Name: Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Öğrenin kemik iliği hematopoetik kök hücrelerinin manyetik boncuk ayrıştırma ve akış sitometrisi ile izolasyonunu. Bu yöntem yüksek saflıkta hücre sağlar ve fonksiyonel çalışmalar için idealdir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz değerli tavsiye için Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa ve Markus Manz teşekkür ederiz. Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı, İsviçre Kanser Ligi ve Fondazione Ticinese başına la RIcerca sul Cancro tarafından finanse edildi.

1. Kemik İliği gelen Hücre Süspansiyon hazırlanması <ol><li> Fare Euthanize ve karın ve geriye doğru olan paslanmaz pan ve sprey% 70 etanol içinde hayvan yerleştirin. Femur ve tibia arka bacak ve omurga toplayın. </li><li> Doğru sivri uçlu makasla ve bir gazlı bez ile bacak kemiklerinden omurga tüm yumuşak doku artıkları çıkarın. 50 uM β-merkaptoetanol, 100 uM MEM olmayan amino asitler ile desteklenmiş% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal bovin serumu (FBS), 1 mM sodyum piruvat MEM, 2 içeren RPMI medyumu ile 30 ml bir 50 mL Falcon tüp içinde kemiklerin deposunda mM L-glutamin, 100 ug / ml streptomisin ve 100 U / ml penisilin. </li><li> Steril filtrelerle önceden sterilize harç alt örtün. </li><li> Harç haline kemikleri aktarılır ve bir sürtünme yüzeyine monte etmek için bir filtre katmanı ile kapsamaktadır. </li><li> Falcon filtresi ile donatılmış bir 50 ml Falcon tüpü hazırlayın. </li><li> Kemikler parçalamakhomojen bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar bir havaneli yardımıyla. </li><li> Tüpüne süspansiyon aktarın. </li><li> Kalan hücreler yıkayın ve hasat taze RPMI tam orta harç 5 ml ekleyin. </li><li> Homojenize kemikleri net görünmesine kadar son iki nokta tekrarlayın. </li><li> Geriye kalan kalıntı doku ortadan kaldırmak amacıyla hücre süspansiyonu transferi ve yeni bir tüp içinde filtre. </li><li> 5 dakika 1.500 rpm&#39;de santrifüj tüpü ve dikkatli aspirasyon ile süpernatantı kaldırın. Hücre pelletini rahatsız değil emin olun. </li></ol> 2. Fenotipik Analizi <ol><li> Yeniden süspanse ve PBS ile% 2 FBS 15 mL bireysel farelerin hücreleri yıkanır. </li><li> 5 dakika 1.500 rpm&#39;de santrifüj tüpü ve dikkatli aspirasyon ile süpernatantı kaldırın. Pelet rahatsız değil emin olun. </li><li> 5 ml PBS ile% 2 FBS ve sayım hücrelerinde pelet askıya. </li><li> Transferi 1 × 10 6 hücre / 96 kuyu yuvarlak altplakası. </li><li> 5 dakika boyunca 1500 rpm&#39;de santrifüje plakası. </li><li> Aşağıdaki yüzey işaretleyicileri karşı yöneltilmiş mAbs bir karışımı hazırlayın. Bunların seyreltilir olarak PBS ile gösterilir ve% 2 FBS hücreleri leke. <ul type="disc"><li> CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 PE-Cy5 1:200 ile konjuge </li><li> APC 1:100 c-Kit konjuge </li><li> Biotin 1:50 konjuge SCA1 </li><li> FITC 1:50 konjuge CD34 </li><li> PE 1:100 konjuge FcγR </li><li> PE-Cy7 1:100 IL-7R konjuge </li></ul></li><li> Süpernatant atın ve her kuyuya mAbs karması 50 uL ekleyin. Pipetleme tarafından tek hücrelere ayrışır. </li><li> 4 ° C&#39;de karanlıkta 20 dakika süreyle inkübe hücreleri </li><li> PBS 150 uL% 2 FBS ile iki kez yıkanır hücreleri. </li><li> 5 dakika 1.500 rpm&#39;de santrifüj plaka ve tersini plaka ile süpernatantı atın. </li><li> PBS içinde streptavidin seyreltilir ve% 2 FBS gibi hücrelerin leke belirtti. <ul type="disc"><li> Streptavidin conjuAPC-Cy7 1:300 için gated </li></ul></li><li> Her bir kuyucuğa solüsyonu 50 uL ekleyin. Pipetleme tarafından tek hücre süspansiyonu haline ayrışır. </li><li> 4 ° C&#39;de karanlıkta 10 dakika süreyle inkübe hücreleri </li><li> PBS 150 uL% 2 FBS ile iki kez yıkanır