Name: Kolonizasyon Euprymna scolopes Squid tarafından Vibrio fischeri /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Keşfedin Euprymna scolopes mürekkep balığının Vibrio fischeri ile kolonizasyonunu. Bu yöntem, bakteri konsantrasyonunun kolonizasyon başarısı üzerindeki etkisini değerlendirmeye ve mikrobiyal simbiyoz araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar kalamar tesisleri destek için ve bu elyazması hakkında yorum Michael Hadfield ve saha toplama sırasında yardım için Kewalo Deniz Laboratuarı, bu protokol için katkıları Ruby ve McFall-Ngai Laboratuvar üyeleri için Gyllborg Mattias teşekkür ederim. Mandel Laboratuvarında Çalışma NSF IOS-0843633 tarafından desteklenmektedir.

1. Bakteriyel inokulum hazırlanması <ol><li> Gün 0 Kalamar aşılama, plaka LBS konusunda ilgili bakteri suşlarının 13 agar öncesinde iki gün. </li><li> 25-28 ° C&#39;da bakteri inkübe edin. </li><li> 1. Gün Her biri V. koloni olan bir cam tüp içinde kültür ortamı 3 ml LBS inoküle Enfeksiyon için fischeri suşu. Yedek olarak tüpleri yinelenen hazırlayın. </li><li> 2. Gün (Kalamar adımları 3,7-3,10 bakteriyel adımları 1,4-1,6 Koordinat) Önce aşılama için 1 saat, altkültür bakteri cam bir kültür tüpünün 3 ml LBS içine 1:80 (37.5 ul) ve havalandırma ile 1 saat boyunca büyür. </li><li> Aşılama öncesi örnek OD 600 ölçün. Tipik ölçümler 0.3-0.6 zorlamaya bağlı edilir. </li><li> İnokulum hacmi (ul) = 1.25 / OD 60: 3-5 x hedef inokulum için 10 3 CFU / ml şöyle inokulum hacim hesaplamak0 (örn., OD 600 için = 0.5, hesaplanan inokulum hacim = 1.25/0.5 = 2.5 ul). Bu miktar, Basamak 4.1 &#39;de squid içeren deniz suyu direkt olarak eklenir. Bu hesaplama V. farklı suşları için ayarlanması gerekebilir fischeri veya burada belirtilenden daha düşük veya daha yüksek seviyelerde aşılama için. </li></ol> 2. Inokulum sayımı için Agar Plakalarının Hazırlanması <ol><li> Her tedavi için, Adım 4.1 inokulum plaka örnekleri etiketi LBS plakalar (tedavi başına 2). </li><li> Plaka başına 5 steril kaplama boncuk ekleyin. </li></ol> 3. Squid Juveniles Koleksiyonu <ol><li> Refraktometre kullanılarak Anında Okyanusu&#39;nun tuzluluk ölçün ve 35 ‰ ayarlamak. </li><li> Filtre ile sterilize Instant Ocean (FSIO) oluşturmak için, filtrasyon ünitesi ve bağlı bir vakum hattı veya vakum pompası kullanılarak Instant Ocean 1 L filtre. Her dağıtım için şiddetle öncesinde dönen tarafından oksijen su. The filtre ünitesi 2 gün boyunca yeniden kullanılabilir. </li><li> Iki (2) tek kullanımlık numune kapları her birine kısım FSIO 40-50 ml. Etiket En erken gibi bir ve timelies olarak bir. </li><li> Pipet düşük sırtlar yukarıda ucundan yaklaşık 1 cm, (bkz. Şekil 3) keserek juvenil kalamar elde etmek için plastik transferi pipetler fazlalığı hazırlayın. Bu kalamar koleksiyon üzerine geçebileceği daha geniş bir alanda kolaylaştırır. Kaba bir yüzeyidir var olduğu herhangi bir transfer pipetler atın. </li><li> Hazırlanan transferi pipetler kullanarak, E. toplamak gece hilesine karşı FSIO En erken kase aktardığınız scolopes. Erken yavruların 1 üzerinde saat yumurta sisteminde olmuştur ve kontamine kolonizasyon yatkındır var V. Yumurta sisteminde fischeri. Hassas kolonizasyon deneyler için En erken kullanmayın. </li><li> Yumurta tankları yeni yavru için her 30-45 dakika kontrol edin. Tüm yavruların her c sırasında temizlenmiş olduğundan emin olunhalt. FSIO ve