Sinir Yanıtları Kayıt ve Tarayıcıları enjekte için bir Awake Fare hazırlanması

Bu prosedürün genel amacı, uyanık bir farede tek nöronlardan gelen yanıtları kaydetmektir. Bu, önce farenin flor inhalasyonu ile uyuşturulması, farenin kemirgen stereotaksik bir çerçeveye yerleştirilmesi ve kafatasının açığa çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, stereotaksik koordinatları kullanarak ilgilenilen beyin bölgesini bulmak ve bu bölgeyi sonraki bir kraniyotomi için işaretlemektir.

Daha sonra, kafatasına özel yapım bir kafa direği monte edilir ve baş direği, stereotaksik aparat üzerindeki bir mikro manipülatöre bağlı bir montaj çubuğuna yerleştirilir. Son adım, beyne bir elektrot yerleştirilmesine izin vermek için bir kraniyotomi yapmaktır. Fare ameliyattan kurtulduktan sonra, fare bir köpük blok içinde tutulur.

Baş direği tekrar montaj çubuğuna yerleştirilir ve özel yapım bir stereotaksik cihaza bağlanır ve beyne bir mikro pipet elektrodu yerleştirilebilir. Bu prosedür, tek birimlerin izolasyonuna izin verir. Uyaranlara verilen güçlü tepkiler, aynı beyin yapısından birkaç gün boyunca kaydedilebilir ve izler, fizyolojik olarak tanımlanmış bölgelere artan veya azalan projeksiyonları incelemek için veya anesteziklerle yanıtları etkilemeden kullanılabilir.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, nöronların yanıt özelliklerinin anesteziklerden etkilenmemesidir. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Zachary Mako olacak Baş desteğini hazırlamak için, önce 15 milimetrelik, 32 inç üzerinde üç paslanmaz çelik çubuğa bir delik açarak özel yapım bir kafa direği monte edin. Ardından 20 milimetrelik paslanmaz çelik bir rulo pimi deliğe dik olarak yerleştirin.

Bir çapraz vuruş oluşturmak için, burada gösterildiği gibi 1 72 numaralı vidayı kabul etmek için dikey çubuğun bir ucuna dokunun. Ardından, montaj çubuğunu hazırlayın. Bu aparat parçası, yaklaşık 90 milimetre uzunluğunda ve beş ila 10 milimetre genişliğinde daha uzun bir pirinç veya alüminyum çubuktan ve uzun çubuğun ucuna 45 derecede tutturulmuş 15 milimetre uzunluğunda daha kısa bir çubuktan oluşur.

Daha kısa çubuğun tabana oyulmuş bir oluğu vardır ve genişlik boyunca daha kısa bir oluk, çapraz parça daha kısa oluğa yuva yapacak şekilde baş direğini bu oluklara sığdırır. Montaj bloğu, montaj çubuğunu tutmak için bir kesik ile yaklaşık 30 milimetre x 30 milimetre x 25 milimetrelik bir blok oluşturmak için vidalarla birbirine takılan iki parça alüminyumdur, montaj çubuğunu masa yüzeyine paralel montaj bloğundaki oyuğa yerleştirin. Montaj bloğunu bir mikro manipülatöre takın, böylece kafa direğinin konumu orta hat ve bir brima boyunca doğru bir şekilde yerleştirilebilir.

Son olarak, 0.01 inç çapında bir tungsten çubuğu yaklaşık beş milimetre uzunluğunda kesin ve yaklaşık bir milimetre 45 derece bükülmüş olarak kesin. Bu çubuk, topraklama pimi görevi görür. Hayvanı %5 buzlu flor içeren bir indüksiyon odasına yerleştirdikten sonra, ayak parmağını çimdikleyerek ve reaksiyon olup olmadığını kontrol ederek hayvanın tamamen uyuşturulduğundan emin olun.