hücreleri. </li><li> 5 dakika boyunca 1500 rpm&#39;de santrifüje plakası ve süpernatant atılır. </li><li> PBS ile% 2 FBS 100 ul içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> FACS numune edinin. </li></ol> 3. C-Kit + Hücrelerinin Manyetik Zenginleştirme <ol><li> PBS, pH 7.2, (BSA)% 0.5 sığır serum albümin, ve 2 mM EDTA ihtiva eden bir tampon çözeltisi hazırlayın. </li><li> APC ile konjuge c-Kit mAb ihtiva eden tampon çözeltisi 1 mL, en azından 10 fareden türetilmiş kemik kabak hücre pelletini 01:50 seyreltilmiştir. </li><li> 4 ° C&#39;de karanlıkta 20 dakika süreyle inkübe hücreleri </li><li> Tampon solüsyonu, 40 mL ile iki kez yıkanır hücreleri. </li><li> 5 dakika boyunca 1500 rpm&#39;de santrifüje tüpü ve dikkatli bir şekilde t kaldırmakdiye aspirasyon süpernatant. Pelet rahatsız değil emin olun. </li><li> Pastör pipetiyle hücre pelletini ve pelet doğrudan her ötanazi fare için Anti-APC mikroboncuk 50 ul ekleyin. </li><li> İyice karıştırılır ve 4 ° C&#39;de karanlıkta 20 dakika inkübe edilir ve </li><li> 5 dakika boyunca 1500 rpm&#39;de santrifüj tampon çözeltisi ve 40 mL eklenerek hücrelerin yıkanır. Tamamen süpernatant aspire. </li><li> Her üç fare ötanazi tampon çözelti 4 mL katları şeklinde Pastör pipetiyle hücre pelletini. </li><li> Uygun bir MACS Ayırıcı manyetik alanda Yer MACS LS sütunlar. Her üç fare ötanazi 1 sütun kullanın. </li><li> Tampon çözelti 4 mL ile durulama sütunlar hazırlayın. </li><li> Sütunlar üzerine hücre süspansiyonu uygulayın. </li><li> Geçmesine ve tampon çözelti 4 mL ile sütun yıkayın etiketsiz hücreleri toplayın. Tampon solüsyonu 4 mL üç kez ekleyerek yıkama adımları gerçekleştirmek. Kolon rezervuar boşaltılır yeni tampon ekleyin. </li><li> Ayırıcı ve Plac sütunları çıkarıne 15 ml falcon tüpleri üstündeki her biri. </li><li> Her sütun üzerine tampon solüsyonu 4 ml. Hemen sütuna pistonu iterek manyetik etiketli hücreleri temizler. </li><li> 5 dakika 1.500 rpm&#39;de santrifüj tüpleri ve dikkatli aspirasyon ile süpernatantı kaldırın. </li><li> Tek bir 15 ml Falcon tüp içinde tampon çözelti ve grup peletlerin 1 mL her pelletini. </li></ol> 4. Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage kararlı progenitörlerin Sıralama <ol><li> Aşağıdaki yüzey işaretleyicileri karşı yöneltilmiş mAbs bir karışımı hazırlayın. Bunların seyreltilir gibi hücreler leke 500 uL% 2 ve PBS FBS gösterilir. <ul type="disc"><li> CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 PE-Cy5 1:200 ile konjuge </li><li> APC 1:100 c-Kit konjuge </li><li> Biotin 1:50 Sca-1 konjuge </li><li> FITC 1:50 konjuge CD34 </li><li> PE 1:100 konjuge FcγR </li></ul></li><li> Previou gelen boru santrifüjes 5 dakika 1.500 rpm&#39;de bölümü ve dikkatli aspirasyon ile süpernatantı kaldırın. </li><li> Pelet için mAbs karışımı ekleyin. Pipetleme tarafından tek hücre süspansiyonu haline ayrışır. </li><li> 4 ° C&#39;de karanlıkta 20 dakika süreyle inkübe hücreleri </li><li> 14 ml PBS içinde% 2 FBS ile iki kez yıkanır hücreleri. </li><li> 5 dakika boyunca 1500 rpm&#39;de santrifüje tüpü ve süpernatant atılır. </li><li> Streptavidin ile seyreltilir olarak 500 uL PBS ile gösterilir ve% 2 FBS hücreleri leke. <ul type="disc"><li> APC-Cy7 1:300 konjuge Streptavidin </li></ul></li><li> Tüp çözüm ekleyin. Pipetleme tarafından tek hücre süspansiyonu haline ayrışır. </li><li> 4 ° C&#39;de karanlıkta 10 dakika süreyle inkübe hücreleri </li><li> 14 ml PBS ile% 2 FBS ile iki kez yıkanır hücreleri. </li><li> 5 dakika boyunca 1500 rpm&#39;de santrifüje tüpü ve süpernatant atılır. </li><li> PBS ile% 2 FBS 500 uL içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Eli için yeni bir 5 mL tüp içinde hücre süspansiyonu aktarılır ve