timelies kaseye bir transfer pipet, ve mevduat ile yavru çıkarın. Zamanında toplanan Hayvan kolonizasyon deneyler için kullanılabilir. </li><li> Koleksiyon tamamlandığında (~ 45 dk gün battıktan sonra), ana laboratuvara kalamar aktarın. Ampirik olarak o 3 saat aşılar için kesintisiz laboratuvar ışık koşulları altında hayvanların kolonize avantajlıdır. </li><li> Her tedavi için, 40 ml FSIO bir kabın hazırlamak. (Maksimum n = 40 kase başına) deneyi için kaselere kalamar ekleyin. </li><li> Bir aposymbiotic (negatif) kontrol olarak ek bir kapta hazırlayın. </li><li> Her tedavi için özel bir aktarım pipet hazırlayın. </li><li> % 2 etanol ilave kalamar Euthanize. </li></ol> 4. Squid Kolonizasyon <ol><li> Gün 2 - P10 Pipetman kullanarak, her bir tedavi için her kalamar kase (Adım 3.8) bakterilerin hesaplanan kısım (Adım 1.5) akıtın. Hemen sonra 3 saat Sayacı başlatİlk inokulasyon. </li><li> Her tedavi için, kabın kenarına yakın pipet yerleştirmek ve yaklaşık 10 saniye boyunca su ve kalamar karıştırmak için sürekli yukarı ve aşağı pipetleme tarafından atanmış transferi pipetle kabın içinde bir &quot;vorteks&quot; oluşturmak. Tam karıştırma önemlidir. </li><li> Adım 2.2 bir LBS agar üzerine her kase Tabak 50 ul (teknik, tedavi başına plaka iki 50 ul plaka çoğaltır). 25-28 ° C de bir gece inkübe edin. </li><li> Her tedavi için yıkama kase (100 ml FSIO / adet) hazırlayın. </li><li> Her kalamar için Drosophila flakon (4 ml FSIO / adet) hazırlayın. </li><li> Tam 3 saat sonra, kendi yıkama kase (tüm tedavi için komple) için kalamar aktarın. Bu aşılama durur. </li><li> FSIO kendi Drosophila flakonuna her kalamar aktarmak için devam edin. Her tedavi için belirtilen transferi pipet kullanın. </li><li> Gün / n dönmek için kalamar tesisine Drosophila şişeleri tepsiler Taşıight ışık döngüsü hayvanlar embriyogenez sırasında yaşadı. </li><li> Gün 3 - Her bir kalamar için Prepare Drosophila flakon (4 ml FSIO / adet). </li><li> 22-24 saat sonrası aşılama at dusk önce, yeni bir Drosophila şişeye her kalamar aktarın. Her tedavi için belirtilen transferi pipet kullanın. </li><li> Gün 4 - 1,5 ml mikrosantrifüj tüpleri (1/squid) etiketli hazırlayın. </li><li> Önce 46-48 saat sonrası aşılama, önlem olarak alacakaranlıkta ve Drosophila flakon (6 bütünleşmesi ve kapak kapatma otomatik okumak için luminometre seti) her kalamar lüminesans kaydedin. </li><li> Arka plan lüminesans için bir negatif kontrol olarak, herhangi bir squid içermez FSIO ile bir şişeye ölçülür. </li><li> Adım 4,12 bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü yaklaşık 700 ul&#39;lik bir hacimde her squid transfer edin. Bir karton dondurucu kutusuna gitme. Kapak kutusu bir kere girdikten sonra, wel olmayan bakteriler kovulma ışık ipuçları olarak çıkarmayınl-anlaşılmaktadır. </li><li> -80 ° C&#39;da gece boyunca mikrosantrifüj tüpler dondurmak. </li></ol> 5.. Kolonizasyon Düzeylerinin Belirlenmesi <ol><li> Her kalamar için, 475 ul FSIO (veya% 70 Instant Ocean otoklava) ile iki (2) mikrosantrifüj tüpleri, her hazırlamak. </li><li> İlk havaneli temizlemek ve brüt enkaz ve / veya doku kaldırmak için bir Kimwipe kullanarak havan hazırlayın. </li><li> Yeri% 95 etanol içeren 50 ml&#39;lik bir behere ucu aşağı havan. Etanol yaklaşık 3 cm yükseklikte ilave edilmelidir. </li><li> Her havaneli için, kaptan çıkarın ve Kimwipe ile ucu silin. </li><li> Etanol banyoya geri