Tamamen uyuşturulduktan sonra, önce dişleri ısırma çubuğunun deliğine yerleştirerek ve burun kelepçesini tam oturana kadar hafifçe sıkarak fareyi bir fare adaptörü ile donatılmış kemirgen stereotaktik çerçevesine yerleştirin. Hayvanın anestezi altında kalmasını sağlamak için. Farenin burnunun üzerine bir parça lateks eldivenden yapılmış bir yüz maskesi yerleştirin ve solunum hızı saniyede yaklaşık bir nefes olana kadar %5 flor miktarını koruyun.

Bu süreden sonra, flor izini %1,5 ila %2'ye düşürünŞimdi kulak çubuklarını her bir kulak kanalına nazikçe yerleştirerek başınızı sabitleyin. Kulak zarını delmemeye dikkat ederken, kulak bantlarını tam oturacak şekilde sabitleyin, ancak kulak kanallarına çok derine girmeyin. Farenin altına bir jel ısıtma yastığı yerleştirin.

Ardından gözlerin kurumasını önlemek için nazikçe oftalmik merhem sürün. Küçük bir tıraş makinesi veya ince uçlu makas kullanarak kullanın. Kulakların arasından gözlere kadar olan tüyleri alın.

Şimdi kafa derisini klorheksidin veya Betadine ovma ile temizleyin ve sterilize edin, ardından üç kez tekrarlanan alkollü durulama yapın. Başın arkasından gözlere kadar orta hat boyunca bir kesi yapın. Gerekirse periosteuumu bir neşter ile insizyonun kenarlarına kazıyın.

Kanamayı en aza indirmek için kasın kızaklar boyunca yırtılmasına izin verirken, boynun arkasındaki kas sistemini forseps ile dikkatlice geri çekin. Nemi en aza indirmek ve cildin kafatası üzerinde hareket etmesini önlemek için kafa derisi dokusunun altına jel köpük uygulayın. Daha sonra pamuk uçlu bir aplikatörü isop profil alkolle nemlendirin ve kafatası yer işaretlerinin görselleştirilmesini geliştirmek için kafatası yüzeyini kurulayın.

Hayvan hazırlandıktan sonra ince bir nokta yerleştirin. Elektrot tutucusuna keskinleştirilmiş bir metal çubuk gibi bir prob yerleştirin ve stereotaksik mikro manipülatöre takın. Probu bgma ve Lambda arasında ileri geri hareket ettirin ve her konum için yanal medial koordinatın 50 mikrondan fazla farklılık göstermediğinden emin olun.

Gerektiği gibi kulak çubuklarını kullanarak kafayı nazikçe yeniden konumlandırın. Bgma ve Lambda'daki dorsal ventral yüksekliğin 50 mikrondan fazla olmadığını doğrulayın. Gerekirse kafatasının eğimini düzleştirmek için burun kelepçesinin yüksekliğini ayarlayın, kulak çubuğunun yüksekliğinin de ayarlanması gerekebilir.

BGMA'ya göre ilgilenilen hedefin koordinatlarını belirlemek için fare beyninin bir atlasını kullanın. Kraniotominin yapılacağı hedefin üzerindeki kafatasını işaretlemek için Hindistan mürekkebi kullanın. İlk olarak, yüzeye diş aşındırma jeli yayarak ve yaklaşık 10 saniye ovalayarak kafatasını temizleyin.

Sonra suyla yıkayın ve tamamen kurulayın. Ardından, diş çimentosu için yapışkan astarı kafatası yüzeyine uygulayın. Aplikatörü kullanarak, yapıştırıcıyı yaymak için yeni bir aplikatör kullanın, yapıştırıcıyı bir UV ışık tabancası döngüsü ile sertleştirin.

Hedef bölgeye uzak bir konum belirleyin. Topraklama piminin montajı için, kafatasında küçük bir delik açmak için 65 numaralı mini bıçak neşterinin ucunu kullanın. Bu noktada delik, topraklama piminin kısa ucu için yeterince geniş olmalıdır.

Topraklama pimini, meninkslerin üzerine oturacak şekilde yerleştirin. Pimin, bgma'dan ve baş direği bağlantı yerinden uzağa bakacak şekilde yönlendirildiğinden emin olun. Şimdi, mikro manipülatörü, baş direği sadece kafatasına değecek şekilde bgma üzerine gelecek şekilde hareket ettirin.