filtresıralama prosedürü ile karışabilir hücresel agrega minate. </li><li> Sıralanır popülasyonlarının 7-AAD + ölü hücreleri çıkarmak amacıyla hücre süspansiyonu ila 7-Aad 5 uL (it 1:100 seyreltilmiş kullanım) ekleyin. </li><li> Aşağıdaki fenotipleri göre BD FACSAria ile Sıralama hücreleri: <ul type="disc"><li> LKS hücreleri: lin - c-Kit + Sca-1 + </li><li> LT-HKH&#39;ler LKS CD34 - </li><li> ST-HKH&#39;ler LKS CD34 + </li><li> GMP: lin - c-Kit + Sca-1 düşük FcγR yüksek CD34 + </li><li> AP üyeleri: lin - c-Kit + Sca-1 düşük FcγR düşük CD34 - </li><li> CMPS: lin - CD34 c-Kit + Sca-1 düşük FcγR düşük + </li></ul></li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar 1 gösterir ve elektronik perdeleme prosedür örnek ŞekilLin skoru yaygın lenfoid ataları (CLPs) - / c-Kit lo / interlökin (IL)-7R + hücreleri; Lin - / c-Kit + / Sca-1 + (LKS) ve Lin - / c-Kit + / Sca -1 lo (c-Kit +) hücreleri; c-Kit + kapısından, ortak miyeloid ataları (CMPS) FcγR lo CD34 + hücreler, FcγR hi CD34 + hücreleri ve / megakaryosit olarak granülosit / monosit ataları (GMP) olarak tanımlanır FcγR lo CD34 olarak eritrosit ataları (MEP) - hücreleri; LKS kapısı, LT-HSC ve ST-HSC gelen CD34 olarak tanımlanır - ve CD34 + hücreler, sırasıyla. Yukarıda açıklanan fenotipe göre CD34 ekspresyonunun hem de diğer ataları göre sıralanabilir LT-HSC ve ST-HSC; Bu kemik iliği hücre süspansiyonu manyetik bilye (Şekil 2) c-Kit + hücreleri için zenginleştirilmiş olabilir. HKH&#39;ler ana olabilir<html> hücreleri nükleotid bağlayıcı bileşik tedavi protokollerinin geliştirilebileceğini 11 gibi nükleer kırmızı (DRAQ5) ile boyandı - CD34 Şekil 4, gösterildiği gibi canlı görüntüleme konfokal mikroskopi lize. HKH&#39;lerin olarak, ancak GMP değil, tedavi protokollerinin geliştirilebileceğini pozitif veziküller sitoplazma 12 görünür. + LT-HSC maruz kalan purinerjik P2 reseptörlerinin aktivasyonu sitosolik Ca 2 artış gösterir Şekil 5, gösterildiği gibi Dahası, sıralanır HKH&#39;ler fonksiyonel deneylerde kullanılan adenosin trifosfat-(ATP) ve 12 ila ionomycin. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig1.jpg" /> Şekil 1. Lin-BM hücrelerinin Temsilcisi nokta arsa analizi. Protokol metninde belirtildiği gibi kemik iliği hücre süspansiyon hematopoietik öncü ve HKH&#39;lerin belirlemek ve skor akış sitometresi at Elektronik yolluk prosedürü boyandı. pload/3736/3736fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. Kemik iliğinden c-Kit + hücrelerin seçici zenginleştirme için bir planı. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig3.jpg" /> Şekil 3 elektronik kapılı LKS CD34 Hücre döngüsü analizi -. Sağlıklı kontrol ve Ki-67 antikoru ve DAPI ile boyanarak İBH olan farelerde HKH&#39;ler. Hücreler sabit ve / Lyse Fix ve 1 mcg / ml FITC Ki-67 konjuge ve DAPI ile boyanarak takip tamponları Perm ile permeabilize edildi. Bisiklete binme hücreler ancak LKS CD34 tüm saptanabilir eğer - sağlıklı kontrollerin 12 HKH&#39;ler bölmesi. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig4.jpg" /> . Nükleotid bağlayıcı bileşik tedavi protokollerinin geliştirilebileceğini ve nükleer kırmızı (DRAQ5) ile boyandı HKH&#39;ler ve GMP - Şekil 4 CD34 sıralanmış FACS görüntüleme konfokal mikroskopi yaşayın. Küçük kadran tedavi protokollerinin geliştirilebileceğini pos göstermekitive veziküller HKH&#39;ler sitoplazmasında algılandı, ancak GMP değil. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3736/3736fig5.jpg" /> Şekil 5. Sitosolik Ca 2 + Fura-2 yüklü ve ATP ve ionomycin ile uyarılan sıralanmış HKH&#39;ler yükselme. Tek hücreden izleri gösterilmiştir. Tüm hücreleri + ATP ilavesinden sonra sitozolik Ca 2 belirgin artış gösteren ekstrasellüler ATP duyarlı idi.

