Name: Tali Görüntü Tabanlı Sitometre kullanarak GFP İfade ve Canlılık Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Öğrenin, Tali Görüntü Tabanlı Sitometre kullanarak GFP ifadeli hücrelerde canlılık değerlendirmesi yapmayı. Bu yöntem, hem nicel hem de görsel veri sağlayarak hücre popülasyonlarını hızlıca analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Tali Canlılık Kiti ile boyanarak Hücreleri - Ölü Hücre Kırmızı Reaktif <ol><li> CellLight Nucleus-GFP * BacMam 2.0 kullanarak transduced U2OS hücreleri (Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu) ile bu yordama başlamadan *. (Not: Hücreler aynı zamanda aşağı döndü ve orta ya da PBS içinde yeniden süspanse olabilir). </li><li> PI ile ölü hücreleri leke için, yeni bir mikrosantrifüj tüpü 100 mcL hücrelerinin transferi. 1 x 10 5 1 x 10 7 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyon tayini için önerildiğini unutmayın, ama konsantrasyonu tam olarak sahip değildir. </li><li> Daha sonra, ölü hücreleri leke PI tabanlı Tali Ölü Hücre Kırmızı reaktif 1 mcL ekleyin. Vortex kısa bir süre karıştırın. 1-5 dakika karanlıkta, oda sıcaklığında Tali Ölü Hücre Kırmızı reaktif ve hücre karışımı inkübe edin. </li><li> Inkübasyon sonrasında, hemen Tali Görüntü Tabanlı Sitometre numune analizi geçin. </li></ol> 2. Hücre Canlılık Testi Sahne kullanmaTali Görüntü Tabanlı Sitometre <ol><li> Tali sitometresinin, özellikle sitometresinin sığacak ve iki ayrı kapalı odaları (A ve B) 25μL örnekleri tutabilir tek kullanımlık plastik Tali Hücresel Analiz Slaytlar kullanır. Slayt tutarken, her iki tarafın da onu tutmak için emin olun. </li><li> Yavaş yavaş, yarım ay biçimli bir örnek yükleme alanı içine slayt, pipet 25 mcL örnek oluşturan kabarcık veya geri sıçramak özen yüklemek için. Veya dolgu altında bırakmayın. </li><li> Burada, kontrol hücreleri (lekesiz, non-transduced) odasında yüklenir A ve lekeli GFP ifade hücreleri kontrol örneği verileri analiz ederken otofloresans düzeyi belirlemek yardımcı olacaktır kamara B. yüklenir. </li><li> Sitometresinin ana ekranda bir canlılığı testi, dokunmatik GFP / TÇD gerçekleştirmek için. Tahlil seçenekleri sonra sağ tarafta görünecektir. GFP + Canlılık seçin. </li><li> Daha sonra, örnek bir dizi isim, Şimdi Adı basın </strong&gt;. Sonra, dokunmatik ekranı kullanarak, örnek serisi adını yazın ve Kaydet tuşuna basın. (Not: Seç Adı daha sonra tarihi ve saati otomatik olarak her bir numune serisi için bir isim atamak için .) </li><li> Örnek adlandırma sonra, Tali sitometresinin Ölçü ekranına otomatik olarak ilerler. Ölçü ekranın sağ alt yarısında Arka Plan sekmesine basınız. </li><li> Sonra, durana kadar (A) Sitometre uzakta karşı karşıya kontrol örneği ile yükleme noktası slayt eklemek. Kuvvet uygulamayın. </li><li> Arka plan ekran, dokunmatik Yeni lekesiz Hücre Kontrol Ekle tuşuna basın. Slayt otomatik olarak sitometresinin içine çekilebilir ve hücrelerin canlı bir görüntü ekranda görüntülenir. </li><li> Odak düğmesini kullanarak, doğru düzlemde hücreleri getirmek. Hücreler her hücre etrafında parlak bir hale (Şekil 1, Sol) ile düzgün koyu renkli olmalıdır. </li><li> Hücrearka plan ve hücrelerin kenarları arasındaki geçiş bulanık s hücre sınırları iyi tanımlanmış değildir (Şekil 1-Merkez), böylece undercounted olabilir. Hücreler overcounted parlak merkezleri ve karanlık çevrelerinin (Şekil 1, sağ) olduğunda olabilir. </li><li> Odaklanarak hücre popülasyonu daha iyi görmek için, 16X 4X ya da kırmızı Zoom göstergesi düğmesini kaydırın . </li><li> Hücreleri odak noktası haline getirilmiştir sonra, arka plan floresan ölçmek için lekesiz Hücre Kontrolü Çalıştır düğmesine dokunun. </li><li> Sitometresinin otomatik olarak yakalama ve örnek görüntüleri analiz eder. (Resim 9) modu, varsayılan görüntü yakalama ve analiz etmek için yaklaşık 1 dakika sürer. </li><li> Thumbnails görünümü her alanda esir olarak görüntülenir ve ilerleme çubuğu, devam eden bir güncelleştirme sağlar. Görüntü yakalama işlemi tamamlandıktan sonra, sitometresinin otomatik olarak slayt çıkarıyor ve çekilen görüntülerin analiz verileri sağlar. </li><li>Depolanan veri sitometresinin Arka Plan sekmesini menüsü açılan gözükecektir. Arka plan kontrolü örnek deney verilen ve açılır menüden ithal edilecek aynı adı tahsis edilecektir. Not: bir arka plan kontrolü değilse, sitometresinin otomatik olarak bir floresan eşik atar. Bu tahlil yaptıktan sonra elle değiştirilebilir. </li><li> PI lekeli transduced örneği çalıştırmak için, sitometresinin slayt kaldırmak etrafında çevirin ve transduced numune cihaz uzak bakacak şekilde yeniden takın. </li><li> Örnek sekmesine basınız ve daha sonra Yeni Örnek Ekle tuşuna basın dokunmatik . Görüntü ekranda belirdiğinde görüntü ayar düğmesi hücreler, daha önce olduğu gibi odak noktası haline getirmek için kullanın. Sonra Örnek Çalıştır düğmesine dokunun. </li><li> Görüntü yakalama işlemi tamamlandıktan sonra, veri analiz örnek sekmesi ve sitometresinin otomatik altında görünürmüttefiki slayt çıkar. </li><li> Uygun Tali Hücresel Analiz Slide biyolojik tehlikeli atık olarak bertaraf. Tali Hücresel Analiz Slaytlar tekrar edilemez. </li></ol> 3. Ayar Eşikler ve Gates <ol><li> Örnek çalıştırıldıktan sonra, eşikler artık belirli bir hücre popülasyonu üzerinde ev için örnek olabilir. Burada, biz, hücreler transduced-GFP canlı ve ölü hücrelerin yüzdesi belirlemek için eşikleri ayarlayabilirsiniz. </li><li> Örnek sekmesi altında, GFP ifade hücreler, GFP, toplam