Immünohistolojik Duyusal Nöron Dendritler Mikrotübüller Etiketleme, trakea ve kaslar Drosophila Larva Vücut Duvar

Bu prosedürün genel amacı, erken evre drosophila larvasındaki duyusal nöronların dendritlerindeki mikrotübülleri etiketlemektir. Bu, önce bir larvayı manyetik bir diseksiyon odasına sıkıştırarak, ardından hızlı bir şekilde bir larva filetosuna diseke ederek gerçekleştirilir. Sonra hala manyetik odada, fileto hemen sabitlenir ve immünostain.

Son adım, dokuyu monte etmektir, konfokal immünofloresan mikroskobu daha sonra dopaminerjik duyusal nöronun dendritlerindeki mikro tubial dağılımı ortaya çıkarabilir. Merhaba, benim adım Ol Kareem. Bugün, larva vücut duvarındaki duyusal nöro dendritler, trakea ve kaslardaki mikrotübüllerin immünohistolojik etiketlemesi için bir protokol göstereceğim.

Bu yöntem, periferik sensör nöronlarındaki Myco TL organizasyonu hakkında bilgi sağlamak için tasarlanmıştır. Ek olarak, başlamadan önce Myco TL ağlarının ve larva vücut duvarının diğer hücre tiplerinin ve dokularının incelenmesine uygulanabilir. Bu protokolün başlamasından hemen önce fiksatif maddenin taze hale getirilmesi bu protokolün başarısı için kritik öneme sahiptir.

Hisse senedinin genetik geçmişi de kritiktir. Örneğin, dendritik arborizasyon nöronlarını incelemek için, MCDA kiraz veya MCDA, RA turuncu gibi bu nöronların zarlarında bir etiket ifade eden hayvanları seçin. Bir saç halkası kullanarak, ilk instar larvalarını hızlı bir şekilde suda yıkayın ve ardından diseksiyon odasına taşıyın.

Şimdi ventral küme nöronlarını incelemek için, larvaların dorsal tarafını yukarı ve ventral tarafı camın üzerine yönlendirin. Dorsal küme nöronlarını incelemek için, bir böcek pimi kullanarak oryantasyonu ters çevirin, ön ucu ağız kancalarının yanına sabitleyin. En iyi sonuçlar için pimi uca yakın yerleştirin.

Mikro, üçlü ağlar ve özellikle sensörlü DDR'dekiler, diseksiyonun başlamasından sonra hızla bozulacaktır. İlk diseksiyonun sağlanması ve hızlı fiksasyonun sağlanması bu protokolün başarısında anahtar faktörlerdir. Larvaların en arka ucunu forseps kullanarak mikro makasla kesin.

Yeni açıklıktan çıkan bağırsak dokusunu alın ve tüm bağırsağı nazikçe dışarı çekin. Şimdi mikro makasla, aynı açıklığa bir bıçak sokun ve ventral orta hat boyunca öne doğru kesin. Şimdi şimdi boş olan arka köşeleri sabitleyin ve gerekirse larva filetosunu nazikçe gererek açın.

Kalan iç organları hızla temizlemek. Ardından hemen fiksasyona devam edin. Kırılgan mikrotübülleri korumak için.

Kalsiyum içermeyen HL 3.1 tamponunu bir pipet kullanarak aspire ederek başlayın ve hazneyi hemen yeni hazırlanmış fiksatifle doldurun. Farklı bir pipet kullanarak, bu seyreltilmiş fiksatifi hemen değiştirin. Taze fiksatif ile, Tüm sabitleme ve ayakta durma adımları diseksiyon odasında gerçekleştirilir.

Bu işlem sırasında, bu MEL olarak lavı tutan böcek pimlerini doku hasarına çarpmamaya dikkat edin. Şimdi fiksasyonu sonlandırmak için fiksasyonun oda sıcaklığında 20 dakika boyunca rahatsız edilmeden ilerlemesine izin verin. Larva filetosunu yıkama başına 10 dakika boyunca PBST ile altı kez yıkayın.

