Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

Bu video, manyetik boncuk tabanlı ayırma ve floresanla aktive edilen hücre kaynağı kullanımı ile hematopoetik progenitörlerin izolasyonu ve fenotipik karakterizasyonu için bir protokol sunmaktadır. İlk olarak, bir fareden arka bacak, femur, tibia ve omurilik diseke edilir ve kemik iliği hücre süspansiyonu oluşturmak için homojenize edilir. Ardından, popülasyon manyetik mikroboncuk akışı kullanılarak C kit eksprese eden hücreler açısından zenginleştirilir.

Zenginleştirilmiş popülasyonun sitometrik analizi, bu yöntemin in vitro ve in vivo fonksiyonel çalışmalarda kullanılabilecek yüksek derecede saflaştırılmış hematopoetik soy hücreleri, progenitörler ve hematopoetik kök hücreler sağladığını göstermektedir. Bu tekniğin kemik yıkama (bone flushing) gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kemik iliği hücrelerinin daha verimli ve hızlı bir şekilde geri kazanılmasını sağlamasıdır. Bu teknik, hematopoetik progenitörlerin fenotipik karakterizasyonuna ve ex vivo fonksiyonel analizine olanak tanıdığı için inflamasyon, otoimmünite, immün yetmezlikler, dejeneratif hastalıklar, metabolik bozukluklar ve kanser immün modellerinin tedavisi veya teşhisi üzerinde etkileri bulunmaktadır.

Böylece bu yöntem, farklı fizyolojik ve patolojik koşullarda hematopoezin izlenmesine dair içgörü sağlayabilir. Ayrıca, farklı progenitör alt kümelerindeki hücre biyolojisi sinyal iletimini ve gelişimsel olarak düzenlenen gen ekspresyonunu incelemek için de kullanılabilir. Ötanize edilmiş bir fareyi paslanmaz çelik bir tepsiye yerleştirerek başlayın.

Hücre kaynağı olarak kullanılacak kemikleri toplamak için karın ve sırt bölgesini %70 etanol ile püskürtün. Makas kullanarak arka bacaklardaki deride iki küçük açıklık oluşturun, pens yardımıyla femur'u çıkarsın, ardından fareyi ters çevirip deriyi boyuna kesin. Omurgayı açığa çıkarmak için omurga kolonunu çıkarın.

Ardından, sivri uçlu makas kullanarak spinal kolondaki tüm yumuşak doku kalıntılarını dikkatlice temizleyin. Femur ve tibiadaki yumuşak doku kalıntılarını temizlemek için gazlı bez kullanın.

Ardından kemikleri, 30 ml takviye edilmiş RPMI Medium içeren 50 ml'lik konik bir tüpe yerleştirin. Steril bir havana birkaç adet dörtte beşlik steril filtre yerleştirin. Daha sonra forseps kullanarak kemikleri havana aktarın ve sürtünme yüzeyi oluşturmak için üzerlerini bir başka filtre katmanıyla kapatın.

Ardından, 50 mililitrelik konik bir tüpe 40 mikronluk bir hücre süzgeci filtresi yerleştirin. Daha sonra bir havan eli kullanarak, homojen bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar kemikleri ezin. Ve bir pipet kullanarak, süspansiyonu hücre filtresine aktarın.

Ardından, kalan hücreleri yıkamak ve toplamak için havana beş mililitre taze takviyeli RPMI ekleyin ve pipetle yukarı-aşağı çekerek karıştırın. Daha sonra RPMI'yı filtreli tüpe ekleyin. Homojenize edilmiş kemikler berrak görünene kadar son iki adımı tekrarlayın.

Çözelti filtreden geçtikten sonra, onu yeni bir 50 milliliter tüpe aktarın ve kalan doku kalıntılarını gidermek için filtreleme işlemini tekrarlayın. Tüpü 4 °C'de 500 ×g hızında beş dakika santrifüjleyin ve süpernatanı aspirasyon yoluyla dikkatlice uzaklaştırın. Hücre peletini rahatsız etmemeye özen gösterin.

Prosedürün bir sonraki adımı, hematopoetik progenitörlerin fenotiplerini karakterize etmektir. Her fareden elde edilen hücre peletini 15 mililitre PBS ve %2 FBS içinde süspanse ederek başlayın. Ardından tüpü 4 °C'de beş dakika boyunca 500 ×g hızında santrifüjleyin ve süpernatantı aspirasyon yoluyla dikkatlice uzaklaştırın.

Peleti rahatsız etmeyin. Peleti 5 mL PBS ve %2 FBS içerisinde süspande edin ve hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın. Hücre konsantrasyonu belirlendikten sonra, 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakadaki her bir kuyucuğa hücrelerin %1'ini aktarın.

Ardından plakayı 500 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işlemi sırasında, hücreleri boyamak için PBS ve %2 FBS içerisinde, burada listelenen yüzey belirteçlerine yönelik monoklonal antikor karışımını hazırlayın. Santrifüj tamamlandığında, plakayı ters çevirerek süpernatantı boşaltın ve her bir kuyucuğa 50 µL antikor karışımı ekleyin.

Ardından, çok kanallı bir pipet kullanarak tek hücre süspansiyonlarına ayrıştırmak için yukarı-aşağı pipetleme yapın. Hücreleri karanlıkta, 4 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin; inkübasyonun ardından hücreleri 150 µL PBS ve %2 FBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra plakayı 500 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, plakayı ters çevirerek senna'yı uzaklaştırın. Sonra, her kuyucuğa %2FBS içeren PBS ile seyreltilmiş 50 µL 1:300 oranında AP üç boyutlu yedi streptavidin ekleyin ve pipetleme yaparak tek hücre süspansiyonu haline getirin. Hücreleri 4 °C'de, karanlıkta 10 dakika boyunca inkübe edin; inkübasyonun ardından işlemi sürdürün.

Hücreleri iki kez 150 µL PBS ve %2 FBS ile yıkayın. Plakayı santrifüjledikten sonra süpernatanı uzaklaştırın ve hücreleri 100 µL PBS ve %2 FBS içinde yeniden süspanse edin; örnekleri sitometri ile analiz edin. Ardından, seçili hematopoetik hücre alt kümelerini ayırmak için, c-kit pozitif hücreleri zenginleştirmek amacıyla kemik iliği üzerinde manyetik zenginleştirme gerçekleştirilir. En az 10 fareden elde edilen kemik iliği hücre pelletini, 1/50 oranında seyreltilmiş, PC'ye konjuge c-kit monoklonal antikor içeren 1 mL tampon çözelti içerisinde süspanse edin.

İnkübasyonun ardından hücreleri karanlıkta, 4 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri 40 ml tampon çözelti ile iki kez yıkayın. Santrifüj işleminden sonra, üst fazı aspirasyon yoluyla dikkatlice uzaklaştırın.

Ardından, fare başına 50 µL anti A PC mikroboncuklarını doğrudan pelete ekleyin. İyice karıştırın ve inkübasyon yıkamasının ardından 4 °C'de, karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin ve hücreleri daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. Sonra hücre peletini 4 mL tampon çözelti içinde yeniden süspande edin. Her üç fare için, uygun bir max ayırıcıyla manyetik alana max LS kolonları yerleştirin.

Kolonları dört litre tampon çözelti ile durulayarak hazırlayın. Ardından hücre süspansiyonunu uygulayın ve içinden geçen işaretlenmemiş hücreleri bir toplama tüpüne toplayın. Kolonu üç kez formül litre tampon çözelti ile yıkayın.

Kolon rezervuarı boşaldığında yeni tampon ekleyin. Solüsyonun tamamı aktıktan sonra akıntıyı atın, kolonları separatörden çıkarın ve her birini 15 mililitrelik konik bir tüpün üzerine yerleştirin. Her kolona dört mililitre tampon solüsyonu pipetleyin ve pistonu kolonun içine iterek manyetik olarak işaretlenmiş hücreleri hemen yıkayın.

Tüpleri 500 ×g'de beş dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanı aspirasyon yoluyla dikkatlice uzaklaştırın. Her bir peleti bir mililitre tampon çözelti ile yeniden süspande edin ve peletleri tek bir 15 mililitrelik konik tüpte toplayın.

Sea kit pozitif hücre popülasyonu zenginleştirildikten sonra, hücreleri boyayın ve FACS ile ayırın. Manyetik boncuklar kullanılarak sea kit pozitif hücreler için zenginleştirilmiş bir kemik iliği süspansiyonundan elde edilen hematopoetik progenitörler ve hematopoetik kök hücrelerden LT HSC ve THSC, bu videoda açıklandığı şekilde yüzey moleküllerinin ekspresyonuna göre ayrıştırılmıştır. Bu şekil, ortak lenfoid progenitörleri linin olarak skorlamak için kullanılan elektronik kapılama prosedürüne bir örnek göstermektedir.

Düşük interleukin seven R pozitif hücreleri görün. Lin negatif CD7 pozitif CD1 pozitif ve Lin negatif CD7 pozitif CD1 pozitif hücreleri görün. CD7 pozitif kapısından gelen düşük hücreler.

Yaygın myeloid progenitörler, FC gamma R.Low CD 34 pozitif hücreler olarak tanımlanır. Ayrıca, C kit pozitif kapıdan granülosit monosit progenitörleri FC gamma are high CD 34 pozitif hücreler olarak ve megakaryosit eritrosit progenitörleri FC gamma are low CD 34 negatif hücreler olarak tanımlanır; LKS sekiz L-T-H-S-C ve S-T-H-S-C ise sırasıyla CD 34 negatif ve CD 34 pozitif hücreler olarak tanımlanır. Böylece, otoimmünitenin hematopoez üzerindeki etkisini incelemek amacıyla, kontrol grubu ve inflamatuar bağırsak hastalığı olan farelerden, fizyolojik olarak düşük sayıda bulunan iki zenginleştirilmiş ve yüksek derecede saflaştırılmış HSC popülasyonu elde edilir.

Burada görülebileceği üzere, KI 67 antikoru ve DPI ile boyama yapılmıştır. Sağlıklı kontrollerin LKS CD 34 negatif hematopoetik kök hücre kompartımanında, döngüdeki hücreler ancak çok az miktarda tespit edilebilmekte veya hiç tespit edilememektedir. Buna karşılık, aynı hücre alt kümeleri IBD sırasında önemli ölçüde artış göstermekte ve çok sayıda HSC, hücre döngüsünün SG2 M fazlarında tespit edilmektedir.

Bu durum, T hücresi aracılı kronik inflamasyonun HSC'lerin hücre döngüsüne girişini belirlediğini düşündürmektedir. Veziküllerde depolanan bir TP varlığını değerlendirmek için, sağlıklı farelerden alınan CD 34 negatif hücreler nükleotid bağlayıcı bileşik kinin ile boyanmış ve canlı hücre konfokal mikroskopi ile yapılan nükleer kırmızı analizi, GMP'lerde değil ancak HSC'lerde sitoplazmada kinin pozitif veziküllerin görüldüğünü ortaya koymuştur. HSC'lerin hücre dışı ATP'ye yanıt verip vermediğini belirlemek için, 4 0 2 ile yüklenen ve ATP ile ionomycin ile stimüle edilen ayrıştırılmış hematopoetik kök hücrelerin kalsiyum yanıtı, burada görüldüğü gibi analiz edilmiştir. Tek hücreli kalsiyum yükselme izleri, purinerjik P2 reseptörlerinin aktivasyonu ile LT HSC'lerde sitozolik kalsiyumda bir artış olduğunu göstermektedir.

Sitozolik kalsiyum artışları veziküler ATP salınımını tetiklediği için bir ATP'ye maruz kalındığında. Bu deney, bir ATP'nin HSC'lerden kendi salınımını düzenleyebileceğini öne sürmekte ve bu prosedürün HSC'lerin fonksiyonel çalışmaları için kullanılabileceğini kanıtlamaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, fonksiyonel analizler için nöron topo kök hücrelerin ve soy hattı belirlenmiş progenitörlerin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü takiben, C Durumu veya inflamatuar ortamdan saflaştırılan hematopoetik kök hücrelerin yeniden yapılandırma potansiyeli gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, ışınlanmamış alıcı farelerin yeniden yapılandırılması gibi diğer yöntemler uygulanabilir.