<ol><li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%3A+units+of+development%2C+units+of+regeneration%2C+and+units+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution.</a> Cell. 100, 157-168 (2000).</li>
<li>Calvi, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425, 841-846 (2003).</li>
<li>Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425, 836-841 (2003).</li>
<li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li>
<li>Arai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie2%2Fangiopoietin-1+signaling+regulates+hematopoietic+stem+cell+quiescence+in+the+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche.</a> Cell. 118, 149-161 (2004).</li>
<li>Essers, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFNalpha+activates+dormant+haematopoietic+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo.</a> Nature. 458, 904-908 (2009).</li>
<li>Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+on+hematopoietic+progenitor+cells+stimulate+innate+immune+system+replenishment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment.</a> Immunity. 24, 801-812 (2006).</li>
<li>Wilson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135, 1118-1129 (2008).</li>
<li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low%2Fnegative+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273, 242-245 (1996).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D., D, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Transplantation+of+Hematopoietic+Stem+Cells+%28HSCs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs.</a> J. Vis. Exp. (2), e157(2007).</li>
<li>Romanello, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine%2Fparacrine+stimulation+of+purinergic+receptors+in+osteoblasts%3A+contribution+of+vesicular+ATP+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).</li>
<li>Casati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+regulation+of+hematopoietic+stem+cell+cycling+activity+by+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP.</a> Cell Death Differ. 18, 396-404 (2011).</li>
<li>Bouma, G., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+and+genetic+basis+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).</li>
<li>Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+variation+in+cycling+of+hematopoietic+stem+cells+in+steady+state+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation.</a> J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada anlatılan yöntem tek tek fareleri (Şekil 1) in hematopoiesis hızlı ve doğru analizine olanak tanır. Fare inflamasyon modelleri, otoimmünite, immün yetmezlik, dejeneratif hastalıklar, metabolik hastalıklar ve kanser de dahil olmak üzere çeşitli deneysel ayarları, bu analiz hematopoiezis patolojik durumun etkisini ele veriyor. Şekil 3 elektronik kapılı LKS üzerinde hücre bisiklet aktivitesi analizini gösterir CD34 - Ki-67 mab ve DAPI ile boyanarak sağlıklı f...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 42401 </td></tr><tr><td> MEM NEAA 100X </td><td> Gibco </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> Sodyum piruvat </td><td> Gibco </td><td> 11360 </td></tr><tr><td> PenStrep </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 20012 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td></tr><tr><td> Hücre Süzgeç 40 mikron </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> 7-AAD Boyama çözüm </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559925 </td></tr><tr><td> Tampon Lyse / Fix </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558049 </td></tr><tr><td> Tampon III Perm </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558050 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Ki-67 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556026 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td></tr><tr><td> CD4 (GK1.5) </td><td> eBioscience </td><td> 150041 </td></tr><tr><td> CD8 (53-6,7) </td><td> eBioscience </td><td> 150081 </td></tr><tr><td> CD3 (145-2C11) </td><td> eBioscience </td><td> 150031 </td></tr><tr><td> CD45R (RA3-6B2) </td><td> eBioscience </td><td> 150452 </td></tr><tr><td> CD19 (6D5) </td><td> eBioscience </td><td> 150193 </td></tr><tr><td> Gr1 (RB6-8C5) </td><td> eBioscience </td><td> 155931 </td></tr><tr><td> Tre119 (TER-119) </td><td> eBioscience </td><td> 155921 </td></tr><tr><td> NK-1.1 (PK136) </td><td> eBioscience </td><td> 455941 </td></tr><tr><td> c-Kit (2B8) </td><td> eBioscience </td><td> 171171 </td></tr><tr><td> Sca-1 (D7) </td><td> eBiosciğımız uydunun </td><td> 135981 </td></tr><tr><td> CD34 (RAM34) </td><td> eBioscience </td><td> 110341 </td></tr><tr><td> FcγR (2.4G2) </td><td> eBioscience </td><td> 553145 </td></tr><tr><td> Anti-APC mikroküreler </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-090-855 </td></tr><tr><td> LS Sütunlar </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-042-401 </td></tr></tbody></table>