Böylece larvalar, oda sıcaklığında toplam bir saat boyunca fiksatiften arındırılır. İnkübasyonlar sırasında ajitasyon gereksizdir ve yanlışlıkla doku hasarına neden olması muhtemeldir. Boyamaya hazırlanmak için, PBST'nin son yıkamasını çıkarın ve hazneyi PBST'de% 5 Keçi serumu ile doldurarak sabit filetoyu bloke edin, bloke etme solüsyonunu PBST'de% 5 keçi serumu içinde seyreltilmiş birincil antikorlarla değiştirin.

Kullanılan birincil antikorlar, deneyin kurumasını önlemek için her ikisi de bir ila 1000 oranında seyreltilmiş fare, antifa, tubulin ve sıçan anti CD sekizdir. Hazneyi nemli dokulu plastik bir kaba yerleştirin. Filetoyu antikorlarda dört santigrat derecede en az 16 saat inkübe edin.

Ertesi gün, bağlanmamış primer antikorları, fiksatifi çıkarmak için yapıldığı gibi, yıkama başına 10 dakika boyunca altı yıkama PBST ile temizleyin. Bir saatlik PBST yıkamasından sonra, PBST'de% 5 keçi serumu içinde seyreltilmiş ikincil antikor çözeltisini ekleyin. Bu örnekte, antikorlar LOR 4 88, anti fare IgG ve P SI üç anti sıçan IgG'dir, Fluor dört foto ağartmayı önlemek için bu noktadan itibaren odayı kaplar, daha sonra filetoyu ikincil olarak ya oda sıcaklığında iki saat ya da gece boyunca dört santigrat derecede inkübe eder, ardından oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe eder.

İkincil antikor inkübasyonundan sonra, bağlanmamış antikorları, yıkama başına 10 dakika boyunca PBST'de altı yıkamadan oluşan aynı titiz programla temizleyin. Artık fileto hızlı bir montaj için montaja hazırdır, dokuyu forseps kullanarak% 80'lik küçük bir gliserol damlasına batırın. Ön ucun en ucunu ağız kancalarının yanından kavrayın ve bir kayar kütikül tarafına aktarın, kapağı aşağı gelecek şekilde kaydırın, daha iyi doku temizliği ve kalıcı, stabil bir numune için kapak kaymasının kenarlarını oje ile kapatın.

Dağ DPX Daha önce tarif edildiği gibi, floresan boyama, bir dendrit çardak içindeki farklı dalların, bir birinci instar larvasından dördüncü sınıf bir DA nöronunun bir çardağında farklı hücre iskeleti organizasyonuna sahip olduğunu, ana dalların tübülin için pozitif olduğunu ortaya koydu. Bazı ince yan dallar, bir sınıf DA nöronunun benzer bir şekilde boyanması yoluyla bir film haline getirilen seri kesitlerin bir araya getirilmesi olmasa da, çevre dokulardaki tübülin immüno-boyaması mikro tüp organizasyonunun ve nöronların analizini yaptığında daha belirgindir. Zor fare anti-yağ tübülini, bir ila 1000 oranında seyreltilmiş nöron spesifik fare antich ile ikame edilebilir.

Dört sınıf nöronun ana dalları fch pozitiftir. Bazı ince yan dallar ise fch negatiftir. Vücut duvarı kaslarının seri bölümlerinin bir araya getirilmesi, bu dokudaki mikrotübül ağlarını ortaya çıkardı.

Vücut duvarı kasları ve trakea boyunca kesitli birkaç konfokal bölümün izdüşümü, bu dokulardaki karmaşık mikrotübül ağlarını gösterdi. Vücut duvarında biten bir trakeal sonla birlikte seri kesitlerden oluşan bir araya getirilen kas, mikro tubial organizasyonun inceliklerini ortaya çıkardı. Dolayısıyla, bu prosedürün larva üretimi, periferik sensör nöronu, genetik MX'ler gibi diğer yöntemlerle kombinasyonu, dendritlerde mikro TL organizasyonunu hangi mekanizmaların kontrol ettiği gibi ek sorulara cevap verebilir.