Segmentasyon ve Mürin Obezite Modelleri Yağ Hacimleri ölçümü X-ray Bilgisayarlı Tomografi Kullanımı

Bu prosedürün genel amacı, canlı farelerin yağ içeriğini non-invaziv olarak görüntülemek, nicelleştirmek ve görselleştirmektir. Bu işlem, öncelikle farenin X-ışını BT taramasının yapılmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, radyo yoğunluğa dayanarak fare içindeki yağ hacimlerini segmente etmek ve nicelleştirmektir.

Üçüncü adım, yağ hacimlerinin kırmızıyla vurgulandığı CT verilerini üç boyutlu olarak görselleştirmektir. Sonuç olarak, PMOD ve vol view yazılım paketleri ile birlikte albia X-ray ct kullanılarak, boylamsal in vivo çalışmalar sırasında yağ içeriğinin miktar tayini ve görselleştirilmesi sağlanabilir. Bu tekniğin X vivo analiz gibi mevcut yöntemlere karşı temel avantajlarından biri, küçük hayvan hastalık modellerinde yağın non-invaziv ve boylamsal değerlendirmesine olanak tanımasıdır.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, segmentasyon ve görselleştirme protokolü art arda tamamlanması gereken birkaç adım içerdiği için zorluk yaşayabilirler. Ayrıca, görüntüleme sırasında optimal x-ışını parametreleri kullanılmalıdır. Adipoz dokudan en iyi kontrastı elde etmek için, öncelikle ilgili obez fareleri bir indüksiyon odası kullanarak anestezi altına alın ve ardından bir burun konisine aktarın.

Görüntüleme sırasında anesteziyi sürdürün ve fareleri, ekstremiteler gövdenin yan taraflarına gelecek şekilde standart bir sıçan yatağına yerleştirin. Bu, tekdüze bir BT alımı sağlar. BT sistemini, 600 projeksiyon kullanarak 115 milimetre uzunluğundaki bir yatağı tarayacak şekilde ayarlayın.

X-ışını kaynağını 200 µA ve 45 kVp değerine ayarlayın ve demeti sertleştirmek için 0,5 mm alüminyum filtre kullanın. Bu ayarlar için farenin alacağı eşdeğer radyasyon derin doz yaklaşık 220 mSv iken, bilgisayardaki yüzeysel doz eşdeğeri 357,4 mSv'dir. Görüntü rekonstrüksiyonu için standart parametreleri kullanarak FBP algoritmasını seçin.

Nihayetinde, final görüntü 125 mikron izotropik voksellerden oluşur ve tüm hayvan görüntü analizleri için kullanılabilir. Görüntü analizi PMOD analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir; PMOD önce görüntüleri doku yoğunluğuna göre bölümlere ayırır, ardından yağ hacmini belirler. Görüntü yüklendikten sonra, hesaplama gereksinimlerini en aza indirmek için boyutunu küçültün.

Ana görünüm sekmesine gidin, araçları ve ardından azalt seçeneğini belirleyin. Azaltma değerlerini X için iki, Y için iki ve z için iki olarak ayarlayın, onaylayın, değiştirin ve işlemi çalıştırın. İşlem tamamlandığında bir mesaj kutusu belirir.

Görüntülerden yatak ve burun konisi unsurlarını çıkarmak için, VOI analizinden önce bunları maskeleyin. Düzlem düzenleri, rotasyonlar, ayna 3D işaretçileri kısmına gidin ve düzlemleri ve düzenleri seçin. Z düzlemini göster seçeneğini seçin. Ardından Z düzleminde burun konisine doğru kaydırın.

Ardından, ana VOI sekmesini seçin ve köşeleri çiz (draw vertices) seçeneğini belirleyin. Yatak ve burun konisini hariç tutarak burnun etrafına bir ROI çizin ve gerçek ROI'yi birbirine kopyala (copy actual ROI to each other) seçeneğini belirleyin. Burun konisi elementi ile dilimleyin.

Buffer'daki ROI'yi gerektiği gibi burun üzerine yapıştırın. ROI'leri ayarlamak için köşe noktaları düzenleme grubunu düzenle komutunu kullanın. Burun konileri artık görünmediğinde, ROI'yi silin ve hayvan çevresini kapsayacak bir VOI oluşturun.

VOI araçlarına, ardından maskeleme ve cebir (algebra) seçeneklerine gidin. Sağlanan iletişim kutusuna -1000 değerini girin. Daha sonra "Mask voxels outside the selected vois" (Seçili VOI'lerin dışındaki vokselleleri maskele) yazan düğmeyi seçin.

