Name: Görüntülemede HIV-1 Zarf bağlı Virolojik Synapse ve Sentetik Lipid Bilayers üzerine Sinyal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Öğrenin, TIRF mikroskobu kullanarak HIV-1 zarf proteininin oluşturduğu virolojik sinaps oluşumunu görselleştirme yöntemini. Bu teknik, sinaps içindeki sinyal moleküllerinin lokalizasyonunu analiz eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH hibe AI071815 (CEH) ve Yol Haritası Nanotıp Geliştirme Merkezi ödülünü PN2EY016586 (MLD) tarafından desteklenmiştir.

1. GP 120, Etiketleme Bu protokolde kullanılan floresan boyalar, proteinlere bağlanarak etkili olan mikroskobik görüntüleme için yeterince fotoğraf stabil durumda ve bizim mikroskop ile kullanılabilir lazerlerin dalga boyları uyarma maç. Etiketleme proteinler için floresan moleküller seçerken Bu üç kriter yerine getirilmesi gerekir. <ol><li> Döviz Onun gp120 DH12 (Dr. Michael Cho, Iowa State Üniversitesi tarafından hediye) santrifüj filtre ünitesi (30 kDa MWCO) ile steril PBS protein tampon 6-etiketli. Gp120 konsantrasyonu fazla 1 mg / ml olmadığından emin olun. Not: Onun 6-etiketli diğer X4 veya R5 tropik suşları gp120 proteinler de test edilmiş ve ticari İmmün Technologies şimdi mevcuttur var. </li><li> ~ PH 8.5 olan sodyum bikarbonat 50mM son konsantrasyon elde etmek için protein çözeltisine sodyum bikarbonat pH 9.0 ekleyin. </li><li> Di amin reaktif Alexa Fluor 488 (AF488) floresan boya, ekleBir 10-kat molar fazlalıktan az su içinde ssolved. Karanlık oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca bu karışım inkübe. </li><li> Fazla boya kaldırmak için, daha önce olduğu gibi santrifüj filtre ünitesi kullanın ve sütun taze steril PBS ekleyin. Tüm ücretsiz boya (4 ml PBS ile 3-4 yıkar) kaldırılıncaya kadar bu adımı yineleyin. Gp120 yaklaşık 1 mg / ml 'ye kadar konsantre edilir aşağı doğru dönmeye başlayacaktır. Not: boya suda çözünür ya da başka bir jel filtrasyonu kullanılabilir ise diyaliz veya santrifüj filtre ünitesi tarafından serbest boya çıkarma çalışır. </li><li> Etiketli protein proteini (F / P) bir molekül başına floresans yoğunluğunu ölçmek için, uygun dalga boyunu (örneğin, AlexaFluor 488 için 488 nm'de) ve protein olarak floresan boya konsantrasyonları (uM cinsinden) (kullandığımız belirlenmesi ardından 'protein ve etiketleri' ayarı) kullanarak ve bir NanoDrop spektrofotometre Eğer F / P oranı veren bu iki sayının bölün. Aynı prosedür gibi ICAM-1 ve Cy5 gibi diğer proteinler ve boyalar için kullanılır. Not: spectroph diğer tipleriotometers bir NanoDrop mevcut değilse, F / P oranı elde etmek için protein konsantrasyonunu ve floresanslı boya konsantrasyonu elde etmek için kullanılabilir. </li></ol> 2. Akış Hücre Montaj ve çift-katlı Hazırlık Akış hücresi ve çift-katlı hazırlanması için genel prosedür, daha önce 14 ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Burada bir Bioptech akış hücresi üzerine yaptığı 6-etiketli gp120 DH12 içeren bilayers hazırlamak için özel protokol özetlemektedir. Bulaşıcı virüsler veya enfekte olan hücreleri içeren çalışmalar için ve ne zaman küçük miktarlarda sınırlı reaktifler, bir tek Ibidi akışı odası (yapışkan Slayt I 0.2 Luer) nedeniyle gerekli adımlar 2,4-2,9 aynı çift katmanlı hazırlık prosedürü ile kullanılır ve takip edilebilir. Ibidi akışı odaları için bilgi şirketin web sitesi, elde edilebilir <a href="http://www.ibidi.com/service/display_material/CA_8p_EN_150dpi.pdf">http://www.ibidi.com/service/display_material/CA_8p_EN_150dpi.pdf</a> <ol><li> Pirhana çözeltisi (45 ml sülfirik asit (Trace Metal derecesi% 98) ve 15 ml% 30 hidrojen peroksit) 14 hazırlayın. Plastik kelepçeleri ile batırmayın kapağı 15 dakika Pirhana çözüm kayıyor. </li><li> Pika-saf su ile dolu bir behere kayar kapağı ve 2 dakika (her bir tarafta bir dakika) için akan suyun altında her biri yıkayın aktarın. Kuruması için raf üzerine yerleştirin. </li><li> Daha önce açıklandığı gibi 14 Bioptechs FCSII odaları birleştirin. </li><li> % 12.5 ihtiva eden bir lipozom karışımı Ni 2 + şelatlama lipidler 16 yakalama ve iki tabakalı bir yüzeye His 6-gp120 sunulması için kullanılır. Cama ucu dokunmadan microaqueduct slayda lipozom karışımından 1 ul damla ekleyin. Daha önce gösterildiği gibi, 14, beş nokta 1μl vardır, böylece akış hücre başına 5 bilayers maksimum hazırlamak için, 4 kez daha fazla tekrar edin. </li><li> Lipidler üstüne kapak kayma yerleştirin. Paslanmaz çelik bir cl ile beyaz tespit bileziği Kapakamp ana ünite üzerinden tüm aparatları çevirmek ve mühür. Bir işaretleyici ile bilayers yeri işaretleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe. </li><li> Video 'de gösterildiği gibi, sol perfüzyon tüp için iki-yollu ile tüp takın. 50 ml 10x HBS [10x: Üzerinde 3-yollu (tüp daha önce insan serum albumini (HSA) (HBS / HSA içeren Hepes tamponlu salin (HBS) dolmuştur ile tüp sonunda olumlu bir menisküs üret HEPES tamponlu tuzlu: 200 mM HEPES, pH 7.2, 1.37 M NaCl, 50 mM KCI, 2 HPO 4 Na 7 mM, 60 mM D-glukoz] 20 ml 25x HSA, 500 ul 1M CaCI2, 1 ml 1 M MgCl2 ve dH 500ml ve 0.22μm filtre ile filtre) bir toplam hacim getirmek için 2 0 ve kabarcıklar yoksundur. sağ perfüzyon tüpü hortumu bağlayın ve yavaşça akış hücresi ile tampon itin. </li><li> 1 ml şırınga doldurma ve 3-yollu bir açık kısmına takarak 100 uM NiCl 2 içeren kazein ~ 300 ul ile iki tabakalı engelleyin. Gently yoluyla tampon itin ve şırınga boşaltırken önce her iki stopcocks kapatın. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. </li><li> His 6-etiketli AF488-etiketli gp120 (konsantrasyon olarak 16 in daha önce tarif belirlenir) eklenir. Biz HIV-1 virionu yüzey 17'de bulunabilir env kümelerin yerel yoğunluk taklit etmek gp120/μm 2 ~ 250 moleküllerdir. Daha önce 14 olarak bildirilen Benzer şekilde, iki tabaka üzerine ~ 250 molekülleri / um ICAM-1 2 kullanın. Kazein ile yapılabilir gibi akış hücre içine yerleştirin. Oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika (folyo ile kaplayın) inkübe. Aynı prosedür gibi His-12 etiketli iki tabakalı üzerine ICAM-1 Cy5-etiketli gibi diğer proteinler ayırmak için kullanılır. </li><li> Tampon 5 ml bilayers yıkanır. </li></ol> 3. FRAP üzerinden Bilayers Kalite Kontrolü Bilayers Proteinler yanal yayılabilir olmalıdır. Bilayers üzerine hücreleri eklemeden önce, bu temin etmek önemlidirHazırlanan iki tabakalı proteinlerin hareketliliği. Burada konfokal mikroskoplar tarama TIRF, geniş alan Epifloresans veya lazer ışıklı en objektif üzerinde elle yapılabilir (FRAP) yöntemi 3 Photobleaching sonra Floresan Kurtarma açıklar. Amaç çift katlı lipid, ağartıcı bir nokta, ve ağartılmış alana unquenched moleküllerin dönüş izlemek için floresan görüntü tamamen homojen alanları etmektir. 2 dakika içinde% 50'lik bir geri kazanım kabul edilebilir. Bütün büyük mikroskop üreticileri (Leica, Nikon, Olympus, Zeiss) bu uygulama için iyi çalışır objektif ışıklı TIRF sistemleri satmak. Her bir şirketin TIRF aydınlatma ve diğer işlevsel özelliklerinden varyasyonları sağlarken, görüntü kalitesinde esasen aynıdır. <ol><li> Ağartma en aza indirmek için düşük uyarım yoğunluğu kullanın. Böyle bir NA 1,3-1,45 40x, 60x veya 100x gibi yüksek sayısal açıklık objektif kullanın. Işık intens azaltmak için, standart bir floresan veya TIRF mikroskobu kullanılarak zamanSığ, uyarma ışık yolu nötral yoğunluk filtreleri koydu. Çoğu lazer sistemleri düşük voltaj ile akusto optik ayarlanabilir filtre (AOTF) veya akusto optik ışın ayırıcı (Kelime Size Neyi Çağrıştırıyor) ayarlayarak düşük aydınlatma için ayarlanmış olabilir. </li><li> Bir "ön-bleach" görüntü kaydedin. Düşük ışık koşullarında binning telafi etmek için, soğutmalı bir CCD kamera ile 2x2 veya 4x4 olarak ayarlanmış olabilir Eğer kazanç kullanılabilir, yüksek ya da uzun pozlama (saniye sırasına örneğin) ayarlanmış olabilir. Bir konfokal kullanıyorsanız, iğne deliği diyafram açılabilir; kazanç yüksek ayarlayın ve yavaş tarama veya kullanılan ortalama. </li><li> Bleach bir nokta. Standart bir floresan veya TIRF mikroskop kullanıyorsanız, maksimum şiddeti aydınlatma sağlamak için tüm ND filtreleri kaldırırsanız, alan diyafram kapatın ve birkaç saniye için örnek maruz bırakmaktadır. Konfokal tarama bir lazer kullanarak, ağartıcı bir noktaya 8x yaklaşık 4x lazer güç ve maksimum zoom ayarı. Eğer Konfokal kullanımı için bir uyarı: çok yüksek yakınlaştırma değil iki tabakalı dizgin zarar görebilir çünkügeniş anlamda kullanılmaktadır fotonlar yoğunlaştı. </li><li> On on beş saniye aralıklarla, görüntü kaydetmek 3.1 ve 3.2 ile aynı aydınlatma ve kayıt ayarlarını kullanarak. Iki üç dakika içinde nokta "ön-bleach" görüntünün ancak yaklaşan yoğunluğu kurtarmak gerekir. Hızlı kurtarma başarılı bir mobil çift-katlı bir işaretidir. Spot karanlık kalırsa kenarı yüksek kontrast koruyorsa, ve özellikle, floresan proteinleri iki tabakalı hareketsizse ve deney için kullanılmamalıdır. </li></ol> Not: Mevcut mikroskop, biz 4 saniyeden daha kısa sürede tipik konsantrasyonlarda floresan ICAM açıcılar 240 mikron 2 lik bir alana sahip dairesel bir noktaya 641 nm ışık 0.9 mW sunabilirsiniz. Okuyucular 30 saniyeden az bir kez tekrarlanabilir bir şekilde bu testte gerçekleştirmek için fazlasıyla yeterlidir beyazlatma ile bir Hg veya Xe lamba kritik uyum bulmalısınız. Ayrıca ek det için 3 başvuru için sevk edecekleriniyerli diziler. 4. Hücreler ve İmmünofloresan Boyama Enjeksiyon <ol><li> 37 ° C (bu, yaklaşık 30 dk için bir CO 2 ile 37 ° C inkübatörde yapılabilir) ile akış hücresi ısınmaya. </li><li> 1 ml şırınga ile aktive insan CD4 + HBS / HSA ~ 400 ul T hücrelerinin (2-5x10 6 / akış hücresi) ekleyin. Hücreler 37 ° C inkübatörde ~ 45 dk için çift-katlı eklemek edelim. Ibidi odaları kullanılması durumunda, ek tampon her 15-20 dk kaynağı. </li><li> % 2 paraformaldehit enjekte edilerek hücreleri düzeltmek ve 37 de 10 dakika inkübe ° C. </li><li> 1 ml oda sıcaklığında PBS tamponu ile 3x yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100 hücreleri enjekte edilerek geçirgenliği. </li><li> Oda sıcaklığında PBS tamponu 1 ml (fosforile proteinlerin sondalama zaman, işleme sırasında fosfat kaldırılmasını önlemek için PBS 1mM son konsantrasyon veya başka bir fosfataz inhibitörü sodyum vanadat ekleyebilirsiniz) 3x yıkayın. Için% 5 keçi serumu ile kazein kullanarak engellemeOda sıcaklığında 25 dak. Hayvan serumu tipi sekonder antikor bağlıdır. </li><li> Oda sıcaklığında PBS tamponu 1 ml 3x yıkayın. Oda sıcaklığında 1 saat - 30 dk için ~ 300 ul tamponu / akış hücresi olarak primer antikorun ekleyin. İlk zar-proksimal aktivasyon sinyali algılamak için, LCK total veya Fyn, (pLck) lck fosforile için özel antikorlar kullanır. </li><li> Oda sıcaklığında PBS tamponu 1 ml 3x yıkayın. Primer antikor ile yapılan tampon olarak uygun floresan ile işaretlenmiş sekonder antikor ekleyin. Bizim deneyler için, keçi anti-tavşan sekonder 568-etiketli Alexa Fluor kullanın. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. PBS tamponu 1 ml 3x yıkayın. </li><li> Not: Sadece sekonder antikor (hiçbir birincil antikor) ile tedavi edilmiş bir kontrol çift katlı olması şarttır. Adımları 4.1-4.5 ve 4.6 atlama izleyin, sonra adım 4.7 ile devam edin. Bu ikincil antikorun spesifik olmayan bağlanma seviyesinin belirleyecektir. Alternatif olarak, bir etiket, doğrudan kullanabilired primer antikorlar. </li></ol> 5.. TIRF mikroskopi ile görüntü alma TIRF mikroskopisi, bir 250 nm ya da cam substrat ve hücre ara yüzeyde ince düzlemi ile sınırlı flüoresan sinyallerin eksitasyon sağlar. Bu çift katlı lipid gelen ve hemen apposed hücre zarları sadece sinyallerin görüntü alımı garanti eder. Bu nedenle, sinaps sadece moleküller görüntülenmiştir edilir. Hücre altındaki TIRF görseller membran-proksimal alanı için, dorsal membran içine içselleştirmiş veya yeniden dağıtılır proteinleri tespit edilmez. Daha sonra ek olarak, standart Geniş açılı, ya da diğer hücre birimleri