Name: Kültür Nöronlar Membran Proteinlerin Yanal Difüzyon ve ekzositoz Floresans Kurtarma ve Floresans kaybı Photobleaching kullanarak Değerlendirilen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Öğrenin, kültür hipokampal nöronlarda membran proteinlerinin ekzositoz ve yanal difüzyon dinamiklerini canlı hücre görüntüleme ve fotobeyazlama teknikleriyle analiz etmeyi. Bu yöntem, protein trafiği kinetiğini gerçek zamanlı görselleştirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz mali destek için Wellcome Trust ve ERC minnettarız. IMGG bir EMBO üyesidir. KLH bir BBSRC tarafından finanse edilen doktora öğrencisidir. Biz mikroskopları ile bakım ve yardım için teknik ve hücre kültürü destek ve Dr Andrew Doherty Philip Rubin ve Patrick Tidball teşekkür ederiz.

1. Hücre Kültürü, Viral Transdüksiyon ve Protein Ekspresyonu <ol><li> In vitro (DIV) içinde 14-25 gün süreyle poli-L-Lizin-kaplı cam lamelleri üzerinde embriyonik günde 18 (E18) sıçan yavru kültüre yüksek yoğunluklu hipokampal nöronlar. </li><li> 6-24 saat önce canlı deneyleri, süper ekliptik pHluorin (SEP) ile etiketlenmiş ilgi membran proteini içeren zayıflatılmış Sindbis virüs iletiminde hücreler. </li><li> Şartlandırılmış ortam 1mL içeren coverslip doğrudan psödoviriona-içeren orta ekleyin ve kültür inkübatöre geri. Viral iletimi sonrasında protein ekspresyonu için titre ve zaman virüs toplu bağlı olarak değişir ve önceden canlı hücre deneyler başlamadan her parti için belirlenmelidir. </li></ol> 2. FRAP-FLIP Canlı Hücre Görüntüleme <ol><li> Ekipman set-up <ol><li> Zeiss Axiovert LSM 510 META konfokal mikroskop görüntüleme odasına coverslip aktarın.Görüntüleme sırasında güç dalgalanmaları en aza indirmek için, mikroskop görüntüleme önce en az 20 dakika,% 100 lazer çıkışı ile açıldıktan sağlamak. </li><li> Derhal, önceden ısıtılmış ile kültür ortamı yerini (37 ° C) 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 15 mM glükoz, 1.5 mM CaCI2, 1,5 mM MgCl2, 20-25 mM HEPES (pH değerine ayarlanır içeren hücre dışı kayıt solüsyonu NaOH ile 7.4 &#39;) ve Zeiss Axiovert arasında önceden ısıtılmış aşama (37 ° C) üzerine haznesi yerleştirin. Ekstraselüler kayıt çözeltisi osmolarite da kültür ortamı içinde 10 mOsm sağlamak üzere ayarlanmaktadır. Anlamlı buharlaşma deney timecourse sırasında oluşur kaydıyla, bu CO 2 bağımsız çözüm kısa deneyleri (&lt;10 saat) için uygundur. 1-2 mM sodyum bikarbonat ile ilave tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Görüntü yakalama parametreleri tanımlama <ol><li> İlk olarak, rekombinant pro ifade Bir nöron tanımlamakilgi protein ve de odak noktası haline getirmek. </li><li> Bir 63X yağ itiraz, düşük güçte lazer 488nm lazer ışığı uyarım kullanarak tüm hücre bir görüntü kazanır. Photobleaching en aza indirmek için, toplam tarama hızı &lt;1 saniye tutarak hızlı bir nominal hızının (7-9) ve düşük piksel çözünürlüğü (512-512) kullanın. </li><li> ROI (~ 1.5-2.5 x optik zoom) içeren bir çerçeve yakalamak için resim ve yakınlaşma için dendrit bir kısmını seçin. Mümkün olan yerlerde, spesifik olmayan nedeniyle kazanım oluştuğu için photobleaching olup olmadığını belirlemek üzere, referans dendritler gelen ölçümler elde edilebilir, böylece görüş alanını içeren çeşitli işlemler sağlar. </li><li> Filtreleri, iğne deliği, tarama hızı ve minimal lazer uyarılma ile ancak sınırlı doygunluğu ile maksimum floresans dedektör kazanç sağlamak için ayarlayın. Büyük bir iğne deliği çapı (2μm dikenleri ve üçlü dendritler için uygundur) foton toplama maksimize etmek, tavsiye edilir. Dedektörü kazanç, küçük floresans artışlarla algılayacak kadar güçlü olmalıdırphotobleaching önce ilk görüntüleri, doymuş piksel% 10 üstesinden olmadığı gibi. </li><li> Önceden / post-ağartıcı ve deney geri kazanım aşamaları için kullanılmak üzere bu yapılandırma kaydedin. </li><li> Sonraki photobleach bölgelerin tanımlanması; sonraki tekrarlanan photobleaching aşaması için ilk photobleach ve komşu bölgeleri için bir yatırım getirisi seçerek. Komşu bölgeleri tarama (genellikle 5 mikron, bkz. 2) arasındaki difüzyon ile kurtarma önlemek için yeterince geniş olduğundan emin olun. </li><li> Photobleach İB&#39;leri hem çamaşır suyu parametreleri ayarlayın. İlk photobleach optik yakınlaştırma ve ROI hacmine bağlı olarak, 1-5 yinelemeler arasında gerektiren hızlı (0.1-0.5 sn) olmalıdır. Taarruzcu bölgeleri için, lazer eksitasyon taarruzcu bölgelerin sürekli photobleaching sağlamak için ayarlanabilir ancak fototoksik zarar vermeden edilmelidir. </li><li> Bir kılavuz olarak, tekrarlayan photobleaching ph% 100 lazer ilk photobleach için uyarma ve% 10 kullanınase. </li></ol></li><li> Görüntü edinimi <ol><li> Tüm parametreler ayarlandıktan sonra, aşağıda 4 blok belirtilen bir değişken zaman aralıklı görüntü sırası olarak FRAP-FLIP deneyi gerçekleştirmek: BLOK 1: 3-10 önceden çamaşır suyu bazal görüntüleri, düşük lazer gücü de, hiçbir zaman gecikmesi BLOK 2: Photobleach tam lazer güçte santral yatırım getirisi, 1-5 yineleme BLOK 3: 3-10 post-ağartıcı kurtarma görüntüleri 4 BLOK: 1 tipik bir zaman aralığında görüntü yakalama ile orta güçte lazer bölgeleri kuşatan tekrarlayan photobleach - 5 saniye, soruşturma altında protein toparlanma hızına bağlı. </li><li> Sonuç olarak, 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 15mm glükoz, 1.5 mM CaCI2, 1,5 mM MgCl2, 20-25 mM MES (floresans gidermek için) ya da 50 mM ile tamamlanır içeren PH6 azından tamponlu kayıt çözeltisi ile hücre dışı kayıt çözeltisi yerine NH4Cl 90 mM NaCl, 5 mM KCI, 15 mM glükoz, 1.8 mM CaCl2, 0.8 mM içerenMgCl2, 20-25 mM HEPES, pH7.4 (düşük pH intraselüler mağazalarda proteinleri ortaya çıkarmak için), (bakınız Şek. 2). </li><li> Istatistiksel analiz sağlamak için, her rekombinant protein için en az 10 ila 20 veri setleri toplayın. Önyargı sonuçları önlemek için, emin görüntüleme koşulları çoğaltır tutarlı korunur. Herhangi bir veri eksik ağartma, önemli bir odak düzlemi sürüklenme veya fototoksik hücre hasarı görülür kümeleri atın. </li></ol></li></ol> 3. Veri Analizi <ol><li> ImageJ yazılımı ile görüntüleri açın. </li><li> Stackreg eklenti (eklentiler → stackreg → dönüşümü ile zaman serisi boyunca oluşmuş olabilir xy düzleminde küçük dalgalanmaları hesaba yığınları Hizala: katı cisim → <ok> ). </ok></li><li> Zeiss konfokal çekilen görüntüler için, bir metin dosyası olarak zaman değerleri (eklentiler → EKK Araç → göster EKK Toolbox rapor etmek EKK Araç eklenti kullanmak → <apply stamps=""> → <apply t-stamp=""> )ve bir analiz elektronik tabloya bu değerleri aktarmak. </apply></apply></li><li> FRAP-FLIP deney sırasında floresans dalgalanmaları ölçmek için, bireysel piksel bölgeler (~ 20pixels) içine photobleached kesimi bölmek ve her zaman noktası (F) bu İB&#39;nin ortalama floresan ölçmek. Hızlı bir şekilde bu değerleri elde etmek için, ImageJ YG&#39;ni Yöneticisi &#39;analiz aracı (→ Araçlar → YG Müdürü Analiz) kullanarak birden İB&#39;leri seçin ve&#39; Arsa Z ekseni profili &#39;komutu (kullanarak piksel başına ortalama floresan rapor Görüntü → Yığınları → Arsa Z eksen profil). </li><li> Bir arka plan, olmayan floresan bölgenin floresan yoğunluğu ölçmek için bu adımı yineleyin. </li><li> Deneysel gürültü çıkarmak ve ortalama öncesi ağartılmış temel ölçü bütün değerleri bölmek için plan değerleri çıkarılarak her noktada floresan Normale. </li><li> Spesifik olmayan düzeyini değerlendirmek için bitişik olmayan photobleached dendritlerin floresan ölçünedinimi sırasında photobleaching. Non-spesifik photobleaching için düzeltme &#39;FRAP-FLIP&#39; verilerin yorumlanması için tavsiye edilmez ve mümkün olduğu kaçınılmalıdır. </li><li> Belirgin bir iyileşme ROI yer almıştır eğer hesaplamak için, ilk 5-10 önlemler (mesafe kadar taşınmış) ortalama gelen dizinin son 5-10 önlemlerin ortalama çıkarma ve istatistiksel anlamlılık belirler. Ekzositoz paterni (yani ekzositoz noktaları veya omurga vs mili kurtarma) değerlendirmek için kurtarma ve sivil kurtarma İB&#39;leri sınıflandırır. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Tipik FRAP-FLIP deneyinin sonuçları Şek. 2. Burada, Eylül ile etiketlenmiş AMPA tipi glutamat reseptörü, bir alt birim GluA2 ifade Bir nöron seçici dendrit bir bölge boyunca photobleached edilmiştir. Şekil 2.A görüntülendi ve (beyaz kutu bölgeleri) photobleaching için seçilmiştir İB&#39;leri işaret edilmiştir dendrit bölgesini göstermektedir. The büyük beyaz kutulu alan çift başlı mavi oklar ile vurgulanan yan kutulu bölgeler, ağartma tekrarlanan ardından, bir kez beyazlatılmış edildi. Kırmızı ok alt paneller yüksek büyütme gösterilen ölçülen yatırım getirisini gösterir. Şekil 2.B, deney süresi boyunca ölçülen ROI olarak floresans yoğunluğunu göstermektedir. Bu örnekte, bir dakika süre geri kazanım ağartılmamış reseptörleri yanal difüzyonu yoluyla ROI girmesine izin vermek için ilk photobleach sonra kaydedilmiştir. Komşu bölgeleri photobleached zaman, reseptörler bu son derece hareketli fraksiyonu floresans sinyal merkezi bölgeden tıkalı olup, bölge içinde olanlar dışarı seyreltilir. &#39;FLIP&#39; dizisi içinde gözlenen floresans (mesafe kadar taşınmış) artış dolayısıyla dendritik mili SEP-GluA2 yerleştirilmesi atfedilebilir. Düşük pH yıkama ve pH 7.4 &#39;+ NH4Cl Ayrıca, sırasıyla ölçülen floresans yüzeyi elde edilir teyitÖlçülen ROI içinde hücre içi, sekestre proteinlerin oranı proteinleri ve ortaya koymaktadır. FRAP aksine, bu metodoloji photobleached bölgede floresans iyileşme bir büyük ölçüde azaltılmış seviyesi ile sonuçlanan, nedeniyle ekzositoz için geri kazanım izole eder. Güvenilir bir matematiksel model Bugüne kadar uygun ve kurtarma bu seçici beyazlatma tekniği kullanılarak kaydedilen izleri analiz etmek için geliştirilmiştir. Bir mono üstel kurtarma ile kurtarma iz sığdırmak için, ancak mümkündür: F (t) = A s - A 0 e (-t / τ) F (t) t zamanında floresans olduğunda, A s, kararlı bir değerdir A 0 0 zamanında offset, τ sabit zamanı. Kurtarma büyüme ekleme ve difüzyon arasındaki istikrarlı bir duruma tekabül bir dengeye ulaşmak için belirli bir oranı ile sabittir. Önemli olarak, zaman sabiti bu ekstrakteANALİZ ekzositoz sabiti zaman yansıtmıyor ve yalnızca tek bir protein için karşılaştırmalı tedavisi için de kullanılabilir. Dahası, floresans iyileşme beklenen desen photobleached bölge boyunca alt etki gözlenmiştir olasıdır. Bir photobleached segmenti içindeki küçük ROI analizi ekzositoz &quot;noktaları&quot; ortaya çıkarmak için gerekli olabileceği ve bu hesaplanan oranı etkileyecek dendrit arasında bu lekelerin yoğunluğu değişkenliği gibi karşılaştırılabilir uzunlukları bölgeleri analiz etmek önerilir. Şekil 3, görüş alanı içinde birden çok dendritler ile büyük bölümü Getirisini photobleach uygulayarak Bu protokolün bir uzantısı gösterir, sadece tek bir dendrit ağartma seçici tekrarlanan izledi. Bu yaklaşım geleneksel &#39;FRAP&#39; ve paralel olarak elde edilecek &#39;FRAP-FLIP&#39; veri sağlar. Bu örnekte, hipokampal nöronlar kainat sınıfının bir glutamat reseptör subunit ile enfekte olmuştur; GluK2 SEP-etiketli. Priogörüntüleme için r, bu nöronlar-edildi protein sentezini bloke etmek cylcohexamide (200μg/ml az 2 saat) ile muamele edilir. Ilgili ölçülen İB&#39;leri (Şekil 3.B) böyle, floresan kurtarma &#39;FRAP-FLIP&#39; protokolü maruz dendrit yalnız standart FRAP dendrit karşı geri dönüşüm lateral difüzyon ve geri dönüşüm nedeniyle iyileşme oranı görüldüğü gibi. FRAP karşı &#39;FRAP-FLIP&#39; kurtarma eğrileri, geri dönüşüm göreli katkıları (mesafe kadar taşınmış rec = 11.05%) ve (mesafe kadar taşınmış fark =% 9.35) difüzyon lateralden mesafe kadar taşınmış değerleri karşılaştırarak varılabilir. Şekil 2 aksine, kurtarma protein sentezinin inhibisyonuna bağlı olarak istikrarlı bir devlet düzeyinde değil, korumak değildir, gösterir kullanılabilir reseptör havuzu (gözlenen yaklaşık% 20 düşüş tükenmesi için geçici bir artış ve buna karşılık gelen, sinyal açılan kapatma sonraki kayıt dönemi boyunca). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig1.jpg" /></p&gt; Şekil 1. Bu şematik SEP-tagged reseptörleri kullanarak, bir &#39;FRAP-FLIP&#39; protokolü karşı düzenli FRAP sonuçlarını göstermektedir FRAP vs FRAP-FLIP protokol müdürleri şematik. Geleneksel FRAP floresans kurtarma sol tarafta gösterilir. Merkez ROI ölçülen floresan kurtarma, geri dönüşüm ve / veya dendritik mile de novo ekzositoz yoluyla photobleached YG ve reseptörlerinin ekleme dışından yanal difüzyon f olmayan photobleached EYL-etiketli reseptörlerinin bir arada atfedilir. Buna karşılık, sağ tarafta gösterildiği kuşatan İB&#39;nin tekrarlayan photobleached gösterir nasıl yanal difüzyon nedeniyle bu modifiye &#39;FRAP-FLIP&#39; protokolü sessizlikleri kurtarma. Bunun gibi, herhangi bir ölçülen floresan kurtarma ROI doğrudan ekleme atfedilebilir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig2.jpg" /> Şekil 2.Dendritik mil üzerinde plazma zarı içine SEP-GluA2 yerleştirilmesi A) SEP-GluA2 dile getiren bir hipokampal nöron, seçici dendrit bir bölge boyunca photobleached. Sol üst paneli photobleaching için seçilmiştir İB&#39;leri vurgular ederken şematik, görüntülenmiştir edilmiştir dendrit bölgesini göstermektedir. Büyük beyaz kutulu alan çift başlı mavi oklar ile vurgulanan yan kutulu bölgeler, ağartma tekrarlanan ardından, bir kez beyazlatılmış edildi. Bu panel photobleaching öncesinde dendrit gösterir. Kırmızı ok alt paneller yüksek büyütme gösterilen ölçülen yatırım getirisini gösterir. B) Deney süresi boyunca ölçülen yatırım getirisi ile floresans şiddeti, ROI gri düzeyi (normalize değil) olarak çizilmiştir gösterir. Siyah ok ilk photobleach ve yeşil ok timepoint vurgulamak tekrarlayan photobleaching başlangıcını belirtir. Mesafe kadar taşınmış inci gösterirdendritik mile SEP-GluA2 yerleştirilmesi nedeniyle kurtarma dönemde gözlenen floresans e artış. Müteakip düşük pH ve pH 7.4 + NH4CI yıkar kurtarılan floresans ifade reseptörleri yüzey ile ilgilidir onaylayın. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig3.jpg" /> Şekil 3. Cyclohexamide tedaviyi takiben dendritik şaft üzerinde Geri Dönüşüm ve SEP-GluK2 lateral difüzyon vs Geri Dönüşüm A) hipokampal nöron paralel FRAP ve ayrı dendritik İB&#39;leri birlikte gerçekleştirilen &#39;FRAP-FLIP&#39; kurtarma protokolleri ile seçici photobleached SEP-GluK2, ifade. Bu nöron protein sentezi (200 mg / ml az 2 saat) engellemek için cyclohexamide ile ön tabi oldu. Şematik sol paneli photobleaching için seçilmiştir İB&#39;leri vurgulayarak, görüntülenmiştir edilmiştir dendrit bölgesini göstermektedir. The büyük beyaz kutulu alan çift başlı mavi oklar ile vurgulanır alt dendrit sadece bir yan kutulu bölgeler, ağartma tekrarlanan ardından, bir kez beyazlatılmış edildi. Bu panel öncesinde photobleaching için dendritler gösterir. Kırmızı oklar &#39;FRAP-FLIP&#39; protokolü karşı geleneksel FRAP içinde floresans toparlanma gösteren B yüksek büyütme gösterilen ROI) vurgulayın. Iyileşme geç evre (üçüncü panelleri) floresans şiddet seviyelerinde Karşılaştırmalar yalnız geri dönüşüm karşı yanal difüzyon ve geri dönüşüm katkısını göstermektedir. C) Deney süresi boyunca ölçülen İB&#39;leri içinde floresans yoğunluğu, şiddeti normalize olarak çizilmiştir gösterir değerleri. Siyah ok ilk photobleach ve yeşil ok timepoint vurgulamak tekrarlayan photobleaching başlangıcını belirtir. Mesafe kadar taşınmış rec FRAP / FLIP dendrit tespit reseptör geri dönüşüm nedeniyle geçici iyileşme gösterir iken mesafe kadar taşınmışdiff &#39;FRAP sadece&#39; yatırım getirisi ile dendritik mile SEP-GluK2 lateral difüzyon katkısını ölçer. Geçici bir artışa cyclohexamide tedavisi bir sonucu olarak kullanılabilir reseptörlerinin çalıştırma aşağıya karşılık gelen sinyal kademeli azalma, takip eder. Sonraki düşük pH ve pH 7.4 + NH4CI yıkar kurtarılan floresans ifade reseptörleri yüzey ile ilgilidir onaylayın.

<ol><li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li>
<li>Ashby, M. C., Ibaraki, K., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((It%27s+green+outside%3A+tracking+cell+surface+proteins+with+pH-sensitive+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">It's green outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP.</a> Trends Neurosci. 27, 257-261 (2004).</li>
<li>Swaminathan, R., Hoang, C. P., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photobleaching+recovery+and+anisotropy+decay+of+green+fluorescent+protein+GFP-S65T+in+solution+and+cells%3A+cytoplasmic+viscosity+probed+by+green+fluorescent+protein+translational+and+rotational+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Photobleaching recovery and anisotropy decay of green fluorescent protein GFP-S65T in solution and cells: cytoplasmic viscosity probed by green fluorescent protein translational and rotational diffusion.</a> Biophys. J. 72, 1900-1907 (1997).</li>
<li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).</li>
<li>Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging%3A+opportunities%2C+limitations%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins for live cell imaging: opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li>
<li>Ashby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+AMPA+receptors+%28AMPARs%29+from+synapses+is+preceded+by+transient+endocytosis+of+extrasynaptic+AMPARs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs.</a> J. Neurosci. 24, 5172-5176 (2004).</li>
<li>Bouschet, T., Martin, S., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-activity-modifying+proteins+are+required+for+forward+trafficking+of+the+calcium-sensing+receptor+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Receptor-activity-modifying proteins are required for forward trafficking of the calcium-sensing receptor to the plasma membrane.</a> J. Cell. Sci. 118, 4709-4720 (2005).</li>
<li>Ashby, M. C., Maier, S. R., Nishimune, A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+diffusion+drives+constitutive+exchange+of+AMPA+receptors+at+dendritic+spines+and+is+regulated+by+spine+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lateral diffusion drives constitutive exchange of AMPA receptors at dendritic spines and is regulated by spine morphology.</a> J. Neurosci. 26, 7046-7055 (2006).</li>
<li>Martin, S., Bouschet, T., Jenkins, E. L., Nishimune, A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+regulation+of+kainate+receptor+surface+expression+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Bidirectional regulation of kainate receptor surface expression in hippocampal neurons.</a> J. Biol. Chem. 283, 36435-36440 (2008).</li>
<li>Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-dependent+membrane+drift+recruits+AMPA+receptors+to+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamin-dependent membrane drift recruits AMPA receptors to dendritic spines.</a> J. Biol. Chem. 284, 12491-12503 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz plazma membran proteini ticareti bileşenleri görselleştirmek için yenilikçi bir strateji tanımlamak. SEP-etiketli protein ile teknikleri photobleaching of Kombinatoryal yaklaşım plazma zarı ekleme olaylar değerlendirilmelidir seçici sağlar. Sürekli iyileşme sırasında bölgelere komşu olan membran proteinleri photobleaching olarak, &#39;FRAP-FLIP&#39; yöntemi floresans kurtarma veziküler ticareti katkısını değerlendirir. Bu yeni yaklaşım belirlenecek kararlı durumda iyileşme gözlenir alt-bölme sayısı ve kurtarma (mesafe kadar taşınmış) genliği sağlayan proteinin membran ekleme doğrudan kayıt sağlar. Ayrıca, FLIP olan ve olmayan FRAP karşılaştırılması hesaplanacak yanal difüzyon kurtarma oranını atfedilebilir sağlar. Dahası, aynı deney, taarruzcu photobleached bölgeleri bitişik olmayan photobleached dendrit bölgeleri olabilirniteliksel kurtarma sırasında değerlendirilir; bu bölgelerde gözlenen floresans kaybı dendrit bu non-photobleached segmente photobleached reseptörlerinin yanal difüzyon nedeniyle olacak. Bu seçici photobleaching protokolü gibi (örneğin, dendritler ya omurga) veya paralel FRAP yaparak yanal difüzyon vs yerleştirilmesi katkı değerlendirilmesi ve &#39;FRAP tanımlandığı subareas plazma membranında excocytosis karakterize olarak hücresel ticareti işlemlerin çeşitli araştırmak için yararlanılabilir bitişik dendritler boyunca-FLIP &#39;protokolleri (Şekil 3). Özel yönergeler sunulmuştur ise Açıkçası, her laboratuar spesifik örnekler ve ekipmanları göre görüntüleme parametrelerini optimize gerekir. Önemlisi, ROI tüm yüzey reseptörleri, photobleached z ekseni odak düzlemli bağımsız, fakat önemli fototoksik hasar veya spesifik olmayan photobleaching olmadan gerekir. BizeHücre soma bu protokol çalışırken ers nispeten düşük pH içi genellikle bölümlerinde bu bölgelerde yüksek eşiğe sonuçları yüksek yüzdesi olarak, dikkatli olmalıdırlar. Ayrıca, önceden üzerinde seçici bir photobleaching deney başlamadan, şekillerde değişir bu teknikte uygulanabilir nasıl göstermiştir iken, yeni bir Eylül-etiketli yapı, bu reseptörler etiketlenmiş bir başlangıç ​​karakterizasyonu birinci Ashby ve arkadaşları tarafından açıklanan şekilde, biçimde ifa edildiği hususu tavsiye 2. Genel olarak, bu yöntem yakın gerçek zamanlı olarak değerlendirilmek üzere plazma membranında ekleme olaylar sağlayan, standart FRAP protokol güçlü ve çok yönlü bir uyarlamasıdır.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strongReaktifin&gt; Adı</strong</td&gt;<td<strong&gt; Şirket</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog numarası</strong</td&gt;<td<strong&gt; Yorumlar (isteğe bağlı)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24mm cam lamelleri</td&gt;<td&gt; VWR International</td&gt;<td&gt; 631-0161</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Poli-L-Lizin</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P2636</td&gt;<tdKat lamelleri için borat tampon&gt; 1mg/ml</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Neurobasal Orta</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 21103</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B27</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td&gt; 2 nöronal kaplama konusunda% ve orta beslenme</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Penisilin Streptomisin</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P0781</td&gt;<td&gt; 1 nöronal kaplama konusunda% ve besleme orta</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; L-Glutamine</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 25030</td&gt;<tdOrta kaplama / beslenmesinde&gt; 2mm / 0.8mm</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; At Serum</td&gt;<td&gt; Biosera</td&gt;<td&gt; DH-291H</td&gt;<tdNöronal kaplama medya&gt;% 10 sadece</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PSIN ReP5 klonlama vektörü</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K75001</td&gt;<td&gt; Sindbis virüs üretimi için</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LSM510 META konfokal sistemi</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Görüntü J Yazılım</td&gt;<td&gt; NIH</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; Açık erişim yazılımı. Burada açıklanan tüm eklentileri temin edilebilir<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/"&gt; Http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/</a</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

kültür nöronlar membran proteinlerin yanal difüzyon ve ekzositoz floresans kurtarma ve floresans kaybı photobleaching kullanarak değerlendirilen

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

<p class="jove_content"Bu reseptörler ve iyon kanalları gibi&gt; Zar proteinleri son derece kutuplaşmış ve morfolojik karmaşık nöron, aktif kaçakçılığı uğrarlar. Bu yönettiği kaçakçılığı, teslim korumak veya sinaptik proteinlerin kaldırmak için temel önem taşımaktadır.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Süper ekliptik pHluorin (SEP) oranda plazma membran proteinlerinin canlı hücre görüntüleme beri kullanılmaktadır EGFP bir pH-duyarlı türevidir<sup&gt; 1-2</sup&gt;. Düşük pH&#39;da SEP&#39;in protonasyon foton emilimini azaltır ve floresans emisyon ortadan kaldırır. Çoğu hücre içi kaçakçılığı olayları Eylül floresans tutulduğu olduğunu düşük pH, SEP-etiketli proteinlerin floresans sinyali ile bölümlerinde meydana geldiğinde SEP nötr pH ekstrasellüler ortama maruz plazma membranından ağırlıklı olarak. Yüksek yoğunluklu Eylül az aydınlatılmış zaman, her floresan boya gibi (photobleached) geri dönüşümsüz fotoyaşlanma olduğunu<sup&gt; 3-5</sup&gt;. Önemlisi, düşük pH foton emilimi doyurur, çünkü sadece yüzey intrasellüler SEP, yüksek yoğunluklu aydınlatma etkilenmez ise Eylül photobleached edilebilir ifade<sup&gt; 6-10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"SEP-etiketli proteinlerin&gt; FRAP (photobleaching sonra floresans kurtarma) plazma membran proteini dinamikleri değerlendirmek için kullanışlı ve güçlü bir tekniktir. Floresan etiketli proteinlerin ilgi bir bölgede photobleached zaman (ROI) floresans kurtarma ağartılmış bölgeye ağartılmamış SEP-etiketli proteinlerin hareketi nedeniyle oluşur. Bu, her iki tarafından sağlanan non-photobleached reseptörlerinin ekzositoz gelen yanal difüzyon ve / veya yoluyla meydana gelebilir<em&gt; De novo</em&gt; Sentezi veya geri dönüşüm (bkz. Şekil. 1). Hareketsiz ve hareketli protein fraksiyonu tespit edilebilir ve difüze fraksiyonun hareketlilik ve kinetik Böyle agonist uygulama ya da bu tür NMDA ya KCl uygulama olarak nöronal aktivasyon uyaran olarak bazal koşullar altında ve uyarılmış sorgulanabilir<sup&gt; 8,10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Biz seçici ekzositoz atfedilebilecek floresans kurtarma görselleştirmek için tasarlanmıştır photobleaching teknikleri anlatıyoruz. Kısaca, bir yatırım getirisi komşu bölgeleri ağartma tekrarlayan tarafından, kısa bir kurtarma sonra, takip, standart FRAP protokolleri ile bir kez photobleached edilir. Bizim laboratuarımızda geliştirilen bu &#39;FRAP-FLIP&#39; protokolü, dendritik dikenler de AMPA reseptör ticareti karakterize için kullanılmıştır<sup&gt; 10</sup&gt; Ve intraselüler ticareti ve ekzositoz değerlendirmek için ticareti çalışmaları, geniş bir aralık için de geçerlidir.</p

Bu rapor yüzey ekspresyonu, ulaşım yolları ve dışsal olarak ifade edilen, pH-duyarlı GFP-etiketli nöronların plazma membran proteinlerinin kaçakçılığı kinetik belirlemek için canlı hücre görüntüleme ve photobleach tekniklerinin kullanımı anlatılmaktadır.

Kültür Nöronlar Membran Proteinlerin Yanal Difüzyon ve ekzositoz Floresans Kurtarma ve Floresans kaybı Photobleaching kullanarak Değerlendirilen

Reseptörler ve iyon kanalları gibi membran proteinleri, oldukça polarize ve morfolojik olarak karmaşık olan nöronlarda aktif trafiğe uğrarlar. Bu ...

Bu prosedürün genel amacı, nöronal proteinlerin plazma membranına yerleşimini görselleştirmektir. Bu işlem, öncelikle kültürlenmiş hipokampal nöronların, süper ekliptik, Florin veya sep ile etiketlenmiş ilgili proteinin ekspresyonu için sinus virüsü ile enfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, bir ilgi alanı veya ROI fotobleyke edilir.Ardından, orijinal ilgi alanı floresan olarak geri kazanmaya bırakılırken, çevreleyen segmentler tekrarlayan şekilde foto-beyazlatılır. Son olarak, ilgi alanındaki floresan geri kazanımı analiz edilir. Nihayetinde, geleneksel FRAP deneylerine yapılan bu adaptasyon, hedef proteinin plazma membranındaki ekzositoz olaylarının paternini göstermek için kullanılır.Bu tekniğin, yüzey biyotinilasyonu veya antikor beslemesi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, membran ekleme olaylarının dinamiğinin görselleştirilmesine olanak tanımasıdır. Bu yöntemler, ekzositoz olaylarının nerede ve nasıl gerçekleştiğini belirleyerek protein trafiğine ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem fikri ilk olarak, canlı hücre deneylerinde spine yapılarındaki ekzositoz olaylarını inceleyebilmek için yüzey biyotinilasyonuna bir alternatif ararken ortaya çıktı. Öncelikle, canlı deneyden 6 ila 24 saat önce, embriyonik 18. gün yavrularından elde edilen yüksek yoğunluklu hipokampal nöronları, poli-L-lizini kaplı lamlar üzerinde 14 ila 25 gün boyunca in vitro olarak kültüre edin.Hücreleri, SUP ekliptik florür osep ile işaretlenmiş, ilgili membran proteinini kodlayan symbis virüsü ile transduse edin. Psödovirion içeren ortamı, bir mililitre kondisyonlu ortam içeren lamelye doğrudan ekleyin ve hücreleri kültür inkübatörüne geri yerleştirin. Hücreleri görüntülemek için, görüntülemeden en az 20 dakika önce %100 lazer çıkışı ile bir zes axia vert LSM beş 10 meta konfokal mikroskobu çalıştırın.Görüntüleme sırasında güç dalgalanmalarını en aza indirmek ve sahneyi önceden ısıtmak için. Mikroskop hazır olduğunda, 63 kat objektifi seçin, ardından lameli görüntüleme haznesine aktarın ve kültür ortamını derhal değiştirin. Önceden ısıtılmış hücre dışı kayıt çözeltisi ile.Hazne önceden ısıtılmış mikroskop tablasına yerleştirin. Bu prosedürün en zor yönü, kayıt işlemi sırasında hücrelerin sağlığının bozulmamasını sağlamaktır. Bu protokol, başarıyı garantilemek için kapsamlı fotobeyazlatma gerektirdiğinden, büyük ölçekli deneylere başlamadan önce tüm görüntüleme parametrelerinin optimize edildiğinden emin olun ve yüksek kaliteli görüntüler yerine hızlı veri toplama yöntemini tercih edin.Görüntüleme yakalama parametrelerini tanımlamak için, ilgilenilen rekombinant proteini eksprese eden bir nöron belirleyin ve onu odak noktasına getirin. Fotobeyazlamayı minimize etmek için, düşük güçte 4 88 nanometre lazer kullanarak hücrenin tamamını tarayın.Hızlı bir nominal hız ve düşük piksel çözünürlüğü kullanın. Toplam tarama hızını bir saniyenin altında tutun. Görüntülenecek dendritin bir kısmını seçin ve 1,5 ile 2,5 arası bir optik zoom kullanın.Spesifik olmayan fotobezme (photo bleaching) oluşup oluşmadığını belirlemek için ilgi alanını içeren bir kare yakalayın. Referans dendritlerden ölçümler alınabilmesi için görüş alanının birkaç süreç içerdiğinden emin olmaya çalışın. Bir aralık gösterge paleti kullanarak, sınırlı doygunlukla beraber minimum lazer uyarımıyla maksimum floresan elde edecek şekilde görüntüleme parametrelerini ayarlayın.Foton toplama kapasitesini maksimize etmek için geniş bir iğne deliği çapı önerilir. Detektör kazancı, fotobleaching öncesindeki ilk görüntülerin doygun piksellerinin %10'unu geçmeyeceği şekilde, küçük floresan artışlarını tespit edebilecek kadar güçlü olmalıdır. Orta hat odak düzleminin elde edildiğinden emin olmak için odağı ayarlayın.Konfigürasyonu ayarladıktan sonra, deneyin ön ve son toparlanma aşamalarında kullanılmak üzere kaydedin. Ardından, fotobezme bölgelerini tanımlayın. Başlangıç fotobezmesi için bir ilgi alanı veya ROI ve ardından gelen tekrarlayan fotobezme aşaması için yan bölgeler seçerek işlemi gerçekleştirin.İlk fotoblancaj işlemi için hem merkezi hem de yan ROI'ler fotoblançlanacaktır. Tekrarlayan fotoblancaj işlemi için ise yalnızca yan ROI'ler seçilir. Yan bölgelerin, taramalar arasında difüzyon yoluyla geri kazanımı önleyecek kadar geniş olduğundan emin olun.Her iki fotobleaching ROI'si için çamaşır suyu parametrelerini ayarlayın. Optik yakınlaştırmaya ve ROI hacmine bağlı olarak, başlangıç fotobleaching işlemi bir ila beş yineleme gerektiren hızlı bir işlem olmalıdır. Yan bölgeler için, lazer eksitasyonu, fototoksik hasar oluşturmadan sürekli fotobleaching'i sağlayacak şekilde ayarlanmalıdır. Parametreler belirlendikten sonra, önce düşük lazer gücünde ve zaman gecikmesi olmadan üç ila 10 adet preble baseline görüntü alarak, değişken zaman atlamalı bir görüntü dizisi şeklinde bir FRA flip deneyi gerçekleştirin.Ardından, merkezi ROI'yi tam lazer gücünde bir ila beş iterasyon boyunca fotobezat edin. Daha sonra, beyazlatma sonrası üç ila 10 kurtarma görüntüsü alın. İncelenen proteinin kurtulma hızına bağlı olarak, tipik bir bir ila beş saniyelik görüntü yakalama zaman aralığıyla, yan bölgelerin orta lazer gücünde tekrarlayan fotobezat işlemini gerçekleştirin.Son olarak, floresan söndürmek için hücre dışı kayıt çözeltisini pH altı seviyesinde tamponlanmış kayıt çözeltisiyle değiştirin veya düşük pH'lı hücre içi depolardaki proteini açığa çıkarmak için 50 millimolar amonyum klorür içeren bir tampon kullanın. Yanlı sonuçlardan kaçınmak ve istatistiksel analize olanak sağlamak için her bir rekombinan protein için en az 10 ila 20 veri seti toplayın; tekrarlar boyunca görüntüleme koşullarının korunduğundan emin olun. Görüntüleri analiz etmek için bunları açın.Zaman serisi boyunca XY düzleminde meydana gelmiş olabilecek küçük dalgalanmaları gidermek için Image J yazılımını kullanarak yığınları hizalayın. ZeS konfokal mikroskobunda çekilen görüntüler için stack reg eklentisini kullanın; zaman değerlerini bir metin dosyası olarak raporlamak için LSM toolbox eklentisini kullanın ve floresan dalgalanmalarını ölçmek için bu değerleri bir analiz hesap tablosuna aktarın. FRA flip deneyi sırasında, birden fazla ROI seçmek için görüntü ROI yöneticisi analiz aracını kullanarak fotobleş segmentini bireysel piksel bölgelerine ayırın.Ardından, her bir zaman noktasındaki piksel başına ortalama floresan değerini ölçmek için plot Z axis profile komutunu kullanın. Floresan özelliği taşımayan bir arka plan bölgesinin ortalama floresan yoğunluğunu ölçmek için işlemi tekrarlayın. Deneysel gürültüyü gidermek için arka plan değerlerini çıkararak her bir zaman noktasındaki floresan yoğunluğunu normalize edin ve tüm değerleri, ağartma öncesi ortalama bazal ölçüm değerine veya ağartma sonrası hemen alınan değere bölün.Önemli bir geri kazanımın gerçekleşip gerçekleşmediğini hesaplamak için, zamanla çizilen her bir ROI için geri kazanım izini inceleyin. Bir ROI içerisinde, fotobeyazlama geri kazanım dizisinin son beş ila on ölçümünün ortalamasından, ilk beş ila on ölçümün ortalamasını çıkararak delta F değerini hesaplayın. Ardından, delta F'nin istatistiksel anlamlılığını belirleyin ve ekzositoz paternini değerlendirmek için geri kazanan ve geri kazanmayan ROI'leri karakterize edin.Bunlar ekzositoz sıcak noktaları veya dikenciye karşı gövde geri kazanımıdır. Bu video, SERP glukoz kullanılan tipik bir frap flip deneyinin temsilci sonucunu göstermektedir. İki.Bir dendrit bölgesi bir kez fotobleaching işlemine tabi tutulur ve ardından bir dakikalık bir toparlanma süresi beklenir. Ardından, mavi oklarla belirtilen yan bölgelerin tekrarlayan fotobleaching işlemine başlanır. Kırmızı ok, floresan toparlanmasının gözlemlendiği küçük bir ilgi alanını vurgulamaktadır; bu alan ekranın sağ panelinde büyütülmüş olarak gösterilmiştir.Recovery, aşağıdaki grafikte takip edilmektedir ve floresansındaki genel artış delta F olarak işaretlenmiştir. Bu dizi boyunca gözlemlenen floresans artışı, dendritik şafta glue A two eklenmesine bağlanabilir. Deneyin sonundaki floresans yoğunluğundaki büyük değişimler, düşük pH'ın ve pH 7.4 artı amonyum klorür yıkamalarının sep floresans sinyali üzerindeki etkisini göstermektedir. Bu örnekte, nöronlar SEP glue K two ile enfekte edilmiştir.Burada, görüş alanında birden fazla dendrit bulunan geniş bir ROI fotobleyç edilmiş, ardından yalnızca bir dendritin seçici ve tekrarlayıcı fotobleyç işlemi gerçekleştirilmiştir. Protein sentezini engellemek amacıyla, görüntüleme öncesinde bu nöronlar iki saat boyunca sikloheksimid ile işleme tabi tutulmuştur. Bu sayede, ölçülen ilgili ROI'lerdeki floresan geri kazanımı, standart FRAP dendritlerinde lateral difüzyon ve geri dönüşümden kaynaklanan geri kazanım oranını, FRAP-FLIP protokolüne tabi tutulan dendritlerde ise yalnızca geri dönüşümden kaynaklanan oranı ortaya çıkarmaktadır.FRAP ile FRAP-flip geri kazanım eğrilerinden elde edilen delta F değerleri karşılaştırılarak, protein sentezinin inhibisyonu sayesinde geri dönüşümün lateral difüzyona göre göreli katkıları çıkarılabilir. Geri kazanım, mevcut reseptör havuzu tükendikçe sinyalde sonraki bir düşüş göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, nöronlarda başarılı görüntüleme deneylerinin nasıl kurulacağı, uygulanacağı ve analiz edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmanız gerekir.Bu fotobezirme teknikleri kombinasyonunu kullanarak, ilgilendiğiniz protein için membran yerleşimi kanıtlarını inceleyebilirsiniz.

lateral-diffusion-exocytosis-membrane-proteins-cultured-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Vezikül serbest kinetiği ölçmek için yeteneği nörotransmisyon bazı temel içgörü sağlamak yardımcı olabilir. Burada kırmızı floresan boya FM 4-64 etiketli veziküller presinaptik hipokampal nöron kültürlerinde vezikül serbest hızını ölçmek için gerçek zamanlı görüntüleme kullanılır.

Nöronlar FM Etiketleme kullanarak ölçüm ekzositoz

Bu video, nöronal veziküllerin hareketlerini görselleştirmek için belirli floresan proteinlerle nasıl etiketlendiğini gösterir. İlk olarak, bir floresan proteini kodlayan bir plazmit, bir transfeksiyon ajanı ile inkübe edilir ve daha sonra bir nöron kültürüne sokulur. Daha sonra, veziküllerin hareketini izlemek için nöronların görüntüleri elde edilir ve analiz edilir.

Floresan Görüntüleme Kullanılarak Nöronlardaki Vezikül Motilitelerinin Görselleştirilmesi

Biz canlı hücre konfokal görüntüleme vasıtasıyla, endoplazmik retikulum (ER) içerisinde yerleşik transfekte floresan protein dağılımı ve hareketliliği incelemek için kullanılan görüntüleme yaklaşımı tarif eder. Biz de ultrastruktural bu subselüler bölmesinin mimarisi üzerine kendi ifade etkisini analiz.

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

Plazma zarı proteinlerinin ve lipitlerinin mekansal dağılımı ve zamansal dinamikleri biyolojide sıcak bir konudur. Burada bu sorun, kavramsal olarak tek parçacık izlemenin aynı fiziksel miktarlarını sağlayan bir uzaysal-zamansal görüntü dalgalanma analizi ile ele alınmaktadır, ancak küçük moleküler etiketler ve standart mikroskopi kurulumları kullanır.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

Bu makale, bir sinaptobrevin2-pHluorin yapısı ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanarak nöroblastom hücrelerinde nörotransmitter vezikül dinamiklerini araştırmak için bir yöntem sağlar. Görüntü işleme ve veri analizi için geliştirilen strateji de raporlanmaktadır.

TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi

Işık mikroskobu teknikleri, biyokimyasal tahlillerle birleştiğinde, netrin bağımlı akson dallanmasında SNARE aracılı ekzositozun katılımını aydınlatmaktadır. Bu tekniklerin kombinasyonu, akson dallanmasını ve hücre şekli değişikliğini kontrol eden moleküler mekanizmaların tanımlanmasına izin verir.

Kombine Metodolojileri kullanan Akson Dallanman ve Nöronal Morfogenez sırasında Plazma Membran Teslimat Rolü tanımlayın

Membran kaçakçılığının araştırılması, nöronal işlevleri anlamada çok önemlidir. Burada, nöronlarda vezikül hareketliliğini ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu, sinir sistemindeki zar ticaretinin miktarına uyarlanabilen uygun bir yöntemdir.

Floresan Probları Kullanan Kültürlü Nöronlarda Endozom ve Lizozom Hareketlerinin Nicelendirilmesi

Sinaptik iletim için gerekli olan hücre altı olayları görselleştirmek için iki ilgili yöntem tanımlanmıştır. Bu protokoller, in vitro kültürlü nöronların canlı hücre görüntülemesini kullanarak presinaptik kalsiyum akışı ve sinaptik vezikül membran füzyonunun dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Sıkı bağlamak, Yeşil Floresan Protein (GFP) etiketli kültür hücreleri proteinlerin hareketliliği ölçmek için kullanılır olmuştur. Biz photobleaching sonra floresan kurtarma yüzdesi analiz ederek, GFP mobil / hareketsiz kesirler inceledi. Bu çalışmada, sıkı bağlamak hipokampal nöronlar, dikenler yapıldı.

Kültür Hipokampal Nöronlar Dendritik Spine Floresan Takip edilen Proteinler Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak)

Çok sayıda yeni çalışmalar sinaptik proteinlerin beyin patolojileri ile ilişkili mutasyonlar belirledik. Primer kültür kortikal nöronların dendritik omurga morfoloji ve motilite bu hastalıkla ilişkili proteinlerin etkilerini inceleyen büyük esneklik sunar.

Kültür MSS Nöronlar Dendritik Omurga Morfoloji Analizi

Öğrenin, kültür hipokampal nöronlarda membran proteinlerinin ekzositoz ve yanal difüzyon dinamiklerini canlı hücre görüntüleme ve fotobeyazlama teknikleriyle analiz etmeyi. Bu yöntem, protein trafiği kinetiğini gerçek zamanlı görselleştirmeyi sağlar.

Kültür Nöronlar Membran Proteinlerin Yanal Difüzyon ve ekzositoz Floresans Kurtarma ve Floresans kaybı Photobleaching kullanarak Değerlendirilen (Video) | JoVE Journal

Kültür Nöronlar Membran Proteinlerin Yanal Difüzyon ve ekzositoz Floresans Kurtarma ve Floresans kaybı Photobleaching kullanarak Değerlendirilen

Daha fazla video keşfet