Yanal-flow teknolojisi kullanılarak Hematolojik Malignite Hastalarda invaziv pulmoner aspergillozis Algılama

Bu prosedürün genel amacı, insan serumu ve BAL sıvıları içerisinde aspergillus tanısal antijeninin hızlı tespiti için bir lateral akış cihazının kullanımını göstermektir. Bu işlem, öncelikle serum veya BAL örneğinin lateral akış cihazının salım portuna uygulanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, solüsyonun membran boyunca ilerlemesine izin vermektir.

Bir sonraki adım, iç kontrol hattını inceleyerek testin geçerli olup olmadığını belirlemektir. Son adım ise test hattını inceleyerek test sonucunu yorumlamaktır. Nihayetinde, lateral akış cihazı, serum veya BAL sıvılarında aspergillus tanısal antijeninin varlığını tespit etmek için kullanılır.

Aspergillus LFD, invaziv pulmoner aspergillozis tanısı için yardımcı bir test olarak kullanılabilir. Bu tekniğin aspergillus, galakto, Manan enzim immünosayımı, panf, fundal, beta glukan analizi ve aspergillus PCR testi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, minimum laboratuvar imkanları ve eğitimi gerektiren hızlı bir hasta başı tanı testi olmasıdır. LFD aspergillus türlerinin saptanması için geliştirilmiş olsa da, yan akış teknolojisi cetosporium, fusarium ve riser türleri gibi diğer enfektif patojenlerin saptanmasında da uygulanabilir.

Bu organizmalara özgü monoklonal antikorların dahil edilmesiyle, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır. LFD sonuçlarının yorumlanması, assay formatına aşinalık gerektirdiğinden; tedavi edilmemiş kan örneklerinden serum toplamak için kanın 4 °C'de pıhtılaşmasına izin verilmelidir. Serum ve bronkoalveoler lavaj veya BAL sıvıları, kullanımdan önce -20 °C'de alikotlar halinde saklanmalıdır. Alikotlar halinde saklama, tekrarlayan testler sırasında örneklerin defalarca dondurulup çözülmesiyle hedef antijenin bozunma potansiyelini sınırlar. Serum ve BAL örneklerini test için hazırlamak amacıyla, örnekleri oda sıcaklığında çözün ve ardından buz üzerinde tutun. Vorteksleyerek iyice karıştırın ve ardından 14.000 RPM'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. İnsan örneklerinin rutin testi için, serumu doku kültürü ortamı ile bire bir oranında seyreltin. Alternatif olarak, hedef antijeni serum immün komplekslerinden ayırmak için, serumu %4 EDTA içeren PBS ile bire iki oranında seyreltin, kaynayan su banyosunda üç dakika ısıtın ve 14.000 RPM'de beş dakika santrifüjleyin.

İnsan BAL sıvıları ön işleme gerektirmez. Çözdürülmüş, vorteksle karıştırılmış ve santrifüjlenmiş bir BAL örneği, lateral akış cihazına doğrudan uygulanabilecek temiz bir örnektir. Test işlemi için, lateral akış cihazları (LFD), 12 ay boyunca stabil kaldıkları oda sıcaklığında veya 23 °C'de saklanır.

Analize başlamak için cihazları paketlerinden çıkarın ve düz bir yüzeye yerleştirin. Steril bir pipet ucu kullanarak, saniyeler içerisinde 100 µL ön işlem görmüş serumu cihazın bırakma portuna uygulayın. Sıvı, gözlem penceresindeki nitrocellulose membran boyunca kılcal hareketle ilerlemelidir.

Aynı şekilde, cihazın salım portuna 100 µL saf BAL örneği uygulayın. Analizin oda sıcaklığında 15 dakika boyunca çalışmasına izin verin; bu sürenin sonunda test sonuçları kaydedilmelidir. Sonuçlar kaydedilmeden önce test süresi 15 dakikayı geçmemelidir.