ile karşılaştırıldığında birikimi ya sinaptik alanda proteinlerin dağılımını saptamak için konfokal mikroskopi ile görüntü elde etmek için önemli olabilir. Bütün büyük mikroskop üreticileri (Leica, Nikon, Olympus, Zeiss) bu ap için işe objektif ışıklı TIRF sistemleri satmakplikasyon. Her bir şirketin TIRF aydınlatma ve diğer işlevsel özelliklerinden varyasyonları sağlarken, görüntü kalitesinde esasen aynıdır. Her TIRF mikroskop çalışması için kendi ayrıntıları vardır, ama aşağıdaki genel kurallar yüksek çözünürlüklü görüntü elde etmek için geçerlidir. <ul><li> Aydınlatma ağartma önlemek için düşük olmalıdır. </li><li> Kamera lineer bir cevap olmalıdır. </li><li> Kamera hiçbir doygunluğu ile görüntüleme geniş dinamik aralık yeteneğine sahip olmalıdır. </li><li> Tüm ayarlar kantitatif analizleri için sürekli ayarlanması gerekir. </li></ul> 6. Veri Analizi CD4 + VS de gp120 ile T hücre etkileşimi sonucunda aktif hücre içi sinyalleri incelemek için, TIRF görüntüleri kantitatif analizleri gibi aktif ve sinaps 15 alınırlar lck ve Fyn gibi olsun ya da hücre içi sinyal molekülleri belirlemek için yapılır. Burada çoğu görüntü analizi için uygulanan basit bir yöntem tarifBöyle ImageJ ve Metamorph gibi uygulama paketleri. Biz burada yöntem 12 için Windows, Macintosh ve Linux üzerinde çalışan ImageJ, kullanmışlardır. Analyze&gt; Set Ölçümleri sekmesinde, Alan için onay kutularını ve gri Ortalama değer. Bir çokgen veya bir serbest izlenen kapalı şekli resmin üzerine ilgi bir bölge yapmak ve&gt; Ölçü analiz ne zaman, yazılım bir sonuç tabloda bu ölçüm verileri koyacağız. Alan piksel sayısında ya da 2 um olacaktır. Ortalama keyfi birimler ortalama yoğunluğudur. Bunun çıkarılır arka yoğunluğu sahip olması gerekir. Alanı tarafından ortalama çarparak eksi arka keyfi bir birim içinde proteinin entegre yoğunluğu döner. <ol><li> Ortalama ve Alan için ölçümleri ayarlayın. </li><li> Bir deney durumu için görüntüleri açın. </li><li> Her hücre için, takip ve ilgi (ortalama) bölgesi ölçmek ve izlemek ve faiz (arka plan) bölge dışında bir bölgeye ölçmek. </li><li> Zaman, bir deney koşulu ile kopya ölçümleri da yapılıyor ve Excel ya da diğer elektronik tablo programı içine yapıştırın veya ölçümleri kaydedin. </li><li> Her deneysel koşul için 6.2 adıma geri dönün. </li><li> Ölçümler tamamlandığında, sonuçları hesaplamak. Formül şunlardır: Ortalama yoğunluğu = ortalama - arkaplan Entegre yoğunluğu = Ortalama yoğunluğu * alan </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar VS azından gp120 ile etkileşimi sonucu olarak, başlangıç ​​membran-proksimal sinyalleşme LCK molekülleri ve Fyn aktivasyonu ve alım ölçmek için, birincil insan CD4 + T hücreleri gp120 ve ICAM-1 15 taşıyan bilayers üzerine getirilmiştir. Sadece ICAM-1 ile bilayers tanıtıldı Hücreler sinyal bazal düzeylere tanımlamak için bir kontrol olarak görev yaptı. Specific floresans yoğunluğunu ICAM-1 çift-katlı ile etkileşen hücreleri için gp120 ve ICAM-1 içeren bilayers ve bütün temas alanı içinde hücreleri için gp120 temas alanı içinde ölçülmüştür. Ortalama floresan yoğunluğunda bir artış, bir genişletilmiş işareti işe alım ve VS sinyal molekülünün aktivasyonu. Bu, daha da entegre floresans yoğunluğunu benzer bir artış ile gösterilecektir. Bununla birlikte, entegre floresans yoğunluğunu herhangi bir değişiklik olduğunda ise, bu sinyal molekülünün bir dağıtılması gösterir. Hücreleri gp120 ve ICAM-1, lck toplam ve pLck (Y394) içeren bilayers etkileşim sonra VS arayüzü alınan ve gp120 (Şekil 1 ve 2) ile kolokalize edildi. LCK toplam ortalama yoğunluğu (Şekil 1) tek başına ICAM-1 ile daha gp120 ve ICAM-1 hem de içeren iki tabaka daha yüksek, ama entegre yoğunluk seviyeleri (Şekil 1) benzerdi, lck içine yeniden dağıtılır düşündürmektedirCD4 + T hücre gp120 bağlama üzerine merkezi bir küme. Ancak, pLck (Y394) (Şekil 2) miktarının gp120 ve ICAM-1 içeren bilayers üzerinde ortalama yoğunluğu ICAM-1 tek başına bilayers üzerinde daha yüksek olduğunu gösterdi ve entegre yoğunluğu gp120 ve ICAM her ikisi ile bilayers daha yüksek oldu -1 ICAM-1 tek başına bilayers ziyade. Arayüzünde lck toplam seviyeleri gp120 ve ICAM-1 ve ICAM-1 tek başına bilayers, aktivasyon döngü lck az kalıntı Y394 ve gp120 bağlayıcı artış fosforilasyon üzerine yapışan hücreler benzer iken bu olduğunu gösterir. Bunun aksine, Fyn fazla gp120 Fyn ve ICAM-1 hem de ihtiva bilayers üzerinde daha ICAM-1 tek başına bilayers üzerine hücrelerinin temas alanında mevcut olduğu gibi, (Şekil 3) VS için işe değildi. Sonuç olarak, Fyn değil, lck, HIV-1 gp120 kaynaklı VS aktif kinaz olduğu sonucuna varıldı. Şekiller: at Membran-proksimal sinyal HIV-1 gp120 kaynaklı VS. Üzerindeki temsilcisi hücrelerin Görüntülerigp120 + ICAM-1 çift-katlı (üst panel) ve ICAM-1 çift-katlı (alt paneller) gösterilmektedir. Şekil 1 'de sarı bir çizgi ile işaretlenmiş bölge tarafından gösterildiği gibi, tek tek hücrelerin floresans yoğunlukları hücre izlerin bir elle takip alanları içinde ölçüldü. TIRF mikroskopi ile saptanan ortalama yoğunluğu ve entegre Kantitasyonu, sırasıyla, sol ve sağ grafik olarak gösterilmiştir. 30-350 hücreleri toplam, her durum için ölçüldü. Barlar = 5 mm. Üç tekrarlama deneyler birindeki verileri gösterilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3757/3757fig1.jpg"> Şekil 1. CD4 + T hücreleri 45 dk için tek başına gp120 ve ICAM-1 ya da ICAM-1 içeren bilayers üzerine sunulan ve daha sonra sabit ve LCK toplam boyanmıştır. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3757/3757fig2.jpg"> Şekil 2. CD4 + T hücreleri iki tabakalı üzerine tanıtıldıs 45 dk için tek başına gp120 ve ICAM-1 ya da ICAM-1 içeren ve daha sonra pLck (Y394) için ve lekeli sabitlenir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3757/3757fig3.jpg"> Şekil 3. CD4 + T hücreleri 45 dk için tek başına gp120 ve ICAM-1 ya da ICAM-1 içeren bilayers üzerine sunulan ve daha sonra sabit ve toplam Fyn için boyanmıştır.