mürin hematopoetik kök hücreler ve lineage-kararlı progenitörlerin fenotipik analizi ve İzolasyon

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Kemik iliği HKH&#39;ler ve daha olgun kan hücrelerinin soy ataları ikamet ve yetişkin bir organizmanın bir farklılaşmanın temel sitedir. HKH&#39;lerin ömür boyu 1 için tüm kan hücre soylarının yaratabilmeleridir pluripotent hücrelerin bir dakika hücre popülasyonu oluşturmaktadır. Kemik iliğindeki HKH&#39;ler homeostazının moleküler diseksiyonu hematopoezisi, onkoloji ve rejeneratif tıp açısından önemli olmaktadır. Biz floresan antikor ve bireysel farelerde hematopoetik progenitör alt ve HKH&#39;lerin dağılımı (Şekil 1) puan almak için akım sitometri içinde elektronik yolluk prosedürü ile etiketleme protokolü tanımlar. Ayrıca, yaygın hematopoietik öncü yanı sıra uzun vadeli (LT) ve c-Kit eksprese eden hücrelerin manyetik zenginleştirme tarafından toplanan kemik iliği hücre süspansiyonları gelen HKH&#39;ler yeniden yapılandırılması kısa vadeli (ST) zenginleştirmek için bir metodu tanımlar. Elde edilen hücre hazırlanması için in vitro olarak seçilen alt sıralamak ve etmek için kullanılabilirİn vivo çalışmalar işlevsel (Şekil 2). Hem trabeküler osteoblastlar 2,3 ve sinüzoidal endotel 4 kemik iliğinde HKH&#39;ler destekleyen fonksiyonel niş oluşturmaktadır. N-kaderin + osteoblastlar 3 alt ve ligand anjiyopoietin-1 5 ile HKH&#39;ler ifade reseptör tirozin kinaz Tie2 etkileşimi de dahil olmak üzere osteoblastik niş içinde çeşitli mekanizmalar HKH&#39;ler sessizliğini belirlenmesinde hemfikir. Kemik iliğinde &quot;Hazırda&quot; aşırı bisiklet aktivitesi üzerine 6 çoğaltma ve sonunda yorgunluktan HKH&#39;ler korumak için çok önemlidir. Böyle Toll-like reseptör ligandlar 7 ve interferon-α 6 gibi doğuştan gelen bağışıklık sistemi hücrelerinde etkili eksojen uyarılara da soyu adamış ataları içine yayılması ve HKH&#39;lerin ayrımı uyarabilir. Son zamanlarda, lin içinde uyuyan fare HKH&#39;ler nüfusu - c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD48 - CD34 - nüfusu 8 tarif edilmiştir. Hücrelerin Sıralama burada açıklandığı gibi hematopoietik öncü zenginleştirilmiş hücre süspansiyonu ile CD34 ekspresyonunun dayalı sağlar sakin kendini yenileyen LT-HKH&#39;ler ve ST-HKH&#39;ler 9 hem de izolasyon. Soyu pozitif hücrelerinin tükenmesine ve CD48 ve Flk2 antikorları ile birlikte LT-KYH sıralama göre benzer bir prosedür, daha önce 10 tarif edilmiştir. Bu yazıda fenotipik karakterizasyonu ve farklı fizyolojik ve patolojik şartlarda hematopoez izlemek için yararlı olabilir hematopoietik öncü, ex vivo hücre döngüsü analizi için bir protokol sağlar. Ayrıca, biz faktörleri ve hücre biyolojisi ve sinyal iletimi deneyleri yanı sıra transplantasyon için kendi kendini yenileme, genişleme ve farklılaşma düzenleyen mekanizmaları tanımlamak için kullanılabilir HKH&#39;ler, prosedürü sıralama bir FACS açıklar.