Baş direğinin tabanı kafatasının üzerinde düz durmalıdır. Ardından, baş direği ve topraklama pimi etrafına az miktarda diş çimentosu uygulamak için diseksiyon probları kullanın. Kafatası ile iyi bir temas sağlamak için çimentoyu aşağı doğru bastırın.

Daha sonra bir UV ışık tabancasından üç ila dört döngü ile sertleştirin. Son olarak, baş direğinin etrafındaki tabanı oluşturmak için ikinci bir tur çimento uygulayın ve baş direğinin oluklarını kapatın ve bizi iyileştirin. İlk önce, astar tarafından kısmen gizlenecek olan kraniyotomi referans işaretini bulun.

Ardından, bu sitenin etrafında üç milimetreye üç milimetre karelik bir işareti işaretlemek için 65 numaralı bir mini bıçak neşteri kullanın. Hassasiyeti azaltmak için bir damla lidokain çözeltisi uygulayın. Şimdi karenin her iki tarafında birden fazla skor yapın, kemiği kesip beyne girmemeye dikkat edin.

Kemik flebi gevşediğinde, neşterin ucunu kaldırmak için kullanın ve dura materini sağlam bırakın. Ardından bölgeyi kemik mumu ile örtün. Ameliyat tamamlandıktan sonra, izo florini kapatın ve fareyi stereotaksik çerçeveden serbest bırakın.

Maruz kalan cilde lidokain uygulayın, ardından neo spor merhem uygulayın, veteriner hekim tarafından belirtildiği gibi cerrahi sonrası analjezi uygulayın ve fareyi ev kafesine geri koyun. 24 saat sonra, fare elektrofizyolojik kayıtlar için kullanılabilir. Bu şekil, kafa direğinin başarılı bir şekilde kurulmasının, deneycinin uyanık bir fareden birkaç gün boyunca tek ve çok birimli yanıtları kaydetmesine izin verdiğini göstermektedir.

Kısıtlama sistemi, beyindeki tek nöronların kararlı elektrofizyolojik kayıtlarına izin verir. Tek birimlerin mükemmel izolasyonu ve uyaranlara güçlü tepkiler, aynı beyin yapısından birkaç gün boyunca kaydedilebilir. Örneğin, iki günlük bir süre boyunca fare inferior colliculus'unda, sol panel, işitsel orta beyinden işitsel beyin sapına inen projeksiyonları değerlendirmek için birinci günden ve sağ panelden ikinci günden elde edilen kayıtları gösterir, biyotinillenmiş, dextra ve amin, kromojen olarak Dino Benadine kullanılarak görselleştirilir, enjeksiyon bölgesinde elektrofizyolojik tanımlayıcı nöronal yanıt özelliklerinden sonra burada görüldüğü gibi fare inferior colliculus'a enjekte edilebilir ve doku işlemeden sonra.

Kontralateral dorsal koklear çekirdekteki anterograd etiketleme, burada gösterildiği gibi burada görüldüğü gibi görselleştirilebilir ve çizilebilir. Büyük ölçüde işaretlenmiş aksonları ve terminalleri görüntülemek için daha yüksek çözünürlükte fotoğraf mikrografları da elde edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, uyanık bir farede nöro anatomik çalışmalar için tek tek nöronlardan yanıt özelliklerinin nasıl kaydedileceğini ve boyaların veya izleyicilerin nasıl enjekte edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Bu preparat, anesteziklerin nöral tepki özellikleri üzerindeki etkisini ortadan kaldırır ve aynı hayvanla birkaç gün boyunca deneylerin yapılmasına izin verir. Prosedürün anahtarı, baş direğinin kafatasına güvenli bir şekilde monte edilmesini ve farenin iyi bir şekilde sabitlenmesini sağlamaktır. Bu video, işitsel sistemdeki bireysel nöronlardan kayıt yapmak için bu prosedürün nasıl kullanılacağını göstermiş olsa da, beynin diğer alanları bu teknik kullanılarak incelenebilir.