<ol><li>Bastiani, L., Laal, S., Kim, M., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell-dependent+alterations+in+envelope+components+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+virions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Host cell-dependent alterations in envelope components of human immunodeficiency virus type 1 virions.</a> J. Virol. 71, 3444-3450 (1997).</li>
<li>Dimitrov, D. S., Willey, R. L., Sato, H., Chang, L. J., Blumenthal, R., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 infection kinetics.</a> J. Virol. 67, 2182-2190 (1993).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+Bond+Dynamics+in+Contacts+between+T+Lymphocytes+and+Glass-supported+Planar+Bilayers+Reconstituted+with+the+Immunoglobulin-related+Adhesion+Molecule+CD58%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Adhesive Bond Dynamics in Contacts between T Lymphocytes and Glass-supported Planar Bilayers Reconstituted with the Immunoglobulin-related Adhesion Molecule CD58.</a> J. Biol. Chem. 272, 15782-15788 (1997).</li>
<li>Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-derived+ICAM-1+glycoproteins+incorporated+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+are+biologically+active+and+enhance+viral+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity.</a> J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).</li>
<li>Frank, I., Stoiber, H., Godar, S., Stockinger, H., Steindl, F., Katinger, H. W., Dierich, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+host+cell-surface-derived+molecules+by+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Acquisition of host cell-surface-derived molecules by HIV-1.</a> Aids. 10, 1611-1620 (1996).</li>
<li>Hioe, C. E., Bastiani, L., Hildreth, J. E., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cellular+adhesion+molecules+in+HIV+type+1+infection+and+their+impact+on+virus+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Hum.+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Role of cellular adhesion molecules in HIV type 1 infection and their impact on virus neutralization.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 14, Suppl 3. S247-S254 (1998).</li>
<li>Hioe, C. E., Chien, P. C., Lu, C., Springer, T. A., Wang, X. H., Bandres, J., Tuen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LFA-1+expression+on+target+cells+promotes+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">LFA-1 expression on target cells promotes human immunodeficiency virus type 1 infection and transmission.</a> J. Virol. 75, 1077-1082 (2001).</li>
<li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced%2C+actin-dependent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J. Exp. Med. 199, 283-293 (2004).</li>
<li>Jolly, C., Mitar, I., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+an+intact+T-cell+actin+and+tubulin+cytoskeleton+for+efficient+assembly+and+spread+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Requirement for an intact T-cell actin and tubulin cytoskeleton for efficient assembly and spread of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 81, 5547-5560 (2007).</li>
<li>McDonald, D., Wu, L., Bohks, S. M., KewalRamani, V. N., Unutmaz, D., Hope, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+HIV+and+its+receptors+to+dendritic+cell-T+cell+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions.</a> Science. 300, 1295-1297 (2003).</li>
<li>Pearce-Pratt, R., Malamud, D., Phillips, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cytoskeleton+in+cell-to-cell+transmission+of+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Role of the cytoskeleton in cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus.</a> J. Virol. , 682898-682905 (1994).</li>
<li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRasband%2C+WS+%22ImageJ%22">ImageJ</a>. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. (1997).</li>
<li>Rizzuto, C. D., Sodroski, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+virion+ICAM-1+to+human+immunodeficiency+virus+infectivity+and+sensitivity+to+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Contribution of virion ICAM-1 to human immunodeficiency virus infectivity and sensitivity to neutralization.</a> J. Virol. 71, 4847-4851 (1997).</li>
<li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).</li>
<li>Vasiliver-Shamis, G., Cho, M. W., Hioe, C. E., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120-induced+partial+T-cell+receptor+signaling+creates+an+F-actin-depleted+zone+in+the+virological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120-induced partial T-cell receptor signaling creates an F-actin-depleted zone in the virological synapse.</a> J. Virol. 83, 11341-11355 (2009).</li>
<li>Vasiliver-Shamis, G., Tuen, M., Wu, T., Starr, T., Cameron, T., Thomson, R., Kaur, G., Liu, J., Visciano, M., Li, H., Kumar, R., Ansari, R., Han, D., Cho, M., Dustin, M. L., Hioe, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120+induces+a+stop+signal+and+virological+synapse+formation+in+noninfected+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120 induces a stop signal and virological synapse formation in noninfected CD4+ T cells.</a> J. Virol. 82, 9445-9457 (2008).</li>
<li>Zhu, P., Liu, J., Bess, J., Chertova, E., Lifson, J., Grise, H., Ofek, G., Taylor, K., Roux, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+three-dimensional+structure+of+AIDS+virus+envelope+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes.</a> Nature. 441, 847-852 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar çıkarları hiçbir çatışma beyan ederim.