Ekranınızda geri döndürülemez veri işlemi, devam etmek istiyor musunuz mesajı görüntülendiğinde evet'i seçin. Şimdi düzlem yerleşimleri (planes layouts), rotasyonlar (rotations), 3D işaretçileri aynalama (mirror 3D markers) ve son olarak düzlemler ve yerleşimler (planes and layouts) bölümlerine gidin. Tüm düzlemleri göster (show all planes) seçeneğini belirleyin.

VOI'nin bütünlüğünü inceleyin. VOI uygun göründüğünde, bunu bir analiz dosyası olarak kaydedin ve dosya adı ön ekini değiştirin. Toplam hayvan hacmi için görüntüyü bölümlendirme işlemine geçin.

Araçlar ve harici öğelerin seçimiyle başlayın. Ardından segmentasyon onay kutusunu seçin. -300 ile +3,500 arasında bir aralık girin ve segmentasyonu çalıştırın.

Ardından, toplam hacmi temsil eden istatistikleri raporlayan VOI istatistiklerini seçin. Bu hacmi not edin. Şimdi, önce bölümlendirilmemiş kütleli görüntüye geri dönerek görüntüyü yağ hacmi için bölümlendirin.

İkinci olarak, kaydedilen kütle veri dosyasını yükleyin ve yükleme penceresindeki analiz (analyze) kutucuğunu işaretleyin. Ardından, araçlar (tools) ve harici (external) seçeneklerini belirleyin. Son olarak, segmentasyon onay kutusunu seçin.

-200 ile -50 arasında bir aralık girin ve segmentasyonu çalıştırın. Sonuçları onayladıktan sonra VOI.Statistics'i seçin. Belirtilen istatistiklerin yağ hacmini temsil ettiğini unutmayın.

Sonuçları analiz edilen formatta kaydedin ve benzersiz bir dosya adı ön eki belirleyin. Ancak, deri veya periferik yoğunluk kalmışsa, VOI analizi için bu bölgeleri ortadan kaldırmak amacıyla erozyon ve dilatasyon protokolünü uygulayın. Kaydetmeden önce, dış araçlar (tools external) sekmesine gidin ve yeni açılan kutudaki morfolojik onay kutusunu seçin.

Erozyon seçeneğini ardından uygulayın. Tamam, morfoloji onay kutusuna dönün ve dilatasyon seçeneğini işaretleyin ve tamam, deri veya periferik yoğunluk sorununun çözüldüğünü kontrol edin ve sonuçları kaydedin. Segmentlere ayrılmış görüntülerin render edilmiş 3B görsel görüntülerini oluşturmak için Volvo view sürüm 3.2 yazılım paketini kullanın.

Analyze formatında kaydedilmiş olan CT veri setini açarak başlayın. Açılır penceredeki varsayılan ayarları kullanın, ardından eklentiler (plugins) menüsünü açarak yardımcı programlar (utility) altından hacimleri birleştir (merge volumes) seçeneğini belirleyin. Bileşenleri yeniden ölçeklendir (rescale components) seçeneğinin işaretini kaldırın.

İkinci girişi ata (assign Second input) seçeneğine tıklayın. İkinci giriş için segmente edilmiş yağ verilerini seçin ve açılır penceredeki varsayılan ayarları kullanın. Ardından, denek farenin daha geniş bir görünümünü elde etmek için eklentiyi uygulayın.

Hacim görünüm penceresine çift tıklayın. Renk/opaklık (color slash opacity) sekmesine geri dönün. Bileşen (component) açılır kutusu, şu anda hangi veri setinin düzenlendiğini belirtir.

Sekmenin alt kısmında iki sürgü yer almaktadır. Bu sürgüler, sıfır ile bir arasındaki değerleri kullanarak bindirme içerisindeki her bir bileşen veri setinin bağıl parlaklığını belirler. Örneğin, rengi gri tonlamaya değiştirmek için skalar renk eşleme bölümüne gidin.

Sürgülerden birine çift tıklayın ve onu kutunun dışına sürükleyin. Sürgü alanında herhangi bir yere tıklayarak ikinci bir sürgü ekleyin. Soldaki renk sürgüsünü siyah, sağdaki renk sürgüsünü ise beyaz yapın.

Ardından, skaler opaklık eşleme kutusuna gidin ve kutu içinde tıklayarak yeni bir nokta oluşturun. Bu işlem, orta nokta için pencerede toplam üç nokta sağlayacaktır. Skaler değeri yaklaşık -3000 olarak ve opaklık değerini sıfır olarak değiştirin.