canlılığı, ortalama hücre boyutu, sayılır hücrelerinin sayısı ve hücre konsantrasyonunu ifade canlı ve ölü hücreleri sayı ve yüzde olarak gösterilir. </li><li> Buna ek olarak, hücre boyutu, yeşil floresans, kırmızı floresans (PI) gösteren histogram araziler, ekranın alt kısmında görüntülenir. </li><li> Hücre boyutunu kapısı ayarlamak için, Hücre Boyutu Küçük resim hücre boyutu histogram açmak için dokunun. Kültür hücreleri d nadiren olsa daebris, diğer örnekleri hücrelere oranla daha büyük ya da küçük kalıntılar içerebilir. </li><li> Bu enkaz dışlamak için, hem küçük hem de büyük olaylar hariç, kaydırma çubuğu üzerindeki mavi düğmeleri doğru kaydırın. Sonra, dokunma, verileri yeniden analiz uygulayın ve sonuçları güncelleyecektir . </li><li> Sonra, GFP floresan analize eklemek için, açmak için GFP histogram minik dokunmayın. Kontrol örneği bir kılavuz olarak kullanarak, sadece en belirsiz tepe sağ eşik ayarlamak için mavi çubuğunu kaydırın. </li><li> Bu analiz, GFP pozitif hücreler içerir, ancak autofluorescent hücreleri hariç sağlar. Biyolojik moleküllerin hücre içinde heyecanlıyız Otofloresans sık görülmektedir. </li><li> Onaylayın ve bir önceki ekrana dönmek için Uygula dokunun. Örnek sekmesi altında görüntülenen veriler artık her iki floresan kanal için belirlenen kapı ve kapı eşikleri yansıtmalıdır . </li><li> Daha sonra, otofloresansı basın t PI boyanan hücrelerin ayrıPI histogram minik PI histogram açmak için. </li><li> Yine, kontrol örneği zirve histogram üzerinde gri bir zirve olarak görünecektir. Kırmızı tepe örnek floresan. Eşiğe bu sitometresinde 0 RFU değerine yakın bir tepe olarak görüntülenir. </li><li> PI kanalı arka plan floresan ortadan kaldırmak için, bir referans olarak kontrol örneği gri pik kullanarak, arka plan floresan temsil eden zirve dışlamak için eşik ayarlamak için kaydırma çubuğunu mavi düğme hareket. Onaylayın ve bir önceki ekrana dönmek için Uygula dokunun. </li><li> Sonra, sonra Katmanlar tab tuşuna basarak görsel, her hücre doğru atanmış olduğunu onaylamak Zoom sekmesinde görüntünün küçük resmini basarak, incelenmek üzere yakalanan bir alan seçin. </li><li> Sonra, bu özel kanal aracılığıyla çekilen görüntü ekranı, GFP veya PI düğmesine basın .. Ekrandaki tabakayı kaldırmak için aynı düğmeye tekrar basın; veya katmanları üst üste, Çoklu Katman düğmesine dokunun. </li><li> Hücreleri belirli bir kanal, dokunmatik Çemberleri ile nasıl sayılır tanımlamak için. Floresan mavi çember olacak ifade yok sadece parlak bir alan kanal, üzerinden sayıldı hücreleri. Bu belirli bir hücre (yani PI negatif) canlı olduğunu gösterir. </li><li> Hücreler ifade GFP GFP kanal olacak ve yeşil daire olacak. PI kanal Ölü Hücre Kırmızı ile boyanmış ölü hücreleri görülebilir ve kırmızı daire içine alınmış olacak. </li><li> Sarı, kırmızı ve yeşil kanal sayılır Hücreler daire olacak, bu hücre, GFP ifade ettiğini gösterir, aynı zamanda PI ile boyanmış ve bu nedenle öldü. </li><li> Bazen, siyah daireler, ekranda görünecek, bu nesneleri tespit edilmiştir, ancak hücre boyutuna göre analiz dışında tutulmuştur. </li><li> Fi devamne ayar floresan ifade her hücre uygun bir renk ile daire kadar açıklanan adımları kullanarak floresan histogram eşik. </li><li> Tüm analiz parametreleri otomatik olarak veri sekmesi altında kaydedilir. Tali sitometresinin örnek çalışan yaklaşık 500 veri dosyalarını saklayabilir. </li><li> Veri sekmesinde saklanan Her dosya reanalysis kullanılabilir. Veri sekmesinden dosya seçerek açtı ve tüm histogramlar ve katmanları aktif hale olacaktır. </li><li> Arşiv verileri ve raporları oluşturmak, Sitometre saklanan verileri bir bilgisayara bir USB sürücü kullanarak transfer edilebilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Tali Görüntü Tabanlı Sitometre bir nükleer hedefli GFP BacMam 2.0 ifade inşa transduced hücrelerin floresan protein ekspresyon seviyesi ölçmek için kullanılmıştır. Dört temsili hücre tipleri (U2OS, 293MSR, HEKn ve CHO-S) transduced edildi.Bu hücre hatları için, GFP ifade edildi hücrelerinin sayısı Tali sitometresinin tarafından bildirilen ve aynı örneklerinden bir akış sitometresinde analiz verileri ile karşılaştırıldığında. Ayrıca, hücreler Ölü Hücre Kırmızı reaktif Tali sitometresinde ve bir akış sitometresinde hem ölü hücre popülasyonu tespit Tali Canlılık kiti kullanılarak boyandı. Şekil 2&#39;de grafik GFP ifade vardı, her hücre tipi için toplam nüfusun yüzde göstermektedir. Bu veriler, Tali sitometresinin bir akış sitometresinde tarafından oluşturulan verilerin karşılaştırılabilir veri üretmektedir göstermektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3659/3659fig1.jpg" /> Şekil 1. Hücreler düzgün analizinden önce odaklı olmalıdır. Tali Hücresel Analiz slaytlar analizi için uygun (1 x 10 1 - 5 x 10 7 hücreleri tavsiye edilir) hücre konsantrasyonları ile (SOL) odak hücrelerin düzgün darka plan arasındaki geçiş ve hücrelerin kenarları bulanık ve hücrelere parlak olduğunda Hücreler belki overcounted tanımlanmamış sınırları (SAĞ) olduğunda, her bir hücre (MERKEZ) Hücreler etrafında parlak bir hale ile hücre boyunca gemisinin, undercounted olabilir merkezleri ve karanlık çevrelerinin. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3659/3659fig2.jpg" /> Şekil 2. Tali Görüntü Tabanlı Sitometre floresan protein ekspresyonu verileri flow sitometri kullanılarak elde edilen karşılaştırılabilir canlı hücreler 4 farklı hücre hatları hesaplanan GFP-ifade sonuçlarının yan yana karşılaştırma.

