Yüzey Plasmon Rezonans Host Cytosol Toksin Translokasyon Tespiti

Bu prosedürün genel amacı, sitozole giren toksin havuzunu tespit etmek ve miktarını belirlemektir. Bunu başarmak için, toksin öncelikle 4 °C'de konak hücrenin yüzeyine bağlanır. Ardından bağlanmamış toksin uzaklaştırılır ve hücreler 37 °C'ye ısıtılır; bu işlem toksinin endomembran sistemine ve ardından konak sitozolüne hareket etmesine olanak tanır. Hücre permeasyonunu takiben, plazma membranını seçici olarak permeabilize etmek için digitonin kullanılır.

Hücre ekstraktları, son bir adım olarak diferansiyel santrifüjasyon kullanılarak ayrı membran ve sitozolik fraksiyonlara ayrılır. Sitozol fraksiyonunun, antitoksin antikoru ile kaplanmış bir SPR sensörü üzerinden perfüzyonu yoluyla sitozole toksin girişini tespit etmek ve miktarını belirlemek için yüzey plazmon rezonansı (SPR) kullanılır. Bu yöntem, sitozole toksin girişinin verimliliği ve kinetiği, sitozole giren toksin miktarı ve toksinin sitozole taşınmasının olası ilaç inhibisyonu gibi toksin biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır. Bu protokole başlamadan önce, HeLa hücrelerinin gece boyunca inkübasyonunun ardından, yazılı protokolde açıklandığı şekilde hücre toksikasyonu için HeLa hücrelerini hazırlayın.

Kültür ortamını, mililitrede 100 nanogram Ganglioside GM1 içeren bir mililitre DMEM ile değiştirin ve 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Bu işlem, kolera toksini için bağlanma bölgelerinin sayısını artırır. Toksinin GM1 reseptörü, GM1 çözeltisine maruz kalan hücrelerin plazma membranına yerleşecektir.

Bir saatlik inkübasyonun ardından, içerisinde ortam bulunan GM'yi uzaklaştırın ve hücreleri iki kez DMEM ile yıkayın. Ardından, mililitre başına bir mikrogram kolera toksini içeren bir mililitre DMEM ekleyin ve hücreleri 30 dakika boyunca dört santigrat dereceye yerleştirin. Toksin içeren ortamı uzaklaştırın ve hücreleri iki kez yıkayın.

Ardından hücreleri, 37 °C'de istenen süre boyunca 1 mL DMEM içerisinde inkübe edin. Her kovalama (chase) süresi sonunda hücreleri PBS ile yıkayın ve ardından her kuyucuğu 250 µL 0,5 mM EDTA ve PBS ile inkübe edin. Buz üzerinde 10 dakikalık inkübasyonun ardından, hücreleri bir P 1000 pipet ucu ile güçlü şekilde tritüre ederek altı kuyucuklu plakadan uzaklaştırın.

Hücrelerin bulunduğu bir kuyucuk toplandıktan sonra, aynı koşuldaki ikinci ve ardından üçüncü kuyucukla birleştirin. Daha sonra, üç tekrarlı kuyucuktan elde edilen birleştirilmiş hücre süspansiyonunu tek bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Şimdi, mikro santrifüj tüpünü bir masaüstü mikro santrifüjde beş dakika boyunca döndürün.

5.000 ×g'de, tüm koşullar için yaklaşık olarak aynı boyutta hücre peletleri elde edilmelidir. Süpernatantı uzaklaştırın ve ardından hücre peletini, önceden hazırlanmış ve soğutulmuş 100 µL %0,04'lük digitonin çalışma çözeltisi içerisinde yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 10 dakika boyunca buz üzerinde bekletin; ardından bir masaüstü mikrosantrifüj kullanarak digitonin ile geçirgen hale gelen hücreleri 16.000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatan fraksiyonunu içeren sitozolu yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve organelleri içeren pelet fraksiyonunu saklayın. SPR toksin standartları, HCN tamponu içerisinde 110, 1 ve 0,1 ng/mL konsantrasyonlarında hazırlanır; örnekler, sitozol içeren süpernatan fraksiyonların HCN tamponu ile 1 mL son hacme dilüe edilmesiyle hazırlanır. Enjeksiyondan önce 500 µL örnek döngüsünden havanın tamamen tahliye edildiğinden emin olmak için en az 1 mL örnek hacmi gereklidir; organelleri içeren pelet fraksiyonları, %1 Triton X 100 içeren 1 mL HCN tamponu içerisinde yeniden süspanse edilir.