Sitometrisi kemik iliği hematopoietik öncü dağıtımı yanı sıra verimli yalıtmak için son derece saf hematopoetik kök hücreleri (HKH&#39;ler) analiz etmek için bir yöntem tarif edilir. İzolasyon ^ işleminde esas olarak hücresel ve moleküler çalışmalar için HKH&#39;ler arındırmak için sıralama c-Kit + hücreleri ve hücre manyetik zenginleştirme dayanmaktadır.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

Kemik iliği, yetişkin bir organizmada HSC'lerin ve daha olgun kan hücresi soy hattı progenitörlerinin bulunduğu ve farklılaştığı temel bölgedir. HSC'ler...

Bu video, manyetik boncuk tabanlı ayırma ve floresanla aktive edilen hücre kaynağı kullanımı ile hematopoetik progenitörlerin izolasyonu ve fenotipik karakterizasyonu için bir protokol sunmaktadır. İlk olarak, bir fareden arka bacak, femur, tibia ve omurilik diseke edilir ve kemik iliği hücre süspansiyonu oluşturmak için homojenize edilir. Ardından, popülasyon manyetik mikroboncuk akışı kullanılarak C kit eksprese eden hücreler açısından zenginleştirilir.Zenginleştirilmiş popülasyonun sitometrik analizi, bu yöntemin in vitro ve in vivo fonksiyonel çalışmalarda kullanılabilecek yüksek derecede saflaştırılmış hematopoetik soy hücreleri, progenitörler ve hematopoetik kök hücreler sağladığını göstermektedir. Bu tekniğin kemik yıkama (bone flushing) gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kemik iliği hücrelerinin daha verimli ve hızlı bir şekilde geri kazanılmasını sağlamasıdır. Bu teknik, hematopoetik progenitörlerin fenotipik karakterizasyonuna ve ex vivo fonksiyonel analizine olanak tanıdığı için inflamasyon, otoimmünite, immün yetmezlikler, dejeneratif hastalıklar, metabolik bozukluklar ve kanser immün modellerinin tedavisi veya teşhisi üzerinde etkileri bulunmaktadır.Böylece bu

phenotypic-analysis-isolation-murine-hematopoietic-stem-cells-lineage

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol detayları fare embriyonik kök hücreler (ESC) ve ölümcül ışınlanmış alıcı farelere sonraki enjeksiyon transplante hematopoietik kök hücre türetme. Kısaca ESC embriyoid organları, sonra retroviral HoxB4 ve OP9 stromal hücreler ve hematopoetik sitokinlerin birlikte kültürlü ile enfekte olarak ayırt edilirler.

