Name: Monositler ve İnsan Kan Küçük Örneklerden Dendritik Hücrelerde Lineage özgü Toll-like reseptör-aracılı Sinyali Kantitatif Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Öğrenin, ImageStream teknolojisiyle insan kan örneklerinden izole edilen monosit ve dendritik hücrelerde NF kappa B translokasyonunu nicel olarak görüntüleyin. Bu yöntem bağışıklık hücresi mekanizmalarını incelemek için güçlü bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH (N01 HHSN272201100019C, U19 AI 089.992 ve NCRR / GCRC Programı M01-RR00125) tarafından kısmen desteklenmiştir. Yazarlar, herhangi bir rekabet mali çıkarlarının beyan ve Dr Mark Shlomchik, Yale Hücre Sıralayıcısı Çekirdek Tesis müdürü teşekkür ederim.

1. Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve uyarılması <ol><li> Yerel Kurumsal Değerlendirme Kurulu kuralları uyarınca yazılı onam sonra sağlıklı gönüllülerden alınan 10-50 ml heparinize kan edinin. Yaşlanma veya hastalık çalışmalar için her bir gönüllü veya hasta için patogenezi, etme ve dışlama kriterleri açıkça belirlenmelidir. </li><li> CPT tüpler veya Ficoll-Paque kullanarak Plus, izolasyon 7 (Reaktifler, Tablo 1) gününde üreticinin talimatlarına (GE Healthcare, NJ) ve Deney göre insan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) ayırın. </li><li> Inkübe PBMC&#39;ler (3 x 10 6 / tüp) tek başına ortam içinde 0.6 ml 1.5 ml tüpler içerisinde ya TLR ligandları ya da başka bir aktive edici ajanlar, örn ile uyarılan TLR7 / 8 ligand R848 (0,6 ml, orta artı 10 mM TLR7 / 8 ligand 0.6 ul 10-60 dakika (InvivoGen, CA) 9 için 37 ° C&#39;da R848, nihai konsantrasyon 10 uM). </li></ol> 2. LaboratuvarHücre eling <ol><li> Etiket hücre soyu ve floresan-konjuge antikor kullanılarak canlı hücre süspansiyonları diğer yüzey belirteçleri. Etiket 3 x 10 4 azından 20 dakika boyunca 6 PBMC&#39;ler ° monosit veya DC soyları (Tablo 2) spesifik yüzey antikor kokteyli ile 1.5 mL Eppendorf tüpüne PBS /% 2 FBS 100 ul C. Optimal antikoru dilüsyonları çok-üzere birçok varyasyon-aza indirmek için gruplar halinde işleme alınması gerekir ön deneyler ve örneklerde tespit edilebilir. 0.1 satıcı antikor stok için mg / ml antikor 5 ul (1:20 seyreltme) kullanın. Cihaz üzerinde floresan kanal kurmak için sadece tek bir renk konjuge etiketli hücre ayrı bir tüp kullanın. </li><li> Yüzey işaretlendikten sonra, oda sıcaklığında 10 dakika için% 4 PFA / PBS içinde hücreleri sabitlemek. Depolama için analiz zamanına kadar, analiz gününe kadar -80 de donmaya tampon içinde 500 xg ve Pastör pipetiyle hücreleri (% 90 FBS DMSO% 10 içeren) ° C&#39;de santrifüj hücre. </li><li> Değerlendirme, sürecin partiler için odonörler bir grup f işlenmemiş ve uyarılan hücreler bir araya değişkenliği en aza indirmek için. Analiz gününde, çözülme hücreleri hızla 37 ° C su banyosu, donma tampon kaldırmak için 500x g santrifüj. </li><li> Hücre içi sitokinlerin veya diğer işaretleri, 100 ul BD Perm / Yıkama tamponu (BD Biosciences, NJ) içinde Pastör pipetiyle hücre süspansiyonları tespiti için hücre geçirgenliği artar. Örneğin, 20 dakika oda sıcaklığında, 500 x g&#39;de santrifüj, aspirasyon süpernatan ve tavşan anti-NF-KB (p65) antikorun 01:20 seyreltme (nihai konsantrasyon 10 ug / ml, Santacruz Biotechnology, CA) ile hücre içi sinyal bileşenlerinin etiket 100 ul BD Perm Pastör pipetiyle hücre / keçi anti-tavşan IgG-Alexa647 (Invitrogen, CA) ihtiva eden 1:250 seyreltme tamponu yıkanır ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. </li><li> Görüntüleme hemen önce, DAPI (0.2 mg / ml, Invitrogen, CA) veya propidyum iyodür (; 20 ng / ml, Invitrogen, CA PI) ile çekirdek counterstain. </li></ol> 3. ImageStream Analizi <ol><li>Insan örnekleri arasındaki değişkenliği azaltmak için toplu örnekleri üzerinde ImageStream tarafından görüntüleme yürütün. 488 nm, 658 nm ve 405 nm 250 mW 10 mW 200 mW aşağıdaki gibidir: lazerlerin gücü Enstrüman ayarları idi. </li><li> Enkaz (düşük yoğunluklu PI) veya çoklu hücresel olayların tek hücre (R1) (ayırmak için: (yükseklik oranı genişliği) veri İlk dosyaları (Şekil 1), normal PI yoğunluğu ve yüksek PI boy oranı ile olaylara kapı analiz etmek yüksek PI yoğunluğu ve düşük boy oranı). Monositler CD14 pozitif hücreleri için bir kapı içinde bulunmaktadır. MDCS Lin-1 belirteçler (R3) için CD11c ve düşük CD4 (R2) için ve ayrıca düşük için yüksek hücreleri için bir kapı içinde bulunmaktadır. </li><li> Her bir hücre aktivasyonunun derecede etkin bir miktar ölçü sağlamak için (Amnis, OR) IDEAS yazılım kullanımı. Çekirdeğin (R4) içine translokasyonu göstermek için sitoplazmik transkripsiyon faktörü Nükleer boya PI ile NF-KB benzerlik (ya da ko-Lokalizasyon) belirler. NF-κB/PI locali yüksek bir korelasyonWHO yüksek bir benzerlik skoru yansıyan ve aktivasyon 10 derecesi belirtir. </li><li> Farklı tedavi grupları ya da hücrelerin göreceli işlevsel etkinliğini göstermek için hasta popülasyonları arasındaki benzerlik oranlarını karşılaştırın. Mutlak değerler veya kat farklılık istatistiksel karşılaştırma yoluyla örnekleri arasında veri miktarını. Nüfus dağılımlarını anahtar kesimleri (Şekil 2) hücrelerinin resimleri görüntülemek için FİKİRLER yazılımını kullanın. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Biz TLR7 / 8 ligandı, R848 (Şekil 1) ile PBMC&#39;ler uyararak bir model viral ligand yanıt olarak sayısal sinyal yollarının var. Biz örnek grupları (Şekil 2) hücresel yerleşimi görüntüleri ve nüfus istatistikleri hem de toplandı. ImageStream bize kapısı hücre alt doğrudan PBMC&#39;ler ve görüntü hücresi yanıtlardan kapılı, ama Sıralanmamış hücre popülasyonlarının imkanı sağlar. Burada TLR s etkisi sayılabilirNF-KB (p65) nükleer lokalizasyonuna ignaling Lin1-, CD4 loş, CD11c + miyeloid DC&#39;ler (MDCS). Başlangıçta, biz sitoplazmada transkripsiyon faktörü NF-KB (p65) ile unstimulated hücrelerinin yüksek oranda görülmektedir. Stimülasyon sonra, tedavi edilen hücrelerin NF-KB (p65) (ortanca benzerlik skorları sırasıyla, 1.52 ve 3.01 olduğu, Şekil uyarılmasından sonra çekirdek içine transloke belirten, nükleer leke PI ile NF-B anlamlı derecede daha yüksek benzerlik skoru (p65) var. 2). Benzer sonuçlar TLR5-uyarılmış monositlerin 9 belirtilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3741/3741fig1.jpg" /> Şekil 1.. Boyama ve insan MDCS üzerine stimülasyon etkileri ölçmek Ayırıcı Stratejisi. NF-KB transkripsiyon faktörü sayıda bağışıklık sistemi genlerin ekspresyonunu düzenler. Bu çalışma, TLR7 / 8 liga sonra bir temsilcisi konu ile MDCS NF-KB (p65) nükleer lokalizasyon ölçer<html> nd stimülasyon. In-odaklanmak tek hücreler yüksek nükleer boy oranları (R1) ile PI pozitif olaylara gating ile belirlenmiştir. MDCS (Lin1-, CD4dim, CD11c +) R3 de bağımlı olmuştur. NF-KB (p65) Nükleer yerelleştirme R4 çizilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3741/3741fig1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3741/3741fig2.jpg" /> Şekil 2. . Uyarıldıktan sonra MDCS NF-KB&#39;yi Yer Değiştirmesi stimülasyonu (R4) sonra çekirdeğin içine NF-KB (p65) ile translokasyon tedavi edilmemiş ve uyarılmış MDCS popülasyonları içinde tasvir edilmiştir; medyan benzerliği skoru arıtılmamış numunedeki 1,52 ve 3,01 olduğu Örnek uyarılmış (A). Tedavi edilmeyen veya R848-uyarılan hücre popülasyonlarının eşzamanlı toplanan dijital görüntüleri temsilcisi hücre ve hücre çekirdeği (B) transloke NF-B yoğunluğunu gösterir._upload/3741/3741fig2large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük rakamı görmek için buraya tıklayın.

<ol><li>Linton, P. J., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+lymphocyte+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in lymphocyte development and function.</a> Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).</li>
<li>Shaw, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+Human+Toll-like+Receptor+Function+in+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging.</a> Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nature Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).</li>
<li>van Duin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+Defect+in+Human+TLR1+Function+and+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Age-associated Defect in Human TLR1 Function and Expression.</a> J. Immunol. 178, 970-975 (2007).</li>
<li>Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+decrease+in+TLR+function+in+primary+human+dendritic+cells+predicts+influenza+vaccine+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Age-associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine response.</a> J. Immunol. 184, 2518-2527 (2010).</li>
<li>Kong, K. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+TLR3+impairs+the+innate+immune+response+to+West+Nile+virus+in+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of TLR3 impairs the innate immune response to West Nile virus in the elderly.</a> J. Virol. 82, 7613-7623 (2008).</li>
<li>Qian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+interferon+signaling+in+dendritic+cells+from+older+donors+infected+in+vitro+with+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Impaired interferon signaling in dendritic cells from older donors infected in vitro with West Nile virus.</a> J. Infect. Dis. 203, 1415-1424 (2011).</li>
<li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB+in+immunobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+research%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB in immunobiology.</a> Cell research. 21, 223-244 (2011).</li>
<li>Qian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+elevation+in+TLR5+leads+to+increased+inflammatory+responses+in+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-associated elevation in TLR5 leads to increased inflammatory responses in the elderly.</a> Aging Cell. 11, 104-110 (2011).</li>
<li>George, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+nuclear+translocation+events+using+similarity+analysis+of+multispectral+cellular+images+obtained+in+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow.</a> Journal of immunological. 311, 117-129 (2006).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Translasyonel çalışmalar ImageStream kullanımında önemli adımlar uygun karşılaştırma grupları ve optimizasyonu ve antikor özgüllük doğrulama seçimi vardır. Etiketli hedef konu grupları arasındaki farklar histogramlar ve hücre görüntüler arasında kolayca belli olacak. Ilgili reseptörler ve sinyal yolları değişikliklerin ayrıntılı bir analiz ile birlikte, bu veriler özel kohortlarında bağışıklık bozukluğunun altında yatan mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sağlayacaktır. Tekniği ilgili hedefler için yeterli yakınlık s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque Artı </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> R848 </td><td> Invivogen </td><td> tlrl-r848 </td></tr><tr><td> Paraformaldehit (16%) </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimleri </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> BD Perm / Yıkama </td><td> BD Biosciences </td><td> 554723 </td></tr><tr><td> CD14-PE </td><td> eBioscience </td><td> 12-0149-41 </td></tr><tr><td> CD4-PacBlue </td><td> BD Pharmingen </td><td> 68436 </td></tr><tr><td> Lineage kokteyl 1 (lin 1)-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340546 </td></tr><tr><td> CD11c-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 347637 </td></tr><tr><td> CD123-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 340545 </td></tr><tr><td> tavşan anti-NF-KB (p65) </td><td> Santacruz </td><td> SC-372 </td></tr><tr><td> Alexa647 F (ab &#39;) 2 keçi anti-tavşan IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A21246 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td></tr><tr><td> ImageStream X </td><td> Amnis </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Özel reaktifleri ve ekipmanları. <table border="1"><tbody><tr><td> Hücre tipi </td><td> FITC </td><td> PE </td><td> Alexa 647 </td><td> PacBlue </td></tr><tr><td> Monosit </td><td></td><td> CD14 </td><td> NF-KB (p65) </td><td></td></tr><tr><td> MDC </td><td> Lin1 </td><td> CD11c </td><td> NF-KB (p65) </td><td> CD4 </td></tr><tr><td> PDC </td><td> Lin1</td><td> CD123 </td><td> NF-KB (p65) </td><td> CD4 </td></tr></tbody></table> Sinyal yollarının hücre soyu boyanması için Tablo 2. Antikor paneli Monosit: CD14 + MDC: Lin1-, CD4dim, CD11c + PDC: Lin1-, CD4dim, CD123 + Lin1 (soy) işareti CD3, CD14, CD19, CD20, monositler, NK hücreleri, T ve B hücreleri için CD56 işaretleri içerir.

monositler ve İnsan kan küçük Örneklerden dendritik hücrelerde lineage özgü toll-like reseptör-aracılı sinyali kantitatif görüntüleme

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Bağışıklık durumu bireysel farklılıkları enfeksiyona yanıtların saptanması ve hastalığın ciddiyeti ve sonuçları katkıda bulunmaktadır. Yaşlanma viral ve bakteriyel enfeksiyonlara karşı artmış duyarlılık ile ilişkili ve humoral iyi belgelenmiş düşüşün yanı sıra hücre-aracılı bağışıklık yanıtı 1,2 ile aşılara yanıt azalır. Biz son zamanlarda Toll benzeri reseptörler (TLR), mikrobiyal enfeksiyon ve tetik antimikrobiyal konak savunma yanıtları 3 algılamak doğuştan gelen bağışıklık sisteminin kilit bileşenleri üzerindeki yaşlanma etkilerini değerlendirdik. Sağlıklı insan donör büyük bir kohort, biz yaşlılar o periferik kan monosit ifade ve belli TLR 4 ve dendritik hücreler benzer düşük TLR düzeyleri ve sinyalizasyon yanıtları (DC) fonksiyonu azalmış gösterdi, hayati önem taşıyor hücreler antijen sunan doğal ve kazanılmış bağışıklık 5 arasındaki bağlantı. Biz bir makrofajlarda TLR3 bozulmasına göstermiştirBatı Nil virüsü 6,7 enfeksiyonuna yanıt olarak yaşlı donörlerden DC&#39;lerin IFN d düşük üretim. Immunosenescence anlayışımıza ve terapötik müdahale Paramount yanıt spesifik hücre tiplerinin ayrıntılı bir anlayış ve sinyal iletim mekanizması (s). FACS veya immunoblotting tarafından birincil hücre ve hücre ölçme belirteçlerin görüntüleme yoluyla bağışıklık yanıtları Geleneksel çalışmaları Ancak, bu çalışmalar genellikle hastalar mevcut küçük bir örnek hacmi ve birden çok karmaşık laboratuvar teknikleri yapmak yetersizlik teknik sınırlıdır, önemli ölçüde bizim anlayış gelişmiş var insan örnekleri. ImageStream eş zamanlı yüksek çözünürlüklü dijital görüntüleme ile kantitatif akım sitometri birleştiriyor ve böylece hasta duyarlılığının etkin bir şekilde yakalamak için eş zamanlı birden fazla hücre popülasyonlarının araştırılması kolaylaştırır. Burada DC&#39;ler içinde ImageStream kullanımını değerlendirmek için göstermek TLR7 / 8fosforilasyon ve immün yanıtı 8 için kritik olan çok sayıda gen transkripsiyonu başlatan önemli bir transkripsiyon faktörü NF-KB, nükleer translokasyonu aktivasyon aracılı artar. Biz de son zamanlarda TLR5 sinyalizasyon ve 9 yaşlanma değişmiş immün yanıt katkıda bulunabilir yaşlı donörlerden monositlerde NF-KB yolunun daha önceden tanınmayan değişiklik gösterdiği, bu teknoloji kullanma.

Biz (ImageStream teknolojinin kullanıldığını anlatmak<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"&gt; Www.amnis.com</a&gt;), Hangi iyi tanımlanmış hasta kohortlarında primer immün hücrelerinin hücresel mekanizmaları ölçmek için, aynı anda yüksek-çözünürlüklü dijital görüntüleme ile kantitatif akım sitometri birleştirir. Çalışmalarımız konu kohortlarında küçük örneklerde soyunun spesifik hücresel tepkileri ölçmek için translasyonel araştırmalar için bir plan sunar.

Monositler ve İnsan Kan Küçük Örneklerden Dendritik Hücrelerde Lineage özgü Toll-like reseptör-aracılı Sinyali Kantitatif Görüntüleme

Bağışıklık durumundaki bireysel varyasyonlar, enfeksiyonlara verilen yanıtları belirler; hastalık şiddetine ve sonucuna katkıda bulunur. Yaşlanma, ... ile ilişkilidir.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, iyi tanımlanmış hasta kohortlarından elde edilen primer immün hücrelerin hücresel mekanizmalarını nicelendirmek için görüntü akış teknolojisinin kullanımını göstermektir. Bu işlem, öncelikle hastalardan veya sağlıklı gönüllülerden alınan kan örneklerinden periferik kan mononükleer hücrelerinin veya pbmc'lerin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İzolasyonun ardından hücreler aktive edilir ve ardından floresanla işaretlenir.Ardından, hücreler hidrodinamik olarak odaklanır, lazer ışığı ile uyarılır ve zaman gecikmeli entegrasyonlu (TDI) bir CCD kamera ile görüntülenir. Son olarak, görüntü akışlı sitometresi kullanılarak görüntüler alınır ve NF kappa b miktarı belirlenir.Her bir hücresel görüntüdeki translokasyon, ideas yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. Sonuç olarak, her bir denek grubu arasındaki farklar nokta grafikleri, histogramlar ve hücre görüntülerinin analizi yoluyla belirlenebilir. Görüntü akışının avantajı, gerçekleri ve immünofloresansı birleştirmesidir.Hücre sinyal yolaklarını, tek hücre veya popülasyon düzeyinde, soy hattına özgü bir şekilde ve yalnızca küçük bir kan örneğiyle başlayarak inceleyebiliyoruz. Bu yöntem, sinyal aracılarını lokalize ederek ve miktarını belirleyerek bilimsel bilgiye dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, transkripsiyon faktörlerinin nükleer translokasyonun nasıl gerçekleştiğini araştırmak veya yaşlanmanın hücre biyolojisi üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir.Laboratuvarımdaki birinci kıdemli araştırmacı, insan gönüllülerden elde edilen periferik kan mononükleer hücrelerini izole ettikten sonra tekniği uygulamalı olarak gösterecektir. Geri kazanılan pBمک'leri, 0,6 mililitre ortam başına 3 × 10⁶ hücre olacak şekilde yeniden süspanse edin ve ardından hücre süspansiyonunu 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. Daha sonra, hücrelerin bir kısmını burada gösterilen TLR 8 agonist R848 gibi bir aktive edici ajanla stimüle edin ve ardından tüm hücreleri %5 karbondioksit inkübatöründe, 37 °C'de 10 ila 60 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyon süresinin ardından, hücreleri oda sıcaklığında 500 ×g'de beş dakika boyunca pelletleyin, süpernatantı atın ve hücreleri, kompanzasyon kontrolleri olarak kullanılacak tek renkli konjugatlarla işaretlenmiş hücre tüpleri de dahil olmak üzere, monosit veya DC lineage'ları için spesifik yüzey antikorlarından oluşan bir kokteyl ile 4 °C'de 20 dakika boyunca işaretleyin. Ardından hücreleri oda sıcaklığında %4 P-F-A-P-B-S içinde 10 dakika boyunca fikse edin. Hücreleri oda sıcaklığında 500 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüj ettikten sonra, pbmc'leri dondurma tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri analiz gününe kadar -80 °C'de saklayın.Hücreleri 37 °C'lik bir su banyosunda hızlıca çözdürün ve ardından dondurma tamponunu uzaklaştırmak için santrifüjledikten sonra, 100 µL BD perm yıkama tamponu ile permeize edin. Ardından, burada gösterilen anti NF kappa BP 65 antikorları gibi hücre içi sinyalizasyon bileşeni karşıtı antikorlarla oda sıcaklığında 20 dakika boyunca etiketleyin. Hücreler pellet haline getirildikten sonra, onları keçi anti-tavşan IgG içeren 100 µL BD perm yıkama tamponu içinde yeniden süspanse edin.Alexa 647 ile boyayın ve PBMC'leri oda sıcaklığında 20 dakika daha inkübe edin. Görüntüleme işleminin hemen öncesinde hücreleri bir nükleer boya ile karşı boyamaya tabi tutun; ImageStream'e güç vererek ve ardından Inspire yazılımını başlatarak işleme başlayın. Ardından, varsayılan şablonu yükle (load default template) seçeneğine tıklayın ve ardından akışkan sistemini başlat (initialize fluidics) seçeneğini belirleyin.Ardından görüntü galerisi menüsüne tıklayın ve tümünü seçin. Şimdi, boncukların görüntülemesine başlamak için kurulumu çalıştır'a basın ve ardından aydınlık alan kanalını seçin. Hız boncukları çalışmaya başladığında, cihazı kalibre etmek ve test etmek için yardım sekmesi altındaki tümünü başlat'a tıklayın.ImageStream sistemi kalibre edildikten sonra, en parlak örneği makineye yüklemek için flush, lock and load düğmesine basın. Ardından, her bir florokromun nokta grafiklerinde ölçülen maksimum piksel değerinin 104.000 count arasında olacağı şekilde lazer gücünü ayarlayın. Daha sonra hücre sınıflandırma kriterlerini belirleyin.Şimdi çalıştır (run) düğmesine tıklayın, deney veri dosyasını toplamak ve kaydetmek için veri toplama (acquire) işlemini gerçekleştirin. Veri dosyalarını analiz etmek için öncelikle analiz yazılımını açın. Kompanse edilmiş görüntü dosyaları oluşturun ve ardından normal nükleer boya yoğunluğuna ve yüksek nükleer boya en-boy oranına sahip olayları kapılayın (gate). R1 kapısındaki tek hücreleri kalıntılardan veya çok hücreli olaylardan ayırt etmek için; monositler CD14 pozitif hücreler kapısında, CD11c değeri yüksek, CD4 ve lin1 markerları değeri düşük olan myeloid dendritik hücreler ise R3 kapısında bulunur.Son olarak, sitoplazmik transkripsiyon faktörü NF kappa B'nin nükleer boya ile kolokalizasyonunu belirlemek için ideas yazılımını kullanın. NF kappa B ile nükleer boya arasındaki yüksek korelasyon, iki markörün kolokalizasyonuna işaret eder, yüksek bir benzerlik puanı ile yansıtılır ve hücrenin aktivasyon derecesini gösterir. Farklı tedavi grupları veya hasta popülasyonları arasındaki yüksek benzerlik olaylarının yüzdesi, hücrelerin göreceli fonksiyonel etkinliğini değerlendirmek için karşılaştırılabilir.Ardından, popülasyon histogramlarının kilit segmentlerinden hücre görüntülerini görüntülemek için yazılım kullanılabilir. ImageStream, hücre alt kümelerinin doğrudan pbmc üzerinden kapılanmasına (gating) ve kaplanmış ancak sıralanmamış hücre popülasyonlarından hücre yanıtlarının görüntülenmesine olanak tanır. Burada, TLR sinyallemesinin lin one, negatif CD four, dim CD 11 C pozitif miyeloid dcs hücrelerinde NF kappa BP 65'in nükleer lokalizasyonu üzerindeki etkisi bazal düzeyde nicelendirilmiştir.Sitoplazmasında transkripsiyon faktörü NF kappa BP 65 bulunan uyarılmamış hücrelerin yüksek bir yüzdesi gözlemlenmiştir. Stimülasyon sonrası, işlem görmüş hücrelerin NF Kappa BP 65 ile nükleer boya PI arasında anlamlı düzeyde daha yüksek bir benzerlik skoruna sahip olduğu belirlenmiş, bu durum NF Kappa BP 65'in stimülasyon sonrası çekirdeğe transloke olduğunu göstermiştir. İşlem görmemiş veya R 8 48 ile stimüle edilmiş hücre popülasyonlarından eş zamanlı olarak toplanan dijital görüntüler, temsili hücreleri ve hücre çekirdeğine transloke olan NF kappa B yoğunluğunu göstermektedir. R 8 48 ile stimüle edilen gruptaki NF Kappa B ve PI boyamasının, işlem görmemiş hücrelere kıyasla daha parlak yoğunluğa sahip olduğuna dikkat ediniz.Bu tekniği farklı yaşlardaki donörlerden alınan hücreler üzerinde kullandık ve TLR aracılı NF kappa B aktivasyon yollarında farklılıklar olduğunu gösterdik. Uzmanlaşıldığında, bu teknik, görüntü analizi için gereken ek süreye ek olarak bir gün içinde tamamlanabilir ve hem birçok lokalizasyon görüntüsünün hem de popülasyon istatistiklerinin elde edilmesine olanak tanır. Ayrıca, fiziksel ayırma işlemi yapmadan doğrudan birden fazla hücre popülasyonundan gelen yanıtları görüntüleyebiliriz. Görüntü akışı, bir dizi hücresel mekanizmaya geniş çapta uygulanabilir ve translasyonel araştırmalarda oldukça değerli olacaktır.

quantitative-imaging-lineage-specific-toll-like-receptor-mediated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Dendritik hücreler alımı antijenler ve T hücrelerine işlenir antijenleri bağışıklık organları doğru göç. Qdot nanokristal etiketleme, uzun ömürlü ve istikrarlı bir floresan sinyali sağlar. Bu floresan mikroskobu ile farklı organlara dendritik hücreler izleme sağlar.

İzleme Araştırmaları Qdot nanokristaller murin Kemik İliği-türevli dendritik hücrelerin üretilmesi ve Etiketleme

Bu raporda, biz büyük doğal ve adaptif lökosit popülasyonlarının numaralandırmak için taze tam kan üzerinde gerçekleştirilen bir feno testinin boyama ve analiz adımları göstermektedir. Biz çok merkezli klinik çalışma kapsamında bu işlemler gerçekleştirmek için konuları vurgulamaktadır.

Bir Tam Kan fenotipleme Testi Kullanarak Çok Merkezli Klinik Araştırmalar için Binbaşı Periferik Kan Lökosit Populasyonlarının Numaralama

Bu protokol, ökaryotik hücrelerde tam hücre MALDI-TOF kütle spektrometresinin kullanımını açıklar. Burada, makrofajların mikro çevrelerine yanıt olarak çoklu aktivasyon durumlarını analiz ederek bu tekniğin doğruluğunu gösteriyoruz.

Tüm hücre MALDI-TOF Kütle Spektrometre Makrofaj Aktivasyon Farklı Modu analiz için Doğru ve Hızlı Yöntem

Bu çalışma, in vitro dendritik hücreler (DC'ler) elde etmek için iki farklı insan monosit izolasyonu yöntemini karşılaştırmaktadır. Monositler yapışma ile seçilir veya manyetik ayırma ile negatif olarak zenginleştirilir. Monosit verimi ve canlılığı ile MDDC canlılığı, proliferasyonu ve CD11c/CD14 yüzey marker ekspresyonu her iki yöntem arasında karşılaştırılacaktır.

Görüntüleme Sitometrisi ile İnsan Monosit türetilmiş dendritik hücrelerle Karakterizasyonu: İki Monosit İzolasyon Protokoller Arasında Bir Karşılaştırma

Burada, insan anti-pıhtılaşmış kanının yoğunluk gradyanlı santrifüjlenmesinden sonra periferik kan mononükleer hücrelerinden manyetik boncuk ayrılması ile monositlerin nasıl izole edildiğini gösteriyoruz. 5 günlük inkübasyonun ardından, insan monositleri olgunlaşmamış dendritik hücrelere ayrılır ve klinik olmayan bir ortamda deneysel prosedürler için hazır hale gelir.

Tüm kan İnsan monosit türevli dendritik hücrelerin oluşumu

Burada, biz birincil insan T hücreleri ve antijen sunan hücreler arasındaki bağışıklık sinapslarda nitel ve nicel analizi için tam bir iş akışı tanımlamak. Yöntem alma ve nispeten kısa bir süre içinde birkaç bin hücre görüntülerin değerlendirme sağlar görüntüleme akış sitometresi temel alır.

Akış Sitometresi Imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık Synapse nitel ve nicel analiz

Lenfosit kemotaksis ve geçiş kantitatif değerlendirilmesi için protokolleri İmmünoloji araştırma için önemli araçlardır. Burada, bir vitro Protokolü izni gerçek zamanlı, hücre göç değerlendirilmesi yanı sıra bir tamamlayıcı vivo içinde teknik etkinleştirme izlemeyle yerli hücreleri dalak multiplexed açıklanmıştır.

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Biz hicret monosit karşısında insan endotel monolayers tarafından ve onların sonraki olgunlaşma köpük hücrelerine ölçmek için bir protokol tanımlamak. Bu farklı hastalık koşullara sahip insanlardan izole monosit aterojenik özelliklerini değerlendirmek için ve bu eğilimi geliştirmek kan faktörleri değerlendirmek için çok yönlü bir yöntem sağlar.

Miktar monosit hicret ve köpük hücre oluşumu kronik inflamatuar koşullara sahip bireylerden

Burada bağışıklık fenotipik ve fonksiyonel (hücre içi sitokin indüksiyon) değerlendirmek için bir tek hücreli proteomik yaklaşım tarif değişiklikler periferik tam kan örneklerinde, kitle sitometresi ile analiz.

Tek hücreli Immunophenotype ve sitokin üretimde kitle sitometresi ile periferik tam kan analizi

Burada monosit alt kümeleri tam kan akış sitometresi tarafından karakterize için bir iletişim kuralı mevcut. Bu nasıl alt kümeleri kapı ve onların ifade yüzey işaretlerinin değerlendirmek özetleyen ve M1 (iltihabi) ve M2 işaretleri (anti-inflamatuar) ifadesi değerlendirme bir örnek vererek içerir.

İnsan monosit alt kümeleri tam kan tarafından karakterizasyonu Akış Sitometresi Analizi

Diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrisi ile karakterizasyonu, implantlara karşı immün yanıt paterninin anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Bu makale, diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrik analizi için boyanması için kesin bir yöntemi açıklamaktadır.

Diseke İmplant Dokularının İmmün Fonksiyon Analizi için Yüksek Boyutluluk Akış Sitometrisi

Öğrenin, ImageStream teknolojisiyle insan kan örneklerinden izole edilen monosit ve dendritik hücrelerde NF kappa B translokasyonunu nicel olarak görüntüleyin. Bu yöntem bağışıklık hücresi mekanizmalarını incelemek için güçlü bir araçtır.

Monositler ve İnsan Kan Küçük Örneklerden Dendritik Hücrelerde Lineage özgü Toll-like reseptör-aracılı Sinyali Kantitatif Görüntüleme (Video) | JoVE Journal

Monositler ve İnsan Kan Küçük Örneklerden Dendritik Hücrelerde Lineage özgü Toll-like reseptör-aracılı Sinyali Kantitatif Görüntüleme

Daha fazla video keşfet