Pencerenin sağındaki üçüncü noktanın skaler değerini yaklaşık 32.000'e ve opaklığını 0,25'e getirin. Birinci nokta, opaklık değeri sıfır olarak ayarlandığı sürece sol tarafta herhangi bir yerde olabilir. Skaler değer ayarlandığında, yağın görünümünü düzenlemesi gereken ikinci bileşene geçin; renk sürgülerinin her birine çift tıklayıp ton (H) sürgüsünü sona kaydırarak rengi kırmızıya çevirin.

Bu işlem yağ dokusunu kırmızıya boyar. CT yağ dokusunu ve üzerine bindirmeyi gösteren üç panelli bir rotasyon videosu oluşturmak için öncelikle denek faresini sırtı U'ya bakacak şekilde dik konuma getirmek için tıklayın ve sürükleyin. İkinci olarak, bileşen ağırlıkları (component weights) kısmından, yalnızca CT taramasının görüntülenmesi için ikinci bileşenin değerini sıfır olarak ayarlayın. Üçüncü olarak, inceleme (review) ardından kamera (camera) seçeneğine tıklayın ve rotasyon videosu için kare sayısı belirleyin. Dördüncü olarak, X rotasyon değerini 360 derece olarak değiştirin.

Açılır iletişim kutusundan beşinci seçeneği belirleyin. CT adında yeni bir klasör oluşturun ve dosyayı, bir dizi rotasyon görüntüsü çıktılayacak olan TIF formatında kaydedin. Bu adımları yağ görüntüsü ve üst üste bindirilmiş yağ CT görüntüsü için de tekrarlayın; çıktı görüntülerinden bir rotasyon filmi oluşturmak için bunların rotasyon görüntülerini kendi klasörlerine kaydedin, ardından Image J'yi açın ve görüntü dizilerini içe aktarın.

CT klasöründeki ilk görüntüyü seçin; diğerleri otomatik olarak seçilecektir. Bu işlemi, yığınlardan biriyle yağ ve overlay sekansları için tekrarlayın. Hala açık.

ROI yöneticisini açın. Analiz araçları (analyze tools) altında bulunan ROI yöneticisine girin ve gereksiz arka plan piksellerini hariç tutacak şekilde denek fare etrafına bir ROI çizin. İşlem tamamlandığında, ROI yöneticisindeki ekle (add) düğmesine tıklayın.

Ardından, her görüntü dizisine aynı ROI'yi uygulayın. ROI tüm yığınlarda olduğunda, sağ tıklayın. ROI seçimi içerisinden kopyasını oluştur (duplicate) seçeneğini işaretleyin ve seçin. Kopyalanan yığını kontrol edin.

Bu işlem, ROI'yi görüntünün geri kalanından ayırır. Şimdi daha büyük görüntü yığınlarını kapatın ve bu işlemi her üç görüntü dizisi için tekrarlayın. Yığınları birleştirmek için, stacks (yığınlar) altındaki tools (araçlar) kısmında bulunan combine (birleştir) komutunu kullanın.

Birinci yığın için CT yığınını ve ikinci yığın için yağ yığınını seçin. Ardından işlemi tekrarlayın. Birinci yığın için yeni birleştirilmiş yığınları ve ikinci yığın için üst üste bindirme yığınını seçin.

Bu işlem, üç panelli bir görüntü döndürme yığınının oluşturulmasını tamamlar. Görüntü penceresinin sol alt köşesindeki oynat seçeneğine tıklayarak yığını önizleyin. Ardından, bunu bir AVI filmi olarak kaydedin.

Alber CT sisteminin uygulanabilirliğini göstermek için obez B6 LE OB J fareler kullanılmıştır. CT tabanlı yağ içeriği ölçümleri için bu fareler, C57BL/6 vahşi tip farelerle karşılaştırılmıştır. Solda, obez bir farenin toplam CT hacmi görülmektedir.

Merkezde kırmızı renkle yağ hacmi, sağda ise üst üste bindirilmiş görüntü yer almaktadır. Yaban tipi hayvanların benzer analizi, obez fareye kıyasla yağ içeriğindeki belirgin farkı göstermektedir. Her bir hayvan için toplam hacim, yağ hacmi ve hacim oranları hesaplanmıştır.

Yaban tipi grup ve obez grup için ortalama yağın toplam hacme oranı sırasıyla 0.09 ve 0.42 idi. Bu değerler 0.001 P değeri ile anlamlı düzeyde farklılık göstermiştir. Bu videoyu izledikten sonra, kişi canlı bir fareye ait bir BT veri seti içerisindeki yağ hacimlerinin nasıl segmente edileceği konusunda, yöntem üzerinde uzmanlaştığında, sağlam bir anlayışa sahip olmalıdır.

Bu tekniğin uygulanması 30 dakikadan az sürmelidir. İzlediğiniz için teşekkürler, bir sonraki seferde tekrar görüşmek üzere.