havaneli batırıp çıkarın ve takın (en uç) bir mikrosantrifüj tüpü rafa ve yaklaşık 15 dakika için tamamen kurumaya bırakın. </li><li> Bir mikrosantrifüj tüp rafa Çözülme kalamar (maksimum n = 8). </li><li> Gerekirse, 700 ul için ses seviyesini ayarlayın. </li><li> Basamak 5.5 &#39;ten havaneli kullanılarak, mürekkep kesesi RUP kadar hayvan doku bozabilirtures (suyun bulanık gri renk dönecek). </li><li> Havaneli çıkarın ve tüm doku tüp içinde kalmasını sağlar. </li><li> Tam olarak 10 saniye (bir zamanlayıcı kullanın) vorteksleyin doku kısaca. </li><li> Doku 10 dakika dinlenmeye bırakın. Doku yerleşir ve bakteri ve mürekkep çözelti içinde kalır. Izleyin hesaplamalar için, bakteri / mürekkep çözümü [A] seyreltme (yani 700 ul yılında E. scolopes ışık organı Homojenat) &#39;dir. Seri 01:20 dilüsyonları ([B], [C]) aşağıda tarif edilmektedir. </li><li> [B] seyreltme için, Basamak 5.1 &#39;de hazırlanan mikrosantrifüj tüpler için 25 ul [A] ekleyebilir. Vortex. </li><li> [C] seyreltme için, 25 ul ilave [B] Basamak 5.1 &#39;de hazırlanan mikrosantrifüj tüpler birine. Vortex. </li><li> LBS agara her seyreltme Plaka 50 ul, 2 tedavi başına çoğaltır. </li><li> 25-28 ° C&#39;da gece boyunca inkübe. </li></ol> 6. Veri Analizi <ol><li> CFU / ışık organ (LO), ülke hesaplamak içinHer tedavi için plaka üzerinde t koloniler içinde 10-400 kolonileri bulunur ve uygun formülü kullanın: CFU / LO = ([A] plakasında koloniler) x 14 veya CFU / LO = ([B] plakasında koloniler) x 280 veya CFU / LO = ([C] plakasında koloniler) x 5600. </li><li> Logaritmik bir ölçekte bireysel veri noktaları ve medyan çizilir. </li><li> Veri genellikle normalde farklı değişkenlerle olan, dağıtılmış değildir ve aykırı anlamlı biyolojik bilgileri içerebilir. Bu nedenle, parametrik olmayan testler tedaviler anlamlı farklılık olup olmadığını belirlemek için faydalı bir yöntem sağlar. </li><li> İstatistiksel analizler için GraphPad Prism yazılımını kullanın. Iki tedavi için, Wilcoxon Rank Sum testi kullanın. Daha büyük iki tedavi arasındaki karşılaştırmalar için uygun post-testleri ile Kruskal-Wallis testi kullanın. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Örnek kolonizasyonu deneyi sonuçları, Şekil 4 &#39;de gösterilmiştir. İki suşları <em&gt; V. lüminesans farklı göreli seviyeleri gösterirler fischeri aposymbiotic (uncolonized) kontrol grubu olarak altı kalamar ile birlikte, altı kalamar inoküle her idi. E. scolopes symbiont, ES114 14 ve parlak Sepiola robusta symbiont, SR5 15,16. Benzer inokulum seviyeleri (Şekil 4A) 3 saat içinde% 100 kolonizasyonu yol açar. 48 saat sonra, lüminesans seviyeleri (Şekil 4B) ve CFU sayımları (Şekil 4C) suşu kolonizasyonu yeterliliği değerlendirmek için tespit edildi. Belirli lüminesans (Şekil 4D; başına bakteri) tespiti sembiyoz sırasında her bakteri suşunun parlaklık belirlenmesi için olanak sağlar. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3758/3758fig1.jpg" /> Kolonizasyon prosedürü Şekil 1. Akış çizelgesi. Bakteri ve kalamar belirtilen inokulum karıştırılır, sonra ayrı ayrı hasat edilir. Squid yıkanır, daha sonra 3 saat, 24 saat, ve 4 de yeni su aktarılır<html> 8 saat sonrası aşılama. 48 saat sonra ölçülür ve lüminesans hayvanlar dondurulur, bu hayvanlarda yüzeyi sterilize hizmet eder. Işık-organ bakteri -80 az sürdürebilmesi kolonize ° C de bir çözülme (ek donma-çözülme çevrimleri) aracılığıyla. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3758/3758fig2.jpg" /> Homojenizasyon ve bakterilerin seyreltme kaplama gösteren Şekil 2. Akış çizelgesi. Seri 20 kat dilüsyonlarının kolonize bakteri sayımı için uygun dinamik aralığı sağlamak. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3758/3758fig3.jpg" /> Şekil 3. Yavru kalamar zedeleyecek dar bir delik (A) uygun bir şekilde dar konik mil ile pipetler aktarın. Makas veya jilet ile en dar bölümü keserek tedavi öncesi (B) yavru kalamar aktarmak için uygun bir araç verir. s/ftp_upload/3758/3758fig4.jpg &quot;/&gt; Şekil 4. Bir kolonizasyon tahlil için örnek veriler. Inokulum kâseler içinde bakteri (A) Düzeyleri. Bireysel kalamar (B) Lüminesans. (C) bireysel kalamar Colony sayar. Bireysel kalamar (D) Özel lüminesans. Apo, Aposymbiotic (negatif kontrol uncolonized).

<ol><li>Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+normal+bacterial+flora+of+the+oral+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Defining the normal bacterial flora of the oral cavity.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).</li>
<li>Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+regulatory+gene+is+sufficient+to+alter+bacterial+host+range%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range.</a> Nature. 458, 215-218 (2009).</li>
<li>Grice, E. A., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The skin microbiome.</a> Nat. Rev. Microbiol. 9, 244-253 (2011).</li>
<li>Malic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+specific+bacteria+in+wound+biofilms+using+peptide+nucleic+acid+fluorescent+in+situ+hybridization+%28PNA+FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH).</a> Microbiology. 155, 2603-2611 (2009).</li>
<li>Turnbaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+microbiome+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The human microbiome project.</a> Nature. 449, 804-810 (2007).</li>
<li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+winnowing%3A+establishing+the+squid-Vibrio+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).</li>
<li>Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+a+cooperative%2C+bacterial-animal+association%3A+the+Vibrio+fischeri-Euprymna+scolopes+light+organ+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Lessons from a cooperative, bacterial-animal association: the Vibrio fischeri-Euprymna scolopes light organ symbiosis.</a> Annu. Rev. Microbiol. 50, 591-624 (1996).</li>
<li>McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiont+recognition+and+subsequent+morphogenesis+as+early+events+in+an+animal-bacterial+mutualism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism.</a> Science. 254, 1491-1494 (1991).</li>
<li>Jones, B., Nishiguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counterillumination+in+the+Hawaiian+bobtail+squid%2C+Euprymna+scolopes+Berry+%28Mollusca%3A+Cephalopoda%29%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biology%22%5BJournal%5D)">Counterillumination in the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes Berry (Mollusca: Cephalopoda).</a> Marine Biology. 144, 1151-1155 (2004).</li>
<li>Graf, J., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-derived+amino+acids+support+the+proliferation+of+symbiotic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Host-derived amino acids support the proliferation of symbiotic bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1818-1822 (1998).</li>