<ol><li>Godfrey, W. L., Hill, D. M., Kilgore, J. A., Buller, G. M., Bradford, J. A., Gray, D. R., Ignatius, M. J., Janes, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementarity+of+Flow+Cytometry+and+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Complementarity of Flow Cytometry and Fluorescence Microscopy.</a> Microsc. Microanal. 11, 246-247 (2005).</li>
<li>Mittag, A., Pinto, F. E., Endringer, D. C., Tarnok, A., Lenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+analysis+by+open-source+software+for+affordable+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Cellular analysis by open-source software for affordable cytometry.</a> Scanning. 33, 33-40 (2011).</li>
<li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).</li>
<li>Smyth, P. G., Berman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+apoptosis%3A+methods+for+elucidating+the+mechanism+of+apoptotic+cell+death+from+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system.</a> Biotechniques. 32, 648-654 (2002).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Koopman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+V+for+flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+B+cells+undergoing+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis.</a> Blood. 84, 1415-1420 (1994).</li>
<li>Tanke, H. J., van der Linden, P. W., Langerak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+fluorochromes+to+ethidium+bromide+for+automated+read+out+of+cytotoxicity+tests%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Alternative fluorochromes to ethidium bromide for automated read out of cytotoxicity tests.</a> J. Immunol. Methods. 52, 91-916 (1982).</li>
<li>King, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+dead+cells+and+measurement+of+cell+killing+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 243, 155-166 (2000).</li>
<li>Jones, K. H., Kniss, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propidium+iodide+as+a+nuclear+counterstain+for+immunofluorescence+studies+on+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Propidium iodide as a nuclear counterstain for immunofluorescence studies on cells in culture.</a> J. Histochem. Cytochem. 35, 123-125 (1987).</li>
<li>Dell'Arciprete, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+expression+gene+cloning+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">High-efficiency expression gene cloning by flow cytometry.</a> J. Histochem. Cytochem. 44, 629-640 (1996).</li>
<li>Lamm, G. M., Steinlein, P., Cotten, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+quantitative+and+inexpensive+method+for+detecting+apoptosis+by+flow+cytometry+in+transiently+transfected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid, quantitative and inexpensive method for detecting apoptosis by flow cytometry in transiently transfected cells.</a> Nucleic. Acids. Res. 25, 4855-4857 (1997).</li>
<li>Perfetto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+reactive+dyes%3A+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).</li>
</ol>