Membranla çevrili toksin havuzunu serbest bırakmak için deterjan eklenmesi gereklidir. Ayrıca, fraksiyonlama prosedürünün doğruluğunu onaylamak için bir kontrol deneyi amacıyla paralel sitozolik ve organ L fraksiyon setleri hazırlayın; sitozolik fraksiyonu 20 µL dört x örnek tamponu içinde, organ L fraksiyonunu ise 120 µL bir x örnek tamponu içinde yeniden süspande edin; her bir fraksiyonun eşdeğer hacimlerini sodyum ESAL sülfat poliakrilamid jel elektroforezi ile ayırın ve sitozolik bir proteinin üst faz fraksiyonunda ve çözünür rezonan ER proteininin pellet fraksiyonunda ayrıştığını göstermek için Western blood analizi ile problayın. SPR lamını hazırlamak için önce, kendi kendine düzenlenen bir monoton tabakaya sahip altın kaplama bir cam lamı SPR cihazına yerleştirin.

Sensör lamı, E-D-C-N-H-S çözeltisini 41 µL/dk akış hızında 10 dakika boyunca lam üzerinden perfüze ederek aktive edin. Sonraki tüm perfüzyonlarda aynı akış hızını kullanıyoruz. E-D-C-N-H-S aktivasyon tamponunu, plakayı %0,05 2020 içeren PBS ile beş dakika yıkayarak uzaklaştırın.

Plaka, E-D-C-N-H-S çözeltisi ile kapakların açılması sayesinde artık reaktif MI bağlayıcılar içermektedir. Ardından, 20 milimolar sodyum asetat içerisinde 1/20.000 seyreltilmiş bir anti CTA antikoru, aktive edilmiş sensör lamı üzerinden 15 dakika boyunca perfüze edin. pH değişimi nedeniyle, RIU olarak kısaltılan kırılma indisi biriminde başlangıçta bir düşüş görülecektir.

Ardından, antikorun amid reaktif bağlayıcılar tarafından yakalanmasıyla RIU değerinde bir artış gerçekleşecektir. Sensör lam üzerindeki bağlanmamış antikorları, beş dakikalık bir PBST yıkamasıyla uzaklaştırın. Yakalanan antikor tarafından üretilen RIU sinyali platoya ulaşacak ve stabilize olarak yeni bir bazal sinyal sağlayacaktır.

Slayt hazırlığının son aşaması olarak, sensör slaytı üzerinden beş dakika boyunca bir molar etanolamin PERFÜZE edin. Bu işlem, sensör slaytı üzerinde kalan bağlanmamış tüm bağlayıcıları kapatır ve etkisiz hale getirir. RIU sinyali artacaktır; bazal okumayı oluşturmak için antikor kaplı sensör üzerinden beş dakika boyunca PBST perfüze edin.

Ardından, sensör üzerinden 300 saniye boyunca deneysel bir örnek veya toksin standardı perküzyonlayın. Ligandı tampon çözeltiden çıkarın ve sensör üzerinden 200 saniye daha PBST perküzyonlayın. Sensöre bağlı kalan tüm toksinler, pH 5.0'daki PBST ile yapılan 102. yıkama ile uzaklaştırılır.

Bu işlem, sinyali başlangıç baz hattı okumasına döndürerek aynı sensör üzerinde başka bir numunenin işlenmesine olanak tanır. Yeni bir numune yüklemeden önce, önceki numuneden kalan tüm sıvıları dışarı atmak için numune döngüsünden az miktarda hava geçirin. Veri toplama işleminin ardından.

Veriler scrubber two yazılımı ile analiz edilebilir ve şekil hazırlama işlemi için Igor yazılımı kullanılabilir. Pertussis toksini, A zinciri sitozole girmeden önce hücre yüzeyinden ER'ye taşınan bir AB toksinidir. PTs birimi sitozole girer.