Önceki çalışmalar, hücre-hücre konjuge sisteminde görüntülenmiştir VS var, ancak bu çalışmalar sinaps de supramoleküler yapıları görselleştirmek için yeterince yüksek çözünürlüklü görüntüleri vermedi. Laboratuar olarak, virüs zarf gp120 ve hücresel adezyon molekülü ICAM-1 eksprese enfekte hücrelerin yüzeyine temsil cam desteklenen düzlemsel iki tabakalı sistemi kullanılmaktadır. Yüksek bir sinyal-gürültü oranına sahip iki tabakalı yüzeye 100-200 nm içinde floresan sinyalleri algılar TIRF mikroskobu ile birlikte, biz VS az ICAM-1 gp120 ve supramoleküler ayrılığı tespit edebildi. VS 15 azından gp120-temas alanı için, Fyn Dahası, standart bir yöntem immun iki tabakalı sistemine uygulanabilir ve LCK aktif spesifik alım algılamak ve ölçmek için kullanılmıştır, ancak. Bu nedenle, düzlemsel iki tabakalı TIRF mikro bir 2D düzlemde sinaps arayüzü yüksek çözünürlüklü görüntüleme için bir deney sistemi sunuyorSkopi, hem geniş alan veya konfokal aydınlatma yöntemleri gibi. Ancak, sistemi de out-of-düzlem, ligand hareketlilik ayarlanması gibi sınırları vardır ve biyolojik membranların dalgalanmalar düzlemsel bilayers tarafından yeniden değildir. Dahası, bu bir in-vitro sistemde ve bu nedenle bu tür moleküler hareketlilik ve hücresel motilite düzenleyen enfekte hücre ve hücre iskeleti makine üzerinde mevcut olacağını, diğer membran moleküllerini eksikliği gibi diğer sınırlamalara sahiptir. Ayrıca, bu tür trimerler karşı gp120 monomerleri gibi moleküller, dinamikleri ve dağıtım iki tabaka üzerinde fizyolojik temsil edilemez. Bununla birlikte, belirgin olmadığını hatta bu sınırlamalar, bu sistem virüs-hücre ya da hücre-hücre etkileşimleri çalışmak için hala çok değerli olduğunu ve bu yöntemleri supramoleküler örgütü tespit etmek ve yüksek çözünürlüklü resimler arayan araştırmacılar için yararlı bir rehber olarak hizmet edebilir Konvansiyonel hücre-hücre konjugatı sisteminde.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Onun tagged HIV gp120 </td><td> Dr Cho gelen Hediye </td><td></td><td> DH12 </td></tr><tr><td> Onun tagged HIV gp120 </td><td> Bağışıklık Teknoloji </td><td></td><td> Çeşitli X4 veya R5 tropik </td></tr><tr><td> HSA </td><td> Williams Medikal Firma </td><td> 521302 </td><td> İnsan Serum Albumin% 25 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra Santrifüj Filtreler </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30K </td></tr><tr><td> Tavşan mAb lck </td><td> Hücre Sinyali </td><td> 2787 </td><td></td></tr><tr><td> Tavşan pAb p-LCK </td><td> Santa Cruz Biyoteknoloji A.Ş. </td><td> Sc-101.728 </td><td> Tyr 394 </td></tr><tr><td> Fyn Tavşan mAb </td><td> Millipore </td><td> 04-353 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 2 °; Ab </td><td> Molecular Probes </td><td> A11034 </td><td> Keçi anti-tavşan IgG (H + L) </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-20000 </td><td> karboksilik asit süksinimidil ester </td></tr><tr><td> FCS2 Odası </td><td> Bioptechs </td><td> 060319-2-03 </td><td></td></tr><tr><td> Slayt Microaqueduct </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> 30mm Yuvarlak w / delik </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-08-750 </td><td> 0.75mm kalınlığında </td></tr><tr><td> Dikdörtgen Conta </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-1422-250 </td><td> 14x24 0.25mm kalınlığında </td></tr><tr><td> Tygon Boru </td><td> Bioptechs </td><td> 20202275 </td><td> 1/16 &quot;(25ft) </td></tr><tr><td> Üç yollu Musluk </td><td> BioRad </td><td> 7328103 </td><td></td></tr><tr><td> İki yönlü Musluk </td><td> BioRad </td><td> 7328102 </td><td></td></tr><tr><td> Sabit Slayt Ben 0.2 Luer </td><td> Ibidi </td><td> 80168 </td><td></td></tr><tr><td> Gözlük Kapak </td><td> Ibidi </td><td> 10812 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml şırınga </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> KÖPEK-NTA </td><td> Avanti Polar Lipidler </td><td> 790404C </td><td></td></tr><tr><td> DOPC </td><td> Avanti Polar Lipidler </td><td> 850375C </td><td></td></tr><tr><td> Cam coverslip </td><td> Bioptechs </td><td> 40-1313-0319 </td><td> 40mm </td></tr><tr><td> TIRF mikroskop </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> Ulusal Sağlık Enstitüleri </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/~~V</a> </td></tr></tbody></table>

görüntülemede hiv-1 zarf bağlı virolojik synapse ve sentetik lipid bilayers üzerine sinyal

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

İnsan immün yetmezlik virüsü tip 1 (HIV-1) enfeksiyonu hücre iletim 2,10,11 hücre ile en verimli şekilde oluşur. CD4 arasındaki hücre devir + T hücreleri bu hücrenin CD4 ile enfekte hücre HIV-1 zarfı gp120 ile angajman üzerinde oluşmuş bir F-aktin-bağımlı hücre-hücre bileşke bir viral sinaps (VS), oluşumunu içeren hedef hücre 8 kemokin reseptör (CKR) CCR5 veya CXCR4. Bu virüsle enfekte donör hücre yüzeyi üzerinde mevcut olan gibi gp120 ilaveten ve reseptörleri ile, özellikle diğer zar proteinleri, adezyon molekülü LFA-1 ve ligantlar olarak, ICAM ailesi, VS oluşumu ve virüs iletiminde önemli bir rol oynar ve hedef hücrelerin yanı sıra, HIV-1 virionlar 1,4,5,6,7,13 bir zarf. VS oluşumu ayrıca reseptörlerinin gp120-angajman bir sonucu olarak transdük edilir hücre içi sinyal olayları eşlik eder. Gerçekten de, son zamanlarda CD4 göstermiştir &lt;&gt; gp120 ile + T hücre etkileşimi TCR lck dahil signalosome, CD3ζ, ZAP70, LAT, SLP-76, ITK ve PLCγ 15 ile ilişkili sinyal molekülleri alımı ve fosforilasyon indükler sup. Bu yazıda, supramoleküler düzenleme ve VS oluşumu sırasında yer alan membran proksimal sinyalleşme olayları görselleştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Biz Viral zarfın gp120 ve hücre adezyon molekülü ICAM-1 taşıyan HIV bulaşmış hücre yüzeyi temsil eden bir model olarak indirgemeci cam desteklenen düzlemsel bir iki-katmanlı sistemi yararlanabilir. Protokolü etkileşim hücrelerinde hücre içi sinyal molekülleri tespit etmek için HIV-1 gp120 kaynaklı VS montaj ve bir akış hücresi i) çift katmanlı hazırlık ve montaj dahil sinyal aktivasyon olayları, ii) hücreler ve immünfloresan boyama enjeksiyon izlenmesi için genel yordamlar açıklanır TIRF mikroskopi ile HIV-1 çift katmanları gp120 ve ICAM-1, iii) görüntü elde etme, birnd iv) Veri analizi. Bu alt etki alanları için işe özgü sinyal molekülleri ile birlikte VS bireysel moleküler bileşenleri farklı salkım tespiti sağlayan bu sistem geleneksel hücre-hücre sistemi ile elde ötesinde VS arayüzünün yüksek çözünürlüklü görüntüler üretir.

Bu makale toplam iç yansıma floresans (TIRF) mikroskop camı desteklenen düzlemsel bilayers bir HIV-1 zarf kaynaklı virolojik sinaps oluşumu görselleştirmek için bir yöntem açıklanır. Yöntem ayrıca, HIV-1 zarfı ile endüklenen virolojik sinaps oluşumu sırasında meydana gelen sinyal molekülleri aktivasyonu ve dağıtılması algılamak için immünfloresans boyama yöntemi ile kombine edilebilir.

Görüntülemede HIV-1 Zarf bağlı Virolojik Synapse ve Sentetik Lipid Bilayers üzerine Sinyal

İnsan immün yetmezlik virüsü tip 1 (HIV-1) enfeksiyonu, en yüksek verimle hücreden hücreye iletim yoluyla gerçekleşir2,10,11. ... arasındaki bu hücreden hücreye transfer...

Bu yöntem, enfekte olmuş bir hücre yüzeyini taklit eden lipid çift tabakaları oluşturur. Primer insan CD4 T hücreleri ile oluşan HIV virolojik sinapsını incelemek için, öncelikle ilgilenilen proteinleri floresan boyalarla işaretleyin, ardından lipid çift tabakalarını oluşturun ve hücrelerin sinaps kurmasına izin verin; sinyal moleküllerinin görselleştirilmesi için hücreleri sabitleyin ve floresan antikorlarla boyayın. Daha sonra, total internal refleksiyon floresans veya TIRF mikroskobu kullanarak sinaps oluşturan hücrelerdeki sinyal moleküllerinin görüntülerini elde edin.Aktif sinyal moleküllerinin virolojik sinaps yapısına göre lokalizasyonunu belirlemek için turf görüntülerini analiz edin. Bu deneysel yaklaşım, lenfosit spesifik protein kinaz LCK gibi hücresel proteinlerin HIV virolojik sinapsına dahil edilip edilmediğini belirtebilir. Bu yöntem, virolojik sinapsa hangi hücre bileşenlerinin dahil olduğu gibi HIV virolojisi ve immünolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Sinaps oluşumundaki rolü nedir ve HIV'in hücreden hücreye aktarımını nasıl etkileyebileceği üzerine. Bu bier sistemi, sinapsı tek bir düzlemde yüksek mekansal çözünürlükte görselleştirme avantajı ile sinapsın uç faz görünümünü sağlar. Sonuçlar sinaptik yapıyı açıkça tasvir etmektedir; bierin oluşturulması ve akış hücresinin birleştirilmesi bir kinter, bir sanat formudur.Burada, bulaşıcı virüsler veya enfekte hücreler kullanılarak yapılan çalışmalar için veya sınırlı reaktifler nedeniyle küçük hacimlerin kullanılmasının gerekli olduğu durumlar için bio optik akış hücresinde bilar hazırlama işlemini gösteriyoruz. Aynı bilar hazırlama prosedürü ile tek kullanımlık OB akış hücreleri de kullanılabilir. Michael Kramer ve ben, proteinlerin etiketlenmesi için bir prosedür göstereceğiz.Proteinlere bağlanmada etkili, mikroskopi görüntüleme için yeterince fotostabil olan ve mikroskop cihazındaki lazerlerin eksitasyon dalga boylarıyla uyumlu olan LOR 4 88 gibi floresan boyalar seçin. Saflaştırılmış his etiketli GP one 20 DH 12 proteini ile başlayın. Protein tamponunu, 50 kilodalton moleküler ağırlık kesme sınırına sahip bir santrifüj filtre ünitesi kullanarak steril PBS ile değiştirin.Ardından, pH'ı kontrol edin ve yaklaşık 8,5 pH değerinde 50 milimolar nihai sodyum bikarbonat konsantrasyonu elde etmek için pH 9,0 sodyum bikarbonat ekleyin. Daha sonra, on kat molar fazlalıkta mean reactive LOR 4 88 floresan boyası ekleyin. Bu karışımı karanlıkta 45 dakika ile bir saat arasında inkübe edin.Fazla boyayı bir santrifüj filtre ünitesi ile uzaklaştırın. Kolona taze steril PBS ekleyin ve proteini serbest boyadan arındırmak için yıkama işlemine devam edin. Ardından, GP one 20 proteinini mililitre başına yaklaşık bir miligram olacak şekilde konsantre edin.Floresan boyanın konsantrasyonunu 488 nanometrede ölçün. Ayrıca, NanoDrop spektrofotometrede proteinler ve etiketler ayarını kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.Protein molekülü başına düşen floresan yoğunluğunu belirlemek için iki sayıyı birbirine bölün. Plastik kıskaçlar kullanarak 45 mililitre sülfürik asit ve 15 mililitre %30 hidrojen peroksitten oluşan piranha çözeltisi hazırlayın. Lamel camlarını 15 dakika boyunca daldırın.Kapak lamlarını PIKA saflaştırılmış su ile dolu bir behere aktarın. Her bir kapak lamını akan su altında, her iki yüzeyi birer dakika olmak üzere toplam iki dakika boyunca yıkayın ve kurumaları için bir rafa yerleştirin. Varona ve arkadaşları (2008) tarafından daha önce tanımlandığı üzere, optik F CS iki bölmeli düzeneğin montajına geçin. Ardından, ucu cama değdirmeden, bilayer yüzeyine hiss GP one 20 yakalayın ve sunun.Her bir akış hücresi için beş çift katman hazırlamak amacıyla, bir mikro akuedük lamı üzerine beş adet 1 µL lipozom karışımı damlatın. Ardından, lipidlerin üzerine bir kapatma lamı yerleştirin. Son olarak, beyaz tutucu halkayı paslanmaz çelikten bir klempe taban ünitesi ile kapatın.Tüm düzeneği ters çevirin ve sızdırmaz hale getirin. Ardından çift katmanların konumunu işaretleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Sonrasında, iki yollu bir musluk yardımıyla boruyu sol perfüzyon tüpüne bağlayın.Üç yollu musluğa bağlı tüpleri, HEPES tamponlu salin içerisinde %1 insan serum albümini ile doldurun ve düzeneğin hava kabarcığı içermediğini doğrulayın. Şimdi bu tüpleri sağ perfüzyon tüpüne bağlayın ve pozitif bir menisküs oluşturun. Çift katmanı bloke etmek için tampon çözeltiyi akış hücresinden nazikçe geçirin.300 µL 100 µM nikel klorür ENC kazein içeren bir mililitrelik bir şırıngayı üç yollu musluğa takın; ayırma işleminden önce her iki musluğu kapatarak tampon çözeltiyi nazikçe geçirin. Şırıngayı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.Şimdi, HIV V1 yüzeyinde bulunan uç kümelerinin lokal yoğunluğunu taklit etmek için mikron başına 20 adet olacak şekilde, 250 molekül his-etiketli LOR 4 88 işaretli GP1 yükleyin. Oda sıcaklığında, karanlıkta 30 dakika inkübe edin ve 5 mL H-B-S-H-S-A tamponu ile katmanlar halinde yıkayın. Akış hücresini 37 °C'ye dengeleyin.Bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, %1'lik insan serum albümin çözeltisi içindeki 400 mikrolitre aktive edilmiş insan CD4 pozitif T-hücrelerini ekleyin ve hücrelerin lipid tabakasına tutunmasını sağlamak için 37 °C'deki bir inkübatörde 45 dakika inkübe edin. Ardından, hücreleri sabitlemek için %2'lik paraldehit enjekte edin ve 37 °C'de 10 dakika inkübe edin. Bir mililitre ile üç kez yıkayın.Ardından, PBS ile üç kez 1 mL yıkama yaptıktan sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca %0,1 Triton X 100 enjekte ederek hücreleri permeabilize edin. %5 keçi serumu içeren kazein ile 25 dakika boyunca bloklama yapın. Oda sıcaklığında PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, her akış hücresi için primer antikor ve 300 µL tampon ekleyerek 20 dakika ile bir saat arasında bekletin.Üç kez PBS ile yıkama yaptıktan sonra, oda sıcaklığında tampon içerisindeki uygun floresan işaretli sekonder antikoru ekleyin. Deneyde, bu reajenden kaynaklanan spesifik olmayan sinyal düzeyini belirlemek için kontrol tabakası örneği yalnızca sekonder antikor ile işleme tabi tutulur. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin, ardından bir mililitre ile üç kez yıkayın.Toplam internal yansıma floresan mikroskopisi ile tüm örneklerin görüntülerini edinin. Görüntülerin kantitatif analizini, Image J gibi bir görüntü analiz uygulama paketindeki "analyze set measurements" sekmesini kullanarak gerçekleştirin.Alan ve ortalama gri değer kutucuklarını işaretleyin. Görüntü üzerinde poligon veya serbest elle çizilmiş kapalı bir şekil olan bir ilgi alanı seçin. Ardından, yazılımın bu ölçümden veri kaydetmesi için analiz ölçüm sekmesini seçin.Bir sonuçlar tablosunda, ölçümleri ortalama ve alan olarak ayarlayın; ardından her hücre izi için bir deneysel koşulun görüntülerini açın, ilgi alanını ve izi ölçün ve ayrıca her deneysel koşul için bir arka plan bölgesini ölçün. Ölçümleri kopyalayıp Excel'e yapıştırın. Tüm veriler toplandığında, keyfi birimler cinsinden ortalama yoğunluğu hesaplayın.Başlangıçtaki membran proksimal sinyal moleküllerinin aktivasyonunu ve etkileşimini ölçmek için, arka plan yoğunluğunu ortalamadan çıkarın ve ardından proteinin keyfi birimlerdeki entegre yoğunluğunu elde etmek için alanla çarpın. GP120 ile etkileşimin bir sonucu olarak, virolojik sinapsta insan primer CD4 pozitif T hücreleri, GP120 ve ICAM-1 taşıyan çift katmanlara yerleştirildi; yalnızca ICAM-1 içeren çift katmanlara yerleştirilen hücreler ise sinyalizasyonun bazal seviyelerini belirlemek için kontrol olarak kullanıldı. Hücreler GP120 ve ICAM-1 içeren çift katmanlarla etkileşime girdikten sonra, LCK proteini virolojik sinaps arayüzüne toplandı ve GP120 ile kolokalize oldu.Toplam LCK'nın ortalama yoğunluğu, hem GP one 20 hem de ICAM one içeren çift katmanda, sadece ICAM one içeren katmana göre daha yüksekti. İlginç bir şekilde, entegre yoğunluk seviyeleri benzerdi. Hepsi birlikte değerlendirildiğinde.Bu veriler, LCK'nın merkezi bir kümeye yeniden dağıldığını göstermektedir. CD4 pozitif T hücresinin GP120'ye bağlanması üzerine, TIRF mikroskobu ile tespit edilen ortalama ve entegre fosfo LCK tirozin 394 yoğunlukları görüntülenmiş ve nicelendirilmiştir.Sonuçlar, GP120 bağlanmasının LCK aktivasyon döngüsündeki tirozin 394 kalıntısının fosforilasyonunu artırdığını göstermektedir. Buna karşılık, yalnızca ICAM1 içeren bilayerlar üzerindeki hücrelerin temas alanında, hem GP120 hem de ICAM1 içeren bilayerlara göre daha fazla fin bulunmuştur. Böylece, Finn virolojik sinapsa dahil edilmemiştir.Sonuç olarak, HIV-1 GP120 ile indüklenen virolojik sinapslarda aktif kinazın Finn değil, LCK olduğu sonucuna varıyoruz. Bu videoyu izledikten sonra, spesifik proteinlerle yüklenmiş biyayerlerin nasıl hazırlanacağı, akış hücrelerinde immünofloresan boyamanın nasıl yapılacağı, toplam internal yansıma mikroskobisi kullanılarak hücre biyayer etkileşimlerinin nasıl görüntüleneceği ve temel analizlerin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Bu biyayer sistemi, virolojik sinaps oluşumunun dinamiklerini izleyebileceğiniz canlı hücre görüntülemesi için de kullanışlıdır.Ayrıca, hücreler GFP'ler gibi floresan işaretli proteinlerle transfekte edilebilir. Bu, sinyal moleküllerinin sinapsa katılımındaki ve dağılımındaki değişikliklerin gerçek zamanlı olarak takip edilmesini sağlar.

imaging-hiv-1-envelope-induced-virological-synapse-signaling-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Desteklenen düzlemsel bilayers immünolojik sinaps moleküler etkileşimleri modellemek için kullanılabilir güçlü araçlardır. Burada, lipid bilyer üst broşür sinaps oluşumunu modüle ve sinaps oluşumu TIRF mikroskobu kullanarak görselleştirmek için bilinen hücre adezyon proteinleri demirleme için yöntemler göstermektedir.

İmmünolojik Sinapslar ve Kinapse Eğitim Oluşumu için desteklenen Düzlemsel Bilayers

Protokol zarı proteinleri kullanarak kriyo-elektron tomografisi ve 3D görüntü işleme yapıları belirlemek için yüksek verimli bir yaklaşımı açıklar. Numune hazırlama, veri toplama, veri işleme ve yorumlama kapsar ve yaklaşım, HIV-1 zarf glikoprotein bir temsilcisi hedef üretim ile son bulur. Bu hesaplama prosedürleri, araştırmacılar ve öğrenciler uzaktan çalışma ve veri işleme ve yapısal analiz için katkıda bulunmayı sağlayan bir şekilde dizayn edilmiştir.

Cryo-Elektron Tomografi ve Otomatik Sub-tomogram Ortalaması kullanarak HIV Zarf Glikoproteinler Moleküler Yapılarının Belirlenmesi

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

Bu video, desteklenen bir lipid çift tabakası (SLB) üzerinde doğal öldürücü (NK) hücrelerde immünolojik sinaps oluşumunu görselleştirmek için bir tekniği göstermektedir. SLB ilk olarak florofor etiketli bir NK hücre aktive edici reseptör ligandı ile etiketlenir, ardından NK hücreleri ile inkübasyon yapılır. Daha sonra, hücreler polimerize aktin ve perforin pozitif litik granüller için boyanır. Bu yaklaşım, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu kullanılarak sinaps oluşumunun...

Desteklenen Bir Lipid Çift Tabakası Üzerinde NK Hücre İmmünolojik Sinaps Oluşumunun Süper Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Bu video, birincil insan T hücreleri ile desteklenen lipid çift katmanları (SLB) arasındaki immün sinaps oluşumunu incelemek için bir in vitro tekniği göstermektedir. T hücresi yüzey proteinleri, bir immün sinaps oluşturmak için SLB üzerinde hareketsiz hale getirilen ilgili ligandlarla etkileşime girer, ardından litik granüllerin sinapsa doğru hareketi izler, bu da floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilir.

Desteklenen Düzlemsel Lipid Çift Katmanları ile T Hücresi Etkileşimini İncelemek İçin Bir İn Vitro Teknik

Bu video, T lenfositleri ile floresan antijenleri taşıyan epitel hücreleri arasındaki etkileşimleri araştıran immünolojik sinaps topolojisinin canlı hücre görüntülemesini göstermektedir. Floresan mikroskobu, endotel hücrelerinde kırmızı sitoplazma yer değiştirmesini ve sarı zar halkalarını ortaya çıkarır ve bu da immünolojik sinapsların oluşumunu gösterir.

Canlı Hücre Görüntüleme ile İmmünolojik Sinaps Topolojisinin Değerlendirilmesi

Viral yüzey antijenleri konformasyonlarını anlamak, antikor nötralizasyonunu değerlendirmek ve etkili aşı immünojenlerinin tasarımına rehberlik etmek için gereklidir. Burada, spesifik anti-Env antikorları tarafından transfekte edilmiş hücrelerin yüzeyinde eksprese edilen trimerik HIV-1 Env'nin tanınmasının çalışmasına izin veren hücre bazlı bir ELISA testini açıklıyoruz.

Bir Hücre temelli bir ELISA testi kullanarak, HIV-1 zarf trimerik Glikoproteinler konformasyonel Değerlendirilmesi

Burada, immünolojik sinapslar oluşturmak için cam destekli lipid çift katmanlı tekniğin, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobunun süper çözünürlüklü görüntüleme tekniği ile bir kombinasyonunu açıklıyoruz. Bu protokolün amacı, kullanıcılara bu iki tekniği başarılı bir şekilde uygulamak için gerekli talimatları sağlamaktır.

Bir Cam destekli Planar çift katlı lipid Doğal Öldürücü Hücre İmmünoloji Synapse Süper çözünürlüklü Görüntüleme

Adaptif bağışıklık, T hücreleri ile antijen sunan hücreler arasında oluşan dinamik 'immünolojik sinapslar' tarafından kontrol edilir. Bu protokol, endotel hücrelerinin hem az çalışılmış fizyolojik APC'ler hem de yeni bir 'düzlemsel hücresel APC modeli' türü olarak araştırılması için yöntemleri tanımlar.

Görüntüleme İmmünoloji Synapse Dynamics için bir Endotel Hücre Modeli Düzlemsel

Burada, HIV-1 Gag ve lipid membranları arasındaki etkileşimlerin, buğday tohumu bazlı in vitro translasyon sisteminde sentezlenen YFP etiketli Gag ve bir elektroformasyon tekniği ile hazırlanan GUV'ler kullanılarak görsel olarak analiz edildiği bir in vitro membran bağlanma testini gösteriyoruz.

Dev ünilamellar vesikül (GUV) membranlanna bağlanan, HIV-1 Gag Görselleştirme

Bu protokol hem immünolojik sinaps oluşumunu hem de sonraki polarize salgı trafiğini immünolojik sinapsa doğru görüntüler. Hücresel konjugates bir süperantijen-darbeli Raji hücre (bir antijen sunan hücre olarak hareket) ve Jurkat klonu (bir efektör yardımcı T lenfosit olarak hareket) arasında kuruldu.

İnsan İmmünolojik Sinaps Görüntüleme

Öğrenin, TIRF mikroskobu kullanarak HIV-1 zarf proteininin oluşturduğu virolojik sinaps oluşumunu görselleştirme yöntemini. Bu teknik, sinaps içindeki sinyal moleküllerinin lokalizasyonunu analiz eder.

Görüntülemede HIV-1 Zarf bağlı Virolojik Synapse ve Sentetik Lipid Bilayers üzerine Sinyal

Daha fazla video keşfet