<li>Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+squid+that+glows+in+the+night%3A+development+of+an+animal-bacterial+mutualism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A squid that glows in the night: development of an animal-bacterial mutualism.</a> J. Bacteriol. 174, 4865-4870 (1992).</li>
<li>Lee, P. N., McFall-Ngai, M. J., Callaerts, P., de Couet, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hawaiian+bobtail+squid+%28Euprymna+scolopes%29%3A+a+model+to+study+the+molecular+basis+of+eukaryote-prokaryote+mutualism+and+the+development+and+evolution+of+morphological+novelties+in+cephalopods%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">The Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes): a model to study the molecular basis of eukaryote-prokaryote mutualism and the development and evolution of morphological novelties in cephalopods.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).</li>
<li>Stabb, E., Visick, K., Millikan, D., Corcoran, A. The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes symbiosis: a model marine animal-bacteria interaction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStabb%2C+E+%22Recent+Advances+in+Marine+Science+and+Technology%22">Recent Advances in Marine Science and Technology</a>. , PACON International. Honolulu, Hawaii. (2001).</li>
<li>Boettcher, K. J., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depressed+light+emission+by+symbiotic+Vibrio+fischeri+of+the+sepiolid+squid+Euprymna+scolopes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna scolopes.</a> J. Bacteriol. 172, 3701-3706 (1990).</li>
<li>Fidopiastis, P. M., von Boletzky, S., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+niche+for+Vibrio+logei%2C+the+predominant+light+organ+symbiont+of+squids+in+the+genus+Sepiola%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola.</a> J. Bacteriol. 180, 59-64 (1998).</li>
<li>Bose, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+rapid+evolution+of+the+luxR-luxI+intergenic+region+to+the+diverse+bioluminescence+outputs+of+Vibrio+fischeri+strains+isolated+from+different+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Contribution of rapid evolution of the luxR-luxI intergenic region to the diverse bioluminescence outputs of Vibrio fischeri strains isolated from different environments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 2445-2457 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Tarif kolonizasyonu tahlil, bir laboratuvar ortamında, doğal bir proses simbiyotik analizi için olanak sağlar. Bunun gibi, farklı doğal izole tarafından mutant soylar, ve farklı kimyasal rejimlerinde kolonizasyonu değerlendirmek için kullanılabilir. Açıklanan varyasyonlar ile ilgili deneyler yaygın sembiyoz farklı yönleriyle değerlendirmek için kullanılmıştır. Kolonizasyonu kinetikleri tesadüf detektörü çıkartılmış olduğu bir sintilasyon sayacı otomatik olarak tespit edilebilir ilk 24 saat, içinde lüminesans incelenmesi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Cam Kültür Tüpler, 16 mm Çap </td><td> VWR </td><td> 47729-580 </td><td></td></tr><tr><td> Cam Kültür Tüpler için kapaklar </td><td> Balıkçı </td><td> NC9807998 </td><td></td></tr><tr><td> OD 600 Belirlenmesi görebilir Spektrofotometre </td><td> Biowave </td><td> CO8000 </td><td> OD 600 ölçebilen herhangi bir spektrofotometre çalışacaktır. Bu birim cam kültürü tüplerinin doğrudan sıvı OD 600 ölçebilirsiniz. Inokulum hesaplama bazı ayarlamalar kullanılan alet bağlı olarak gerekli olabilir. </td></tr><tr><td> GloMax 20/20 Tek-Tüp Luminometre </td><td> Promega </td><td> E5311 </td><td> Turner Biyosistem 20/20n Luminometre Eşdeğer. Mikrosantrifüj tüpü tutucusu içerir. </td></tr><tr><td> GloMax 20/20 Işık Standart </td><td> Promega </td><td> E5341 </td><td> Luminometre kalibrasyonu için. </td></tr><tr><td> Refraktometre, El </td><td> Foster ve Smith Aquatics </td><td> CD-14035 </td><td> Deiyonize su ile her kullanımdan önce kalibre. Tuz birikmesini önlemek için deiyonize su ile her kullanımdan sonra durulayın. </td></tr><tr><td> Instant Ocean (yapay deniz suyu konsantresi) </td><td> Foster &amp; Smith Aquatics </td><td> CD-16881 </td><td> Ardından 0.2 um bir filtreden SFCA, sonra süzme, refraktometre kullanılarak, deiyonize su içinde 35 ‰ azından hazırlayın. </td></tr><tr><td> Filtrasyon Ünitesi </td><td> Nalgene </td><td> 158-0020 </td><td> Sürfaktan içermeyen selüloz asetat (SFCA) membranı, 0.2 um. Bazı yüzey içeren PES filtreleri ile değişken sonuçlar gözlemledik. </td></tr><tr><td> Transferi Pipetler </td><td> Balıkçı </td><td> 13-711 -09:00 </td><td> Makas veya jilet kullanarak, temiz pipet ucu çapını artırmak ve kalamar yavru sıkma önlemek için ilk sırt üstü ucu kesilir. </td></tr><tr><td> Tek Örnek Kaseler (plastik tumbler) </td><td> Kuyrukluyıldız </td><td> T9S (9 oz.) </td><td> Üst çapı 3 ile aşılama için Kaseler, ¼ &quot;, alt çapı 2 ¼&quot;, yüksekliği 3 &quot;. Onlar kalamar düşük oksijenli niş içinde sıkışıp olsun hangi bir alt kenarı var gibi Kaseler homojen bir ortam oluşturmak. Boyutu optimize edilmiştir için 40 ml inokulum. webstaurantstore.com Boş, # 619PI9. </td></tr><tr><td> Drosophila Flakon </td><td> VWR </td><td> 89092-720 </td><td> Flakon çapı luminometre PMT açılış eşleşir. </td></tr><tr><td> 1.5 ml Microcentrifuge Tüpler </td><td> ISC Bioexpress </td><td> C-3217-1CS </td><td> Tüpler havan şekline uygun olmalıdır. </td></tr><tr><td> Etanol, 200 Proof </td><td> Balıkçı </td><td> BP2818-100 </td><td></td></tr><tr><td> Havan </td><td> Kimble Chase / Kontes </td><td> 749521-1500 </td><td></td></tr><tr><td> Kaplama Boncuklar, 5 mm çaplı </td><td> Kimble Chase </td><td> 13500 5 </td><td> Tüp ve otoklav başına 5 hazırlayın. </td></tr></tbody></table>

kolonizasyon euprymna scolopes squid tarafından vibrio fischeri</em

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Spesifik bakteri hayvan dokusu 1-5 ile birlikte bulunur. Böyle ana-bakteriyel dernekler (symbioses) (patojen) zararlı olabilir, hiçbir spor sonucu (ortakçı), ya da (mutualist) faydalı olabilir. Çok dikkat patojen etkileşimleri verilmiş olsa da, biraz ortamdan ortakçı / yararlı bakterilerin tekrarlanabilir satın dikte süreçleri hakkında bilinmektedir. Deniz Gram-negatif bakteri arasında ışık organı karşılıkçılık V. fischeri ve Hawai Bobteyli kalamar, E. scolopes, bir ana (E. scolopes) ömrü 6,7 boyunca yalnızca bir bakteri türü (V. fischeri) ile simbiyotik bir ilişki kurar ki bir çok spesifik bir etkileşim gösterir. V. tarafından üretilen Biyolüminesens Bu etkileşim sırasında fischeri E. bir anti-yırtıcı yarar sağlar nokturnal faaliyetleri sırasında