SPR tabanlı translokasyon analizi, toksine maruz kalmış CHO hücrelerinin sitozolündeki PT'leri tespit edebilmiştir. Toksine maruz kalmamış hücrelerin sitozolünden herhangi bir sinyal oluşmamış olup, bu durum anti PT'leri doğrulamıştır. Antikorlardan biri, konak sitozolünün bir bileşeni ile çapraz reaksiyona girmemiştir.

Felden varlığında toksik etkiler altındaki hücrelerden elde edilen sitozol fraksiyonu. A da pozitif bir sinyal üretmeyi başaramamıştır, BFA toksinin ER translokasyon bölgesine taşınmasını ve dolayısıyla H zincirinin sitozole iletilmesini engeller. Chole toin, AB tipi başka bir ER transloke olan toksindir.

CT ile işleme tabi tutulmuş helo hücrelerinin sitozolik fraksiyonunda CTA-1 tespit edilmiştir. Bu durum, metodolojinin birden fazla hücre tipiyle çalıştığını ve anti-zincir antikoru mevcut olan herhangi bir toksin için uygulanabileceğini vurgulamıştır. CT ile işleme tabi tutulmuş hücrelerden elde edilen sitozolik fraksiyon, anti-CTB antikoru ile kaplanmış bir SPR sensörü üzerinden perfüze edildiğinde herhangi bir sinyal tespit edilmemiştir; bu da CT A-1 alt biriminin aksine, hücreye bağlanan CTB PENTAMER'inin sitozole girmediğini göstermiştir.

Anti-CTA antikoru ile kaplanmış bir SPR sensörü üzerindeki difüzyonu takiben; organel fraksiyonundan gelen sinyal, sitozolik fraksiyondan gelen daha zayıf sinyale kıyasla ölçeğin dışındadır. Bu durum, CT'nin ER translokasyon bölgesine taşınmasındaki bilinen verimsizlikle uyumludur ve bu durum sırasıyla sitozole ulaşabilen toksin miktarını sınırlar.

Transloke olan sitozolik toksinin zamana bağlı birikimi de izlenebilir. Hücrelerin 4 °C'de CT'ye maruz bırakılmasını takiben, 37 °C'ye ısıtıldıktan 15 dakika sonra sitozolde toksin tespit edilmemiştir.

37 °C'de 30 dakika sonra az miktarda sitozolik toksin tespit edilmiş ve 45 ile 60 dakikalık takip aralıklarından sonra giderek daha fazla miktarda sitozolik toksin saptanmıştır. Bu durum, hücreyle ilişkili toksinin konak sitozole sürekli ve uzun vadeli iletimini kanıtlamaktadır. Deney, sitozole toksin translokasyonunun inhibisyonunu da tespit edebilmektedir; %10 DMSO ile işlem görmüş hücreler, işlenmemiş toksine maruz bırakılmış kontrol hücrelerine kıyasla düşük düzeyde sitozolik CT birimi göstermiş olup bu durum toksinin açılmasının engellendiğini ortaya koymuştur.

Bir zincir, sitozole translokasyon için ön koşuldur, bu nedenle DMSO tarafından indüklenen CT A1 stabilizasyonu, buna bağlı olarak toksinin ER'den sitozole hareketini engellemiştir. Toksin translokasyonunun DMSO ile indüklenen blokajını nicelleştirmek için, bilinen toksin konsantrasyonlarından oluşturulan bir standart eğri kullanılarak hesaplanan sitozolik CTA1 konsantrasyonu; işlem görmemiş hücreler için 0.3 ng/mL ve DMSO ile işlem görmüş hücreler için 0.1 ng/mL olarak bulunmuştur. DMSO'nun CTA1 açılımını inhibe etmesi, böylece CTA1'in ER'den sitozole translokasyonunda üç katlık bir azalma meydana getirmiştir.

Bu prosedürün ardından, sitozolde bulunan toksin miktarı ile toksin aktivitesi arasında doğrudan bir bağlantı kurmak için intoksikasyon assayleri gibi diğer tekniklerden yararlanabileceğiz.