Krissy Remple ve Laurel Stone Bu makalede kullanılan araç üretmiş Life Teknolojileri çalışanı vardır. Yaşam Teknolojileri, bu video makale üretimi sponsor oldu.

Biz sadece, canlılığı sayımları yerine ve Tali Görüntü Tabanlı Sitometre kullanarak GFP ifade değerlendirmek için bir prosedür ayrıntılı var. Aynı prosedürü kullanarak, bu sitometresinin diğer testleri de dahil olmak üzere bir dizi performans yeteneğine sahip olmayan transduced hücreleri kullanarak, apoptoz, RFP ve hücre canlılığı analiz. Hücre canlılığı, gen ekspresyonu ve apoptosis Florimetrik testleri 7-12 biyomedikal araştırmaların temel yöntemler haline gelmiştir. Geçmişte, ayrı enstrümantasyon, hücreler hakkında nicel ve görsel bilgi almak için kullanılmaktadır. Heterojen bir nüfus içinde hücreleri hakkında kantitatif bilgi akış sitometri kullanımı yoluyla topladı olsa da, görsel ya da nitel bilgiler floresan mikroskobu 1-4 kullanımı yoluyla toplanmıştır. Burada, biz, halk ve tek tek hücre çalışmaları arasında bir köprü bir teknoloji sunuyoruz. Tali Görüntü Tabanlı Sitometre, kantitatif da kullanarakta ve aynı anda, tek tek hücrelerin veya hücre popülasyonlarının hakkında görsel hücre veri toplanabilir. Tali enstrüman, gen ekspresyonu, apoptozis testlerin değerlendirilmesi, ilaç etkinlik çalışmaları ve hastalığın ilerlemesi değerlendirilmesi de dahil olmak üzere bir dizi uygulamalar için kullanılabilir. Tali Görüntü Tabanlı Sitometre yakalar ve elde edilecek hücrelerin alt popülasyonlar hakkında bilgi sağlayan, parlak alan, kırmızı floresans ve yeşil floresan görüntüleri analiz eder. Örneğin, bu testte, Ölü Hücre Kırmızı boya kullanarak GFP ifade hücre popülasyonu içinde canlı hücrelerin ölü hücreleri ayırt etmek mümkün. Bu canlı hücreler, GFP ifade ölçüm doğruluğu ve sonraki işlemlerde kullanışlı hücreleri nüfus tanımlar. Nüfus içindeki ölü hücreler kültürde çevre koşulları (örneğin, trypsinization veya neden normal hücre ölümü ya da hücre ölümü de dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan gelen ortaya çıkabileceği unutulmamalıdır.seçilen transfeksiyon / transdüksiyon yöntemi ile indüklenen sporcudan). İşte biz U2OS hücreleri ile Tali sitometresinin kullanımını göstermektedir. Benzer yöntemler, en memeli ve böcek hücreleri kullanılarak yapılabilir. Her bir hücre hattı için, Tali sitometresinin, nicel GFP ifade veriler, standart bir floresan mikroskop kullanılarak hücrelerin görsel bir inceleme ile mümkün değildir. Bu sonuçlar flow sitometri ile karşılaştırılabilir olmasına rağmen, zamanının bir kısmını tahsil edilir. Sitometresinin ideal 1 x 10 1 - 5 x 10 7 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyon, çapı 5 mikron ile 60 mikron arasında doğru sayma hücreleri yeteneğine sahiptir . Ölü Hücre Kırmızı boyama protokolü, burada açıklanan dahil olmak üzere çoğu standart boyama protokolleri, işaret etmek önemli, canlı ve ölü hücrelerden ayırt propidium iyodür kullanın. St permeabilize hücreleri canlılığını ölçerken bir meydan okuma sunuyorPI, kuşkulu bir membran ile, herhangi bir hücreyi leke, hücre içi belirteçlerin aining. , Yeşil ya da kırmızı floresan kanalları ile tespit edilebilir herhangi bir floresan boya veya protein Tali Görüntü Tabanlı Sitometre analiz edilebilir, gelecekteki çalışmalar amin reaktif canlılığı boyalar 4 gibi alternatif boyaların kullanımı, keşfedebilirsiniz. 2006 Perfetto ve ark tarafından yapılan bir çalışmada 12, bu boyalar, canlı ve ölü hücre popülasyonlarının ayrımcılık kullanımı kolay ve tekrarlanabilir olduğu bulundu. Tali gerçekleştirebilirsiniz testlerinin türleri açısından sınırlamalar olduğunu unutmayın. Örneğin, cihaz tarafından kullanılan objektif 4X olduğundan, sayma işlemleri büyük hücre tipleri sınırlıdır: mitokondri veya veziküller gibi alt hücresel yapılar, bakteri hücrelerinin sayısal olamaz. Ayrıca Tali tespit kanalları heyecanlandırmak ve kanalları içinde yayacaktır fluorophores sınırlı olduğunu unutmayın. Iken YFP ve parlak mCherry sinyalleri cbir tespit, dimmer mCherry sinyalleri olamaz. Son olarak, Tali sadece süspansiyon hücreleri analiz. Bu doğru bir slayt yapışan hücreler sayılmaz. Ayrıca, bazı maya ve birincil hücreler de dahil olmak üzere, düzensiz şekilli hücre sayımı için sadece sınırlı bir yeteneği vardır. Buna ek olarak, gelecekteki çalışmalarda, büyük olasılıkla intrasellüler belirteçlerin ifade değerlendirmek bu sistemin kullanımı ele alınacaktır. Bireysel boyalar Invitrogen Kullanıcı online SpectraViewer aracı (kullanarak komşu kanalları ile spektral örtüşme için kontrol edilebilir <a href="http://www.invitrogen.com/spectraviewer">www.invitrogen.com / spectraviewer</a> ). Bu teknolojinin yeniliği göz önüne alındığında, tam kapsamlı uygulamalar henüz keşfedilmeyi. Özetle, Tali Görüntü Tabanlı Sitometre gösterdi, tek tek hücrelerin değerlendirilmesi yanı sıra cel sağlayan hücre popülasyonlarının eşzamanlı görselleştirme ve analizi için olanak sağlayan yeni bir teknoloji sunuyorl nüfusu basit bir iş akışı ile kompakt bir biçimde.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Tali Görüntü Tabanlı Sitometre </td><td> Invitrogen </td><td> T10796 </td></tr><tr><td> Tali Hücresel Analiz Slaytlar, 50 Slaytlar </td><td> Invitrogen </td><td> T10794 </td></tr><tr><td> Tali Hücresel Analiz Slaytlar, 500 slaytlar </td><td> Invitrogen </td><td> T10795 </td></tr><tr><td> Tali Canlılık Kit - Ölü Hücre Kırmızı </td><td> Invitrogen </td><td> A10786 </td></tr><tr><td> Tali Canlılık Kit - Ölü Hücre Yeşil </td><td> Invitrogen </td><td> A10787 </td></tr><tr><td> Tali Apoptoz Kiti </td><td> Invitrogen </td><td> A10788 </td></tr><tr><td> U2OS hücreleri </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tali görüntü tabanlı sitometre kullanarak gfp İfade ve canlılık değerlendirilmesi