scolopes 8,9 ikenbesin açısından zengin konak doku sağlar V. Korumalı bir niş 10 fischeri. Her ana üretimi sırasında, bu ilişki dolayısıyla simbiyotik gelişiminin çeşitli aşamalarında ayrıntılı bir biçimde tespit edilebilir, öngörülebilir bir süreci temsil değinmeyecek edilir. İlk 30-60 dakika içinde toplanan ve symbiont-serbest su transfer edilirse laboratuarda, yavru kalamar ambar aposymbiotically (uncolonized), ve, deneysel inokulum 6 dışında kolonize olamaz. Bu etkileşim, böylece çevreye 11,12 bir simbiyotik mikrop spesifik kazanım yol tek tek adımların değerlendirmek için yararlı olan bir model sistemi sağlar. Burada yeni aposymbiotic E. yumurtadan oluşur kolonizasyon derecesini değerlendirmek için bir yöntem tarif scolopes (yapay) deniz suyu içeren maruz V. fischeri. Bu basit test aşılama, doğal enfeksiyon ve kurtarma açıklarE. doğmakta olan ışık organ bakteriyel symbiont arasında scolopes. Bakım özellikle su kalitesi ve ışık işaretleri ile ilgili, simbiyotik gelişim sırasında hayvanlar için tutarlı bir ortam sağlamak için alınır. Açıklanan simbiyotik nüfus karakterize etmek Yöntemleri bakteriyel kaynaklı biyolüminesensin (1) ölçümü ve geri symbionts sayımı (2) doğrudan koloni bulunmaktadır.

Yöntemine göre Hawaiian Bobteylleri squid prosedür özetlenmektedir<em&gt; Euprymna scolopes</em&gt; Ve bakteriyel symbiont,<em&gt; Vibrio fischeri</em&gt;, Bakteriler tarafından kalamar ışık organın belirli kolonizasyon için izin tanıtıldı ayrı ayrı, sonra yükseliyor. Bakteriyel kaynaklı lüminesans ve doğrudan koloni sayımı ile kolonizasyon tespit açıklanmıştır.

Kolonizasyon Euprymna scolopes Squid tarafından Vibrio fischeri</em

Belirli bakteriler, hayvan dokularıyla ilişkili olarak bulunur1-5. Bu tür konakçı-bakteri ilişkileri (sembiyozlar) zararlı (patojenik) olabilir, hiçbir...

Bu prosedürün genel amacı, hayvanlara Vibrio fischeri bakterileri inoküle edildiğinde kalamar kolonizasyonunun derecesini değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle kültürde büyütülen bakterilerin hazırlanması ve APO simbiyotik kalamar larvalarının toplanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, kalamar larvalarına belirli bir konsantrasyonda bakteri inoküle edilir.Kolonizasyonun sonunda, hayvanların lüminesansı belirlenir ve örnekler dondurularak yüzey sterilizasyonuna tabi tutulur. Son olarak, simbiyotik bakterileri serbest bırakmak için örnekler homojenize edilir. Nihayetinde, simbiyotik homojenatların dilüsyon plaklama yöntemiyle, her bir bakteriyel suş veya örnek için medyan kolonizasyon düzeyini gösteren sonuçlar elde edilir.Bu yöntem, mikrobiyal suşlar arasında konakçı özgüllüğünün nasıl geliştiği gibi mikro post etkileşimleri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Mürekkep balığı inokülasyonundan iki gün önce bakteriyel inokülumu hazırlamak için, ilgili bakteriyel suşları LBS agar plaklarına ekin ve bakterileri gece boyunca 25 ile 28 °C'de inkübe edin. Ertesi gün, incelenen her suş için, enfeksiyon amacıyla her bir V. fischeri suşunun bir kolonisini, cam kültür tüpündeki 3 mL LBS besiyerine inoküle edin. Yedek olarak çift tüpler hazırlayın; takip eden günde, bakterilerin 37,5 µL'sini 3 mL'lik taze LBS içeren bir tüpe pasajlayın ve havalandırma ile bir saat boyunca büyütün.Kültürün OD 600 değerini ölçün ve ardından 1,25'i OD 600 değerine bölerek, mililitre başına 3 ila 5 x 10³