak alan kanalından sayılan ve floresan ifade etmeyen hücreler mavi daire içine alınacaktır. Bu, belirli bir hücrenin yeşil kanalda ifade eden canlı hücreler olduğunu gösterir.

GFP, kırmızı kanalda ifade edilen yeşil hücrelerde daire içine alınacaktır. Pi ile boyanmış olanlar kırmızı daire içine alınır ve her ikisinde de ölü hücreler sayılır. Kırmızı ve yeşil kanal sarı daire içine alınacaktır.

Bu, hücrenin GFP'yi ifade ettiğini, ancak aynı zamanda pi ile boyandığını ve bu nedenle ölü olduğunu gösterir. Bazen ekranda siyah bir daire belirir. Bunlar, tanımlanmış ancak hücre boyutuna dayalı analizden çıkarılmış nesnelerdir.

Floresan ifade eden her hücre uygun renkle daire içine alınana kadar az önce açıklanan adımları kullanarak floresan histogramındaki eşiğe ince ayar yapmaya devam edin. Tüm analiz parametreleri otomatik olarak cihaza kaydedilir. Veri musluğunun altında.

Çetele, 500 örnek çalıştırmadan veri dosyalarını depolayabilir. Veri sekmesinde depolanan her dosya yeniden analiz için kullanılabilir. Veri sekmesinden dosya seçildiğinde, dosya yeniden açılacak ve verileri arşivlemek ve raporlar oluşturmak için tüm histogramlar ve katmanlar aktif hale gelecektir.

Cihazda depolanan veriler, bir USB sürücü kullanılarak bir bilgisayara aktarılabilir. Dört temsili hücre tipi, nükleer hedefli bir hücre ışığı ile transdüksiyona tabi tutuldu, GFP viral yapısı, ölü hücre kırmızısı reaktifi kullanılarak tally canlılık kiti ile boyandı ve burada gösterildiği gibi bir akış sitometresinde çetele ile analiz edildi. Her iki yöntem de, GFP'yi ifade eden her hücre tipi için popülasyonun yaklaşık olarak aynı yüzdesini, hem canlı hem de GFP'yi ifade eden toplam popülasyonun yüzdesini bildirdi.

Bu veriler, Tali sitometresinin bir popülasyondaki toplam GFP ekspresyonu ile canlı popülasyondaki GFP ekspresyonu arasında ayrım yapabildiğini göstermektedir. Hücre numunenizdeki floresan ekspresyonunu ve canlılığını değerlendirmek için çetele görüntü tabanlı sitometrenin nasıl kullanılacağını az önce gösterdik. Bu teknoloji, bireysel ve popülasyon hücre çalışmaları arasındaki boşluğu doldurur.

Çetele görüntü tabanlı sitometreyi kullanarak, tek tek hücrelerin yanı sıra daha büyük hücre popülasyonları hakkında nicel ve nitel görsel bilgiler toplayabilirsiniz. Aynı prosedür kullanılarak, apoptoz, RFP ekspresyonu ve hücre canlılığı dahil olmak üzere birkaç başka test yapılabilir İfade etmeyen hücreler için, potansiyel uygulamalar, ilaç etkinliği çalışmalarına gen ekspresyonunun değerlendirilmesini içerir.