Monositler ve İnsan Kan Küçük Örneklerden Dendritik Hücrelerde Lineage özgü Toll-like reseptör-aracılı Sinyali Kantitatif Görüntüleme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, iyi tanımlanmış hasta kohortlarından birincil bağışıklık hücrelerinin hücresel mekanizmalarını ölçmek için görüntü akışı teknolojisinin kullanımını göstermektir. Bu, ilk olarak hastalardan veya sağlıklı gönüllülerden alınan kan örneklerinden periferik kan mononükleer hücrelerinin veya pbmc'nin izole edilmesiyle elde edilir. İzolasyondan sonra, hücreler aktive edilir ve daha sonra floresan olarak etiketlenir.

Daha sonra, hücreler hidrodinamik olarak odaklanır, lazer ışığı ile uyarılır ve bir zaman gecikmeli entegrasyonda görüntülenir. CCD kamera. Son olarak, görüntü akışı sitometresi ve NF kappa b'nin miktar tayini kullanılarak görüntüler gereklidir.

Her hücresel görüntüdeki translokasyon, fikirler yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. Sonuç olarak, her bir denek grubu arasındaki farklar, nokta grafiklerinin, histogramların ve hücre görüntülerinin analizi yoluyla belirlenebilir. Görüntü akışının avantajı, gerçekleri ve immünofloresanı birleştirmesidir.

Hücre sinyal yollarına, tek hücre veya popülasyon gibi soylara özgü bir şekilde ve sadece küçük bir kan örneğiyle başlayarak bakabiliyoruz. Bu yöntem, sinyalizasyon ara ürünlerini yerelleştirerek ve nicelleştirerek bilgideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, saydam faktörlerin aksiyon aracılı nükleer translokasyonunu araştırmak veya yaşlanmanın hücre biyolojisi üzerindeki etkilerine bakmak için kullanılabilir.

Laboratuvarımdan lider olan, insan gönüllülerden elde edilen periferik kan mononükleer hücrelerini izole ettikten sonra tekniği gösterecek. Resus, geri kazanılan p BMC'leri 0.6 mililitre ortam başına 10 ila altıncı hücreye üç kez yeniden süspanse eder ve daha sonra hücre süspansiyonunu 1.5 mililitrelik tüplere aktarır. Daha sonra, bazı hücreleri burada gösterilen TLR sekiz LA R 8 4 8 gibi bir aktive edici madde ile uyarın ve daha sonra tüm hücreleri% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 10 ila 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

İnkübasyon süresinden sonra, hücreleri oda sıcaklığında 500 kez G'de beş dakika boyunca peletleyin, süpernatanı atın, hücreleri, dört santigrat derecede 20 dakika boyunca monosit veya DC soylarına özgü bir yüzey antikor kokteyli ile etiketleyin, kompanzasyon kontrolleri olarak kullanılmak üzere tek renkli konjugatlarla etiketlenmiş hücre tüpleri dahil. Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 P-F-A-P-B-S şeklinde sabitleyin. Hücreleri oda sıcaklığında 500 kez G'de 10 dakika santrifüjledikten sonra, pbmc'yi donma tamponunda tekrar süspanse edin ve hücreleri, tahlil gününde analiz edilene kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Hücreleri 37 santigrat derece su banyosunda hızlı bir şekilde çözdürün ve ardından dondurucu tamponu çıkarmak için santrifüjledikten sonra 100 mikrolitre BD perma yıkama tamponu ile geçirin. Daha sonra, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca burada gösterilen anti NF kappa BP 65 antikorları gibi anti hücre içi sinyal bileşeni antikorları ile etiketleyin. Peletlemeden sonra, Resus hücreleri bunları keçi anti tavşan IgG içeren 100 mikrolitre BD perma yıkama tamponunda süspanse eder.

Alexa 6 47 ve pbmc'yi oda sıcaklığında 20 dakika daha inkübe edin. Görüntülemeden hemen önce, hücreleri nükleer bir boya ile boyayın, görüntü akışını güçlendirerek ve ardından inspire yazılımını başlatarak başlayın. Ardından, varsayılan yükleme şablonuna tıklayın ve ardından fluidics'i başlat'ı seçin.

Ardından resim galerisi menüsüne tıklayın ve tümünü seçin. Şimdi boncukları görüntülemeye başlamak için çalıştır kurulumuna basın ve ardından parlak alan kanalını seçin. Hız boncukları çalışmaya başladığında, cihazı kalibre etmek ve test etmek için yardım sekmesinin altındaki tümünü başlat'a tıklayın.

ImageStream sistemi kalibre edildikten sonra, en parlak örneği makineye yüklemek için flush (yıkama) düğmesine basın, kilitleyin ve yükleyin. Ardından lazer gücünü, her bir flora kromunun nokta grafiklerinde ölçüldüğü gibi 104.000 sayım arasında bir maksimum piksel değerine sahip olacak şekilde ayarlayın. Ardından hücre sınıflandırma kriterlerini ayarlayın.

Şimdi çalıştır'a tıklayın, önce veri dosyalarını analiz etmek için deney veri dosyasını toplamak ve kaydetmek için edinin, fikirleri açın. Analitik yazılım, telafi edilmiş görüntü dosyaları oluşturur ve ardından normal bir nükleer boya yoğunluğuna ve yüksek bir nükleer boya en boy oranına sahip olayları açar. R bir kapısındaki tek hücreleri enkaz veya çok hücreli olaylardan ayırt etmek için, CD 14 pozitif hücreler için kapı içinde monositler, CD 11 C için yüksek ve CD dört için düşük olan miyeloid dendritik hücreler bulunur ve lin one belirteçleri R üç kapısındadır.

Son olarak, sitoplazmik transkripsiyon faktörü NF kappa B'nin nükleer boya ile kolokalizasyonunu belirlemek için fikir yazılımını kullanın. İki markörün kolokalizasyonunu gösteren NF kappa B nükleer boyasının yüksek bir korelasyonu, yüksek bir benzerlik skoruna yansır ve hücrenin aktivasyon derecesini gösterir. Farklı tedavi grupları veya hasta popülasyonları arasındaki yüksek benzerlik olaylarının yüzdesi, hücrelerin göreceli fonksiyonel verimliliğini değerlendirmek için karşılaştırılabilir.

Yazılım daha sonra popülasyon histogramlarının önemli segmentlerinden hücrelerin görüntülerini görüntülemek için kullanılabilir. ImageStream, hücre alt kümelerinin doğrudan pbmc'den geçitlenmesine ve geçitli, ancak sıralanmamış hücre popülasyonlarından hücre yanıtlarının görüntülenmesine olanak tanır. Burada, TLR sinyallemesinin NF kappa BP 65'in lin bir, negatif CD dört, loş CD 11 C pozitif miyeloid dcs'de nükleer lokalizasyonu üzerindeki etkisi başlangıçta ölçüldü.

Sitoplazmada transkripsiyon faktörü NF kappa BP 65 ile yüksek oranda uyarılmamış hücreler gözlendi Stimülasyondan sonra, tedavi edilen hücrelerin, NF Kappa BP 65 transının stimülasyondan sonra çekirdeğe yerleştiğini gösteren nükleer leke PI ile NF Kappa BP 65'in önemli ölçüde daha yüksek bir benzerlik skoruna sahip olduğu belirlendi. Tedavi edilmemiş veya R 8 48 uyarılmış hücre popülasyonlarının aynı anda toplanan dijital görüntüleri, temsili hücreleri ve hücre çekirdeğine yerleştirilen NF kappa B transının yoğunluğunu gösterir. R 8 48 ile uyarılan grupta NF, Kappa B ve PI boyamanın tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla daha parlak yoğunluğuna dikkat edin.

Bu tekniği farklı yaştaki donörlerden alınan hücreler üzerinde kullandık ve TLR aracılı NF kappa B aktivasyon yollarında farklılıklar gösterdik Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, görüntü analizi için ek süre içinde bir gün içinde yapılabilir ve hem birkaç lokalizasyon görüntüsüne hem de popülasyon istatistiklerine izin verir. Ek olarak, fiziksel ayrılma olmadan doğrudan çoklu hücre popülasyonundan gelen yanıtları görüntüleyebiliriz. Görüntü akışı, bir dizi hücresel mekanizmaya geniş çapta uygulanabilir ve translasyonel araştırmalarda çok değerli olmalıdır.