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

Bu video yolk kesesi ve aort-gonad mesonephros bölge embriyolardan mikro incelemek ve hematopoietik kök hücreler sıralamak için flow sitometri kullanmak nasıl gösterir.

Murin Yolk Sac ve AGM Erken Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu

Doğrudan taze hasat fare kemik iliği, dalak veya fetal karaciğer farklılaşma aşamalı özel fare eritroid atalarıdır ve öncüleri, belirlenmesi ve moleküler analiz için bir akış sitometri yöntemi. Tahlil hücre yüzey belirteçleri CD71, Ter119 ve hücre boyutu dayanır.

CD71/TER119 Flow-sitometrik Testi kullanarak Fare eritro-id progenitörlerin Tanımlama ve Analiz

Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

Hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC) henüz küçük bazı endotel hücreleri kan yapıcı olmaya belirtmek hangi işlemi hakkında bilinen, gelişim sırasında uzman (hemogenic) endotel hücreleri kaynaklanıyor. Bu fare embriyonik dokulardan hemogenic endotel hücreleri ve HSPC eşzamanlı izolasyonu sağlayan bir akış-sitometri göre bir yöntem ortaya koymaktadır.

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

Burada fare embriyonik gelişim sırasında hematopoetik kök hücre öncüleri klonal analizi için metodoloji mevcut. Endotel hücre ortak kültür ve fenotipik özellikleri ve tek hematopoetik öncüleri potansiyelini engraftment karakterize nakli ile embriyonik aort-erbezi-mesonephros bölgesinden tek hücre dizin sıralama birleştirin.

Embriyonik hematopoetik kök hücre öncüleri endotel hücre niş ortak kültürü ile kombine sıralama tek hücre dizini kullanarak klonal analizi

Biz nasıl tanımlanmasını ve yalıtılmasını miyeloid ataları fare kemik iliği bir manyetik kombinasyonu ve floresan (MAC'ler ve FACS) sıralama kullanarak üzerinden 6 alt kümelerini göstermek. Bu iletişim kuralı vitro kültürü deneyleri (methylcellulose ya da sıvı kültürleri), in vivo evlat edinen transfer deneyler ve RNA/protein analizleri için kullanılabilir.

Kimlik ve yalıtım Oligopotent ve Lineage için kabul edilen miyeloid ataları fare kemik iliği dan

Bu yöntem, MEP ve MKp'nin fare femurları, kaval kemiği ve pelvik kemiklerden akış sitometrisi ile saflaştırılmasını açıklar.

Fare Megakaryosit Progenitors İzolasyonu

Burada, murin kemik iliği hücrelerinin fenotip hemopoietik kök ve progenitör hücrelere izolasyonu ve boyanması ile destekleyici niş endotel ve mezenkimal kök hücrelere yönelik basit bir protokol tanımlanmıştır. Endosteal ve santral kemik iliği bölgelerinde bulunan hücreleri zenginleştirmek için bir yöntem de dahil edilmiştir.

Murin Kemik İliği Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin ve Stromal Niş Hücrelerin Akış Sitometri Analizi

Hoxb5 muhabir sistemini kullanarak uzun süreli hematopoetik kök hücrelerin (LT-HSC'ler) ve kısa süreli HSC'lerin (ST-HSC'ler) izolasyonu için adım adım bir protokol sunuyoruz.

Uzun Süreli ve Kısa Süreli Hematopoetik Kök Hücreler için İzolasyon Yöntemi

Burada sunulan, hücre bölünmelerinin sayısını, yüzey hücresi fenotipini ve hücresel akrabalığı aynı anda ölçmeye izin veren akış sitometrisine dayalı bir tekniktir. Bu özellikler, permütasyon tabanlı bir çerçeve kullanılarak istatistiksel olarak test edilebilir.

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücreler için Akış Sitometrisi ile Akrabalık, Bölünme Sayısı ve Fenotipin Eşzamanlı Değerlendirilmesi

Öğrenin kemik iliği hematopoetik kök hücrelerinin manyetik boncuk ayrıştırma ve akış sitometrisi ile izolasyonunu. Bu yöntem yüksek saflıkta hücre sağlar ve fonksiyonel çalışmalar için idealdir.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

Daha fazla video keşfet