Bu durum sonuçların yorumlanmasını etkileyebileceğinden, inkübasyon süresinin uzatılması zayıf bir reaksiyonu güçlendirmeyecektir. LFD, plastik gövde üzerinde C harfi ile belirtilen bir iç kontrol hattı ve T harfi ile belirtilen bir test hattından oluşur. Kontrol hattı, serum veya BAL örneğinde aspergillus antijeni olup olmadığına bakılmaksızın her zaman görünmelidir. Bu, serum veya BAL örneğinde aspergillus antijeni mevcutsa testin doğru şekilde çalıştığını gösterir.

Test çizgisi de numune uygulamasından sonraki 15 dakika içinde belirecektir. Test ve Lyme reaksiyonlarının yoğunlukları, serum ve VAL numunelerindeki hedef antijen konsantrasyonları ile orantılıdır. Bu prosedürün en zorlayıcı yönü, test sonuçlarının yorumlanmasıdır.

LFD sonuçları 15. dakikada okunmalı ve test sonucu burada gösterilen temsili örnekle karşılaştırılmalıdır. Bu şekilde, BAL ve serum örnekleri ile elde edilen zayıf pozitif, orta derece pozitif ve güçlü pozitif LFD sonuçlarının temsili örnekleri gösterilmiştir. Serum örneğindeki herhangi bir pozitif test çizgisi, yoğunluğuna bakılmaksızın, kan dolaşımında dolaşan aspergillus antijeninin varlığı nedeniyle invaziv pulmoner aspergillosis veya IPA hastalığına işaret eder. BAL reaksiyonlarının pozitif çıkması ise yoğunluğuna bakılmaksızın, sporların çimlendiğini ve akciğerlerde potansiyel olarak patojenik hiflerin geliştiğini gösterir.

Aspergillus antijeni yokluğunda, test çizgisi oluşmayacaktır ve sonuç negatif olarak kaydedilecektir. Bu tablo, Avrupa Kanser Araştırma ve Tedavi Organizasyonu ile Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü Çalışma Grubu'nun tanı kriterlerine göre tanı konmuş akut miyeloid lösemi veya ML hastalarından alınan BAL sıvıları kullanılarak gerçekleştirilen LFD testlerinin sonuçlarını göstermektedir. Bu tabloya, her bir hastaya ait ilgili klinik ve psikolojik verilerin yanı sıra ASPERIA spesifik PCR testi sonuçları da dahil edilmiştir.

2002 E-O-R-T-C-M-S-G kılavuzları uyarınca; 12, 13 ve 16 numaralı hastalara, konak faktörleri ve klinik kriterler veya GM pozitifliği temelinde olası IPA tanısı konulmuştur. Revize edilmiş 2008 E-O-R-T-C-M-S-G kılavuzlarına göre, konak faktörleri ve tek başına GM pozitifliği veya tek başına konak faktörleri ve klinik kriterler, sırasıyla klinik verilerden ve mikolojiden gelen destekleyici kanıtlar eşlik etmediği sürece olası invaziv fungal enfeksiyona işaret etmez. Altı numaralı hastaya, konak faktörleri, majör ve minör klinik özellikler ile GM pozitifliği nedeniyle hem 2002 hem de 2008 kılavuzları kapsamında muhtemel IPA tanısı konulmuştur.

Son olarak, LFD analizi veya PCR analizinin şu an için E-O-R-T-C-M-S-G kılavuzlarında yer almamasına rağmen, altı ve 12 numaralı hastaların BAL örneklerinde, iki analiz ve ticari galaktomannan testi arasında aspergillus antijeni ve nükleik asit varlığını gösteren güçlü bir uyum olduğu görülmektedir. Bu prosedürü takiben, invaziv fungal hastalığı doğrulamak için Platelia Galaktomannan enzim immünosorbisyon analizi, panf, fungal beta-glukan testi veya aspergillus PCR testleri gibi diğer yöntemler paralel olarak uygulanabilir. İnsan kan serumu ve BAL sıvıları ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve cihaz operatörlerinin hepatit B ve tüberküloz gibi hastalıklara karşı her zaman aşılanmış olması gerektiğini unutmayın.