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Tek hücreli ve nüfus bilgileri flow sitometri veya floresan mikroskobu yaygın olarak elde edilir. Ancak, bu iki yöntem farklı bilgiler sağlar. Flow sitometri, fiziksel özellikleri ve boyanması veya ifade hakkında nicel çok parametrik bilgiler verir, ancak görselleştirme için izin vermiyor. Stand-alone floresan mikroskopi görsel veri sağlar, ancak basit nicel ölçümleri 1 için izin vermez. Heterojen popülasyonları 2 görüntü tabanlı sitometri binlerce hücre hızlı görselleştirme ve eş zamanlı kantitatif analiz sağlayarak, bu iki yöntem arasında bir köprü . Burada, Tali Görüntü Tabanlı Sitometre 3 kullanılarak hücre canlılığı ve yeşil flüoresan protein (GFP) ifade testleri gerçekleştirmek için bir yöntem sunar. Tali enstrüman, 3-kanal (parlak bir alan, yeşil floresans, kırmızı floresans) benchtop tahlil platformu olduğunu Offers flow sitometri ve floresan mikroskobu üzerinde çeşitli avantajları. Tali sitometresinin, daha az pahalı, daha az tezgah yer kaplıyor, daha az bakım gerektirir ve iş akışı çalışma ve analizler çok daha basit ve hızlı böylece basitleştirilmiş oldu. Tali sitometresinin GFP ve kırmızı floresan proteini (RFP) ifadesi, apoptosis 4-6 ve propidium iyodür ile hücre canlılığı analizi (PI) 7-11 dahil olmak üzere süspansiyon hücre tabanlı testlerin bir dizi gerçekleştirme yeteneğine sahiptir. Burada, GFP ifade hücrelerinde hücre canlılığı tahlil yapmak Tali araç kullanımını göstermek. Ölü Hücre Kırmızı - GFP transduced hücreleri Tali Canlılık kiti kullanılarak boyandı. Bu hücreler daha sonra bir Tali Hücresel Analiz Slayt pipetlenir ve sitometresinin içine yüklenir. Aydınlık alan, kırmızı floresans ve yeşil floresan görüntü yakalanır ve tahlil özel algoritmalar kullanılarak analiz edilmektedir. Histogramlar sonra hücre boyutu, PI fluo görüntülemek için oluşturulanrescence yoğunluğu ve GFP floresan. Bu parametreler daha sonra, belirli bir hücre popülasyonu evine eşiklenir olabilir. Bir yan yana karşılaştırma Tali Görüntü Tabanlı Sitometre ve geleneksel akış sitometri, iki yöntem hücre canlılığı ve protein ekspresyonu ilişkin karşılaştırılabilir veriler sağlamaktadır olduğunu göstermektedir. Ancak, Tali enstrüman, bir akış sitometre kullanılarak elde edilemeyen hücre popülasyonu hakkında ek görsel bilgi sağlar.

Bu protokol Tali Görüntü Tabanlı Sitometre kullanarak hücre canlılığı ve floresan ifade deneyleri nasıl gerçekleştirileceği açıklanır.

Tali Görüntü Tabanlı Sitometre kullanarak GFP İfade ve Canlılık Değerlendirilmesi

Tek hücre ve popülasyon bilgileri yaygın olarak ya akış sitometrisi ya da floresan mikroskopi ile elde edilir. Ancak, bu iki yöntem ...

Bu video, tally görüntü tabanlı sitometre kullanılarak GFP eksprese eden hücrelerde hücre canlılığının belirlenmesi prosedürünü göstermektedir. GFP transdüksiyonu yapılmış hücreler, tüm ölü hücreleri propidyum iyodür ile kırmızıya boyayan tally viability kit dead cell red kullanılarak boyanır; hücreler bir tally hücresel analiz lamına pipetle aktarılır ve parlak alan ile kırmızı ve yeşil floresan görüntüleri elde eden ve analiz eden sitometreye yüklenir. Ardından, geleneksel akış sitometrisi ile karşılaştırıldığında hücre sayısı, hücre boyutu, PI floresan yoğunluğu ve GFP floresan yoğunluğunu görüntülemek için histogramlar oluşturulur.Tali, hücre canlılığı ve ekspresyonuna ilişkin benzer veriler sağlayabilir. Ancak, bu görüntü tabanlı sitometri, incelenen hücre popülasyonu hakkında ek görsel bilgiler sunar. Bu tekniğin akış sitometrisi veya floresan mikroskobu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tally görüntü tabanlı sitometrenin hücre örneğiniz hakkında hem kantitatif hem de görsel bilgiyi eş zamanlı olarak sağlamasıdır.Ayrıca, sayım cihazı, hem bir akış sitometresinden hem de bir floresan mikroskobundan daha kolay kullanılır, daha ucuzdur ve daha küçük bir yer kaplar. Bu, araştırmacıların GFP eksprese eden hücrelerdeki canlılık gibi kantitatif analizleri laboratuvar tezgahında hızlı bir şekilde gerçekleştirmelerine olanak tanır. Bu prosedürde, 1 × 10⁶ hücre/mL konsantrasyonundaki U2 OS hücreleri, ölü hücreleri propidyum iyodür ile boyamak için nükleer hedefli hücre ışığı GFP viral konstrüktü ile transduksiyonu yapılmış olup, hücre süspansiyonundan 100 µL yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarılmıştır.Analiz için mililitre başına 1 × 10⁵ ile 1 × 10⁷ hücre arasında bir konsantrasyon önerilse de konsantrasyonun tam olarak bu değerlerde olması gerekmez. Ardından, bir mikrolitre tally dead cell red reaktifi ekleyin. Daha sonra karıştırmak için kısa süreli vorteksleyin, boyama reaktifi ve hücre karışımını oda sıcaklığında, karanlıkta bir ila beş dakika inkübe edin.İnkübasyonun ardından, vakit kaybetmeden tally görüntü tabanlı sitometre ile analize geçin. Tally, özellikle bu cihaz için tasarlanmış tek kullanımlık plastik hücresel analiz lamları kullanır. Lamı yüklerken her zaman kenarlarından tuttuğunuzdan emin olun.Örnekten 25 µL'yi yarım ay şeklindeki örnek yükleme alanlarından birine yavaşça pipetleyin. Burada, boyanmamış transdüksiyon yapılmamış kontrol hücreleri A bölmesine ve boyanmış GFP eksprese eden hücreler B bölmesine yüklenir. GFP eksprese eden hücrelerde bir canlılık analizi gerçekleştirmek için sitometrenin ana ekranındaki G-F-P-R-F-P seçeneğine dokunun. Ardından sağ tarafta analiz seçenekleri görünecektir; GFP artı canlılık seçeneğini seçin.Cihaz daha sonra, örnek serisine isim verilip verilmeyeceğini soracaktır. "Şimdi isimlendir" (name now) seçeneğine basın. Ardından dokunmatik ekranı kullanarak örnek serisinin adını yazın ve "kaydet" (save) seçeneğine basın; tally sitometre otomatik olarak ölçüm ekranına geçecektir.Ardından, arka plan floresansını ölçmek için, burada görüldüğü gibi ölçüm ekranının sağ alt yarısındaki arka plan sekmesine basın. Varsayılan ayar, dokuz hücre alanının görüntüleneceğini belirtir. Şimdi, kontrol örneği cihaza bakmayacak şekilde, lamı yükleme portuna durana kadar yerleştirin.Yeni boyanmamış hücre kontrolünü yerleştirmek için arka plan ekranındaki dokunmatik basma noktasına kuvvet uygulamayın. Lam otomatik olarak cihazın içine çekilecek ve hücrelerin canlı görüntüsü ekranda görüntülenecektir. Odaklama yaparken, odak düğmesini kullanarak hücreleri uygun görüş düzlemine getirin.Kırmızı yakınlaştırma düğmesini 4x veya 16x konumuna kaydırın. Hücre popülasyonunu daha iyi görebilmek için, hücrelerin her birinin etrafında parlak bir hale ile birlikte tek biçimle koyu renkli görünmesi gerekir. Burada gösterildiği gibi, arka plan ile hücrelerin kenarları arasındaki geçiş bulanık olduğunda ve hücre sınırları belirgin olarak tanımlanamadığında, hücreler eksik sayılabilir.Hücrelerin merkezleri parlak ve çevreleri koyu olduğunda, sayıları olduğundan fazla çıkabilir. Hücreler odaklandıktan sonra, boyanmamış hücre kontrolünü çalıştırmak için dokunmatik ekrana basın. Arka plan floresansını ölçmek için sitometre otomatik olarak görüntüler yakalayacak ve her bir görüş alanının küçük resimlerini görüntüleyecektir.İlerleme çubuğu, analize ilişkin sürekli bir güncelleme sağlar. Görüntü yakalama işlemi tamamlandıktan sonra, sitometre lamı otomatik olarak dışarı çıkarır ve yakalanan görüntülerin analizinden elde edilen verileri sunar. Kaydedilen veriler, arka plan sekmesinin açılır menüsünde görüntülenir.Arka plan kontrol örneğine, deneye verilen ismin aynısı atanacaktır. PI ile boyanmış GFP transduksiyonlu örneği çalıştırmak için lamı cihazdan çıkarın, ters çevirin ve transduksiyonlu örnek cihaza bakmayacak şekilde yeniden yerleştirin. Örnek sekmesine basın ve ardından yeni örneği yerleştirmek için "press" seçeneğine dokunun.Görüntü ekranda belirdiğinde, hücreleri odaklamak için odaklama düğmesini kullanın. Daha önce olduğu gibi, ardından örneği çalıştırmak için dokunmatik basma düğmesine basın. Görüntü yakalama tamamlandıktan sonra, analizden elde edilen veriler örnek sekmesi altında görünür ve sitometre lamı otomatik olarak uygun şekilde dışarı atar.Hücre sayım analiz lamını imha edin. Biyotehlikeli atık oldukları için bu lamlar yeniden kullanılamaz. Örnek çalıştırıldıktan sonra, örneğe eşik değerleri uygulanabilir.Burada belirli hücre popülasyonlarını analiz etmek için, canlı ve ölü hücrelerin yüzdesini belirlemek amacıyla eşik değerlerini ayarlayacağız. Örnek sekmesi altında GFP eksprese eden hücrelerde; GFP eksprese eden canlı hücrelerin sayısı ve yüzdesi, GFP eksprese eden ölü hücrelerin sayısı ve yüzdesi ve toplam canlılık oranı yer alır. Ortalama hücre boyutu, sayılan hücre sayısı ve hücre konsantrasyonu görüntülenir.Ek olarak, ekranın alt kısmında hücre boyutunu, yeşil floresans ve kırmızı floresansı gösteren histogram grafikleri yer almaktadır. Hücre boyutu geçidini (gate) ayarlamak ve kalıntıları dışlamak için hücre boyutu küçük resmine dokunarak hücre boyutu histogramını açın. Hem büyük hem de küçük olayları dışlamak için mavi sürgü çubuklarını hareket ettirin.Kapılar içindeki hücreleri dahil etmek için "apply" (uygula) seçeneğine dokunun. Analize GFP floresansını eklemek için GFP histogram önizlemesine dokunarak onu açın.Eşiği en sönük pikinin hemen sağına ayarlamak için mavi sürgü çubuğunu hareket ettirin. Kontrol örneğini kılavuz olarak kullanın. Bu işlem, analizin GFP pozitif hücreleri dahil etmesini, ancak otofloresan hücreleri hariç tutmasını sağlar.Hücre içindeki biyolojik moleküllerle karşılaşıldığında sıklıkla otofloresans gözlemlenir; onaylamak ve önceki ekrana dönmek için dokunun. Örnek sekmesi altında görüntülenen veriler artık her iki floresan kanal için ayarlanan kapı ve eşikleri yansıtmalıdır. Ardından, PI boyalı hücreleri otofloresanstan veya örnekte bulunan herhangi bir arka plandan ayırmak için PI histogram küçük resmine basarak onu tekrar açın.Kontrol örnek piki, histogramda gri bir pik olarak görüntülenecektir. Kırmızı pik, örnek floresansını temsil eder. Arka plan floresansı, bu cihazda sıfır RFU değerine en yakın pik olarak görüntülenir.PI kanalındaki arka plan floresansını gidermek için eşik değerini ayarlamak üzere mavi sürgü çubuğunu hareket ettirin. Bu piki hariç tutmak için, kontrol örneğindeki gri piki referans olarak kullanın. PI kanalındaki eşik değeri uygun şekilde ayarlandığında, onaylamak ve önceki ekrana dönmek için uygula düğmesine dokunun; sayım cihazı verileri otomatik olarak yeniden analiz edecek ve örnek sekmesindeki sonuçları güncelleyecektir.Ardından, her hücrenin doğru şekilde atandığını görsel olarak doğrulamak için yakınlaştırma sekmesine basın, ardından incelemek için yakalanmış bir görüş alanını görüntü küçük resmine basarak seçin. Sonra katmanlar sekmesine basın. Ardından, o kanal aracılığıyla yakalanan görüntüyü görüntülemek için GFP veya PI düğmesine basın.Katmanı ekrandan kaldırmak için aynı düğmeye tekrar basın veya katmanları üst üste bindirmek için her bir kanala karşılık gelen düğmelere dokunarak hücrelerin belirli bir kanal üzerinden nasıl sayıldığını belirleyin. Yalnızca parlak alan kanalı üzerinden sayılan ve floresan eksprese etmeyen hücrelerin etrafındaki dairelere dokunulduğunda bunlar mavi renkle çevrelenecektir. Bu, belirli bir hücrenin yeşil kanalda ekspresyon gösteren canlı hücreler olduğunu belirtir.Kırmızı kanalda eksprese olan GFP'li hücreler yeşil daire içine alınacaktır. PI ile boyananlar kırmızı daire içine alınacak olup bunlar her ikisinde de sayılan ölü hücrelerdir. Hem kırmızı hem de yeşil kanaldakiler sarı daire içine alınacaktır.Bu durum, hücrenin GFP eksprese ettiğini ancak aynı zamanda pi ile boyandığını ve dolayısıyla ölü olduğunu gösterir. Ekran üzerinde ara sıra siyah daireler görünebilir. Bunlar, tanımlanmış olan ancak hücre boyutuna bağlı olarak analiz dışında tutulmuş nesnelerdir.Floresans ifade eden her hücre uygun renkle daire içine alınana kadar, az önce açıklanan adımları kullanarak floresans histogramındaki eşiği hassas bir şekilde ayarlamaya devam edin. Tüm analiz parametreleri cihazın veri sekmesi altına otomatik olarak kaydedilir.Sayımlama sistemi 500 örnek çalışmadan gelen veri dosyalarını saklayabilir. Veri sekmesinde saklanan her dosya yeniden analiz için uygundur. Dosya veri sekmesinden seçildiğinde, dosya yeniden açılır ve verileri arşivlemek ve raporlar oluşturmak için tüm histogramlar ve katmanlar aktif hale gelir.Cihazda depolanan veriler, bir USB sürücü kullanılarak bilgisayara aktarılabilir. Dört temsilci hücre tipi, nükleer hedeflenmiş hücre ışığı GFP viral konstrüktü ile transdüse edilmiş, dead cell red reaktifi içeren tally viability kiti ile boyanmış ve burada gösterildiği gibi bir akış sitometresinde tally ile analiz edilmiştir. Her iki yöntem de her bir hücre tipi için GFP eksprese eden popülasyonun yaklaşık olarak aynı yüzdesini ve toplam popülasyonun hem canlı olup hem de GFP eksprese eden kısmının yüzdesini raporlamıştır.Bu veriler, Tali sitometresinin bir popülasyondaki toplam GFP ekspresyonu ile canlı popülasyondaki GFP ekspresyonunu ayırt edebildiğini kanıtlamaktadır. Hücre örneğinizdeki floresan ekspresyonunu ve canlılığı değerlendirmek için Tali görüntü tabanlı sitometrenin nasıl kullanılacağını göstermiş olduk. Bu teknoloji, bireysel hücre çalışmaları ile popülasyon bazlı hücre çalışmaları arasındaki boşluğu doldurmaktadır.Tally görüntü tabanlı sitometre kullanarak, bireysel hücrelerin yanı sıra daha geniş hücre popülasyonları hakkında kantitatif ve kalitatif görsel bilgiler toplayabilirsiniz. Aynı prosedür kullanılarak; apoptoz, RFP ekspresyonu ve hücre canlılığı dahil olmak üzere birçok farklı analiz gerçekleştirilebilir. Ekspresyon göstermeyen hücreler için potansiyel uygulamalar, gen ekspresyonu değerlendirmesinden ilaç etkinliği çalışmalarına kadar geniş bir yelpazeyi kapsamaktadır.

assessment-gfp-expression-viability-using-tali-image-based

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz giriş, izleme ve bitki hücrelerinde GFP ifade kantitatif analizi için bir yöntem raporu. Bu yöntem, zaman içinde, çok sayıda örneklerin yarı-sürekli bir resim koleksiyonu için özel olarak tasarlanmış bir robotik sistem kullanır. Ayrıca görüntü serisi analizi için ImageJ ve ImageReady kullanımını göstermek.

Bitkisel Dokular Gen İfade Araştırmalar Robotik ve Dinamik Görüntü Analizi

Bu protokol bir FRET tabanlı yakınlık tahlil kullanarak nasıl görüntü protein-protein etkileşimleri açıklar.

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Canlı hücre döngüsü analizi için bir...

Canlı Hücre Döngüsü Analizi<em&gt; Drosophila</emAkort Akustik Odaklama Sitometreyi ve Vybrant DyeCycle Violet DNA Leke kullanarak&gt; Dokular

Kompleks doku kitleleri, organlardan tümörler, çeşitli hücresel elemanların oluşmaktadır. Bu hücre köken hem de protein ekspresyonu göre hücre özelliklerini deşifre spektral unmixing ardından çok parametreli immünofloresan boyama ile bir arada çok etiketli floresan transgenik fareler kullanılarak bir doku içinde hücre fenotipleri katkısını açıklanacaktır.

Hücre Origins, Türleri ve Etkileşimler Görselleştirme için Floresan Doku Nakli ardından Kantitatif Çokspektrumlu Analizi

Floresan işaretli hücrelerin çoğaltılmış görüntü tabanlı analiz sağlayan esnek bir bilişim iş akışı sundu. iş akışı nükleer ve sitoplazmik belirteçleri rakamlarla ve bu bölmeleri arasındaki işaretleyici translokasyonu hesaplar. Prosedürler 96 oyuklu formatta indirek immunofloresan ile işaret tespiti için siRNA ve güvenilir bir yöntem kullanarak hücrelerin pertürbasyon verilmiştir.

Yüksek içerik, Open Source Software tarafından desteklenen Evrensel Mikroskop Verilerden Floresan Göstergeler, Bireysel Hücre Niceleme için iş akışı

Hücre altı düzeyde, sinyal olayları gelişimsel ve çevresel ipuçları tarafından dinamik olarak modüle edilir. Burada, dinamik protein-protein etkileşimini izlemek ve bitki hücrelerinde sinyal iletiminin uzamsal organizasyonunu açıklamak için tütün geçici ekspresyon sistemini kullanan bir protokolü açıklıyoruz.

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Biz Förster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı readouts kullanarak protein etkileşimleri tahlil için otomatik floresans ömrü görüntüleme (Flim) kullanan açık kaynak kodlu bir yüksek içerik analizi (HCA) aleti sunuyoruz. Bu openFLIM-HCA cihaz için veri toplama yazılımı μManager yazılır ve veri analizi FLIMfit üstlenilmiştir tarafından kontrol edilir.

Otomatik Flüoresans Ömrü Görüntüleme Mikroskopi kullanmak Open Source Yüksek İçerik Analizi

Canlı hücre görüntüleme bilgi hazinesi tek hücreler veya tüm nüfus üzerinde ulaşılamaz olan sabit hücre tek başına Imaging tarafından sağlar. Burada, hücre kader kararlar tedavi Anti-Mitotik uyuşturucu Paklitaksel ile aşağıdaki değerlendirmek için canlı hücre görüntüleme iletişim kuralları açıklanır.

Uzun vadeli canlı hücre kader Paklitaksel karşılık olarak değerlendirmek için Imaging hücreli

Optogenetik, geniş kapsamlı uygulamalara sahip güçlü bir araçtır. Bu protokol, mavi ışığa duyarlı TAEL/C120 sistemini kullanarak zebra balığı embriyolarında ışık indüklenmez gen ekspresyonuna nasıl ulaşılacağını göstermektedir.

Optogenetik TAEL/C120 Sistemini Kullanan Zebra Balığı Embriyolarında Işık Kaynaklı GFP İfadesi

Canlı Drosophila kanadı hayali disklerindeki bitişik epitel tabakalarındaki hücreler arasındaki temasları GFP sulandırma tabanlı bir yaklaşım kullanarak ölçmek için bir protokol açıklıyoruz.

Canlı Drosophila Wing Hayalinal Disklerde Sitonemlerin Aracılık Ettiği Hücre-Hücre Temasını Değerlendirmek için GFP Tamamlama Tabanlı Çift İfade Sistemi

Öğrenin, Tali Görüntü Tabanlı Sitometre kullanarak GFP ifadeli hücrelerde canlılık değerlendirmesi yapmayı. Bu yöntem, hem nicel hem de görsel veri sağlayarak hücre popülasyonlarını hızlıca analiz etmenizi sağlar.

Tali Görüntü Tabanlı Sitometre kullanarak GFP İfade ve Canlılık Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet