Kültür Nöronlar Membran Proteinlerin Yanal Difüzyon ve ekzositoz Floresans Kurtarma ve Floresans kaybı Photobleaching kullanarak Değerlendirilen

Bu prosedürün genel amacı, nöronal proteinlerin plazma zarı yerleştirilmesini görselleştirmektir. Bu, ilk olarak süper ekliptik, Florin veya sep ile etiketlenen ilgilenilen proteini ifade etmek için kültürlenmiş hipokampal nöronları sinüs virüsü ile enfekte ederek gerçekleştirilir. Daha sonra, bir ilgi alanı veya yatırım getirisi fotoğraf ağartılır.

Daha sonra, orijinal ilgilenilen bölgenin floresan bir şekilde iyileşmesine izin verilirken, yan segmentler tekrar tekrar fotoğrafla ağartılır. Son olarak, ilgilenilen bölgedeki floresan geri kazanımı analiz edilir. Sonuç olarak, geleneksel frap deneylerine bu adaptasyon, plazma zarındaki hedef proteinin ekzositoz olaylarının modelini göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin yüzey biyotonasyonu veya antikor besleme gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, membran yerleştirme olaylarının dinamiklerinin görselleştirilmesini sağlamasıdır. Bu yöntemler, protein kaçakçılığındaki temel soruların ele alınmasına yardımcı olabilir, ekzositoz olaylarının nerede ve nasıl meydana geldiğini bize belirler. Bu fikir ilk olarak, çim yaşlanmasına bir alternatif ararken ve canlı hücre deneylerinde dikenlerde ekzositoz yedililerini inceleyebilmek için aklıma geldi: Embriyonik 18. günden yüksek yoğunluklu hipokampal nöronları kültürlemeye başlamak için, canlı deneyden altı ila 24 saat önce in vitro olarak 14 ila 25 gün boyunca poliol lizin kaplı cam örtü fişlerine sarılmış yavrular.

Hücreleri, SUP ekliptik flor osep ile yazılmış, ilgilenilen membran proteinini kodlayan symbis virüsü ile transdüksiyon. Psödovirion'u ekleyin, besiyerini doğrudan bir mililitre şartlandırılmış besiyeri içeren kapak fişine ekleyin ve hücreleri kültür inkübatörüne geri koyun. Hücreleri görüntülemek için, görüntülemeden önce en az 20 dakika boyunca %100 lazer çıkışlı bir zes axia vert LSM beş 10 meta konfokal mikroskobu açın.

Görüntüleme sırasında güç dalgalanmalarını en aza indirmek ve sahneyi önceden ısıtmak için. Mikroskop hazır olduğunda, 63 kez objektifi seçin, ardından kapak fişini görüntüleme odasına aktarın ve kültür ortamını hemen değiştirin. Prewarm hücre dışı kayıt çözümü ile.

Odayı önceden ısıtılmış mikroskop tablasına yerleştirin. Bu prosedürün en zor yönü, kayıt işlemi sırasında hücrelerin sağlığının tehlikeye atılmamasını sağlamaktır. Bu protokol başarıyı sağlamak için kapsamlı fotoğraf ağartma gerektirdiğinden, büyük ölçekli deneylere başlamadan önce tüm görüntüleme parametrelerinin optimize edildiğinden emin olun ve yüksek kaliteli görüntüler yerine hızlı çekimi tercih edin.

Görüntüleme yakalama parametrelerini tanımlamak için, ilgilenilen rekombinant bir proteini ifade eden bir nöronu tanımlayın ve onu odak noktasına getirin. Düşük güçte 4 88 nanometre lazer kullanarak tüm hücreyi tarayın. Foto ağartmayı en aza indirmek için.

Yüksek nominal hız ve düşük piksel çözünürlüğü kullanın. Toplam tarama hızını bir saniyeden daha az tutmak. 1,5 ila 2,5 arasında bir optik yakınlaştırma kullanarak görüntü için dendritin bir bölümünü seçin.

Spesifik olmayan fotoğraf ağartmasının meydana gelip gelmediğini belirlemek için ilgilenilen bölgeyi içeren bir çerçeve yakalayın. Referans dendritlerden ölçümlerin elde edilebilmesi için görüş alanının birkaç işlem içerdiğinden emin olmaya çalışın. Bir aralık göstergesi paleti kullanarak, minimum lazer uyarımından maksimum floresan sağlamak için görüntüleme parametrelerini, ancak sınırlı doygunlukla ayarlayın.

Foton toplamayı en üst düzeye çıkarmak için büyük bir iğne deliği çapı önerilir. Dedektör kazancı, foto ağartmadan önceki ilk görüntülerin doymuş piksellerin %10'unu aşmaması için küçük floresan artışlarını algılayacak kadar güçlü olmalıdır. Orta hat odak düzleminin elde edildiğinden emin olmak için odağı ayarlayın.

Yapılandırmayı ayarladıktan sonra, denemenin kurtarma öncesi ve sonrası aşamalarında kullanılmak üzere kaydedin. Ardından, fotoğraf ağartıcı bölgelerini tanımlayın. İlk foto ağartıcı için bir ilgi alanı veya ROI seçerek ve sonraki tekrarlayan foto ağartma aşaması için yan bölgeler seçerek.

İlk fotoğraf ağartıcı için, hem merkezi hem de yan ROI'ler fotoğraf ağartılacaktır. Tekrarlayan foto ağartıcı için ise yalnızca yan ROI'ler seçilir. Yan bölgelerin, taramalar arasında difüzyon yoluyla kurtarmayı önleyecek kadar geniş olduğundan emin olun.

Her iki fotobleach ROI'si için ağartma parametrelerini ayarlayın. İlk fotoğraf ağartıcı, optik yakınlaştırmaya ve ROI'nin hacmine bağlı olarak bir ila beş yineleme gerektiren hızlı olmalıdır Yan bölgeler için, lazer uyarımı, sürekli fotoğraf ağartmayı sağlamak için ayarlanmalıdır, ancak fototoksik hasar olmadan. Parametreler ayarlandıktan sonra, önce zaman gecikmesi olmadan düşük lazer gücünde üç ila 10 preble temel görüntü elde ederek değişken hızlandırılmış bir görüntü dizisi olarak bir FRA çevirme deneyi gerçekleştirin.

Ardından, merkezi ROI'yi bir ila beş yineleme için tam lazer gücünde foto ağartın. Ardından, ağartma sonrası üç ila 10 kurtarma görüntüsü elde edin. İncelenen proteinin geri kazanım hızına bağlı olarak bir ila beş saniyelik tipik bir zaman aralığında görüntü yakalama ile orta lazer gücünün yan bölgelerinin tekrarlayan bir fotoğraf ağartıcısını gerçekleştirin.

Son olarak, floresansı söndürmek için, hücre dışı kayıt çözeltisini pH altıda tamponlanmış kayıt çözeltisi ile değiştirin veya proteini düşük pH'lı hücre içi depolarda ortaya çıkarmak için 50 milimolar amonyum klorür ile tamamlanmış bir tampon kullanın. Yanlılık sonuçlarından kaçınmak için istatistiksel analizi mümkün kılmak için her rekombinant protein için en az 10 ila 20 veri seti toplayın, görüntüleme koşullarının kopyalar arasında korunduğundan emin olun. Görüntüleri analiz etmek için açın.

Image J yazılımını kullanarak, zaman serisi boyunca meydana gelmiş olabilecek XY düzlemindeki küçük dalgalanmaları hesaba katmak için yığınları hizalayın. Bir zes confocal üzerinde çekilen görüntüler için stack reg eklentisini kullanarak, zaman değerlerini bir metin dosyası olarak raporlamak için LSM araç kutusu eklentisini kullanın ve floresan dalgalanmalarını ölçmek için bu değerleri bir analiz elektronik tablosuna aktarın. FRA çevirme deneyi sırasında, birden fazla ROI seçmek için görüntü ROI yöneticisi analiz aracını kullanarak fotoğraf ağartma segmentini ayrı piksel bölgelerine bölün.

Ardından, her zaman noktasında piksel başına ortalama floresansı ölçmek için Z ekseni profili çiz komutunu kullanın. Arka plandaki grip olmayan bir floresan bölgenin ortalama floresan yoğunluğunu ölçmek için işlemi tekrarlayın. Deneysel gürültüyü gidermek için arka plan değerlerini çıkararak her bir zaman noktasındaki floresan yoğunluğunu normalleştirin ve tüm değerleri ortalama ağartılmış öncesi temel ölçüye veya ağartma sonrası ortalama değere bölün

Önemli bir kurtarmanın gerçekleşip gerçekleşmediğini hesaplamak için zamana karşı çizilen her ROI için kurtarma izini inceleyin. Bir ROI'de, fotoağartıcı geri kazanım dizisinin ilk beş ila 10 ölçümünün ortalamasını son beş ila 10 ölçümün ortalamasından çıkararak delta F'yi hesaplayın. Daha sonra delta F'nin istatistiksel anlamlılığını belirleyin ve ekzositoz modelini değerlendirmek için iyileşen ve iyileşmeyen Rois'yi karakterize edin.

Bu, ekzositoz sıcak noktaları veya omurgaya karşı şaft iyileşmesidir. Bu video, SERP yapıştırıcısı kullanan tipik bir frap flip deneyinin temsili sonucunu göstermektedir. Bir iki.

Dendritin bir bölgesi bir kez fotoğrafla ağartılır ve ardından bir dakikalık bir iyileşme süresi gelir. Yan bölgelerin tekrarlayan foto ağartması daha sonra mavi oklarla gösterilen şekilde başlatılır. Kırmızı ok, ekranın sağ panelinde büyütülmüş olarak gösterilen, floresan geri kazanımının gözlemlendiği küçük bir ilgi alanını vurgular.

Geri kazanım, delta F olarak işaretlenmiş floresansta genel bir artış ile aşağıdaki grafikte izlenir.Bu dizi üzerinde gözlenen floresan artışı, dendritik şafta tutkal A ikisinin yerleştirilmesine bağlanabilir. Deneyin sonunda floresan yoğunluğundaki büyük değişiklikler, düşük pH ve pH 7.4 artı amonyum klorür yıkamalarının sep floresan sinyali üzerindeki etkisini göstermektedir. Bu örnekte, nöronlar SEP yapıştırıcı K iki ile enfekte edilmiştir.

Burada, görüş alanında birden fazla dendrit içeren büyük bir ROI foto ağartılmış, ardından sadece bir dendritin seçici olarak tekrarlayan foto ağartılması yapılmıştır. Bu nöronlar, protein sentezini bloke etmek için görüntülemeden önce iki saat boyunca siklo heide ile tedavi edildi. Bu nedenle, ilgili ölçülen ROI'lerdeki floresan geri kazanımı, frap flip protokolüne tabi tutulan dendritlerde tek başına geri dönüşüme karşı standart frap dendritte yanal difüzyon ve geri dönüşümden kaynaklanan geri kazanım oranını ortaya koymaktadır.

Frap'a karşı frap flip geri kazanım eğrilerinden delta F değerleri karşılaştırıldığında, protein sentezinin inhibisyonu nedeniyle geri dönüşümün yanal difüzyona karşı nispi katkıları çıkarılabilir. Geri kazanım, mevcut alıcı havuzu tükendikçe sinyalde müteakip bir düşüş gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, nöronlarda başarılı görüntüleme deneylerinin nasıl kurulacağını, gerçekleştirileceğini ve analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Foto ağartma tekniklerinin bu kombinasyonunu kullanarak, ilgilendiğiniz protein için membran yerleştirme kanıtlarını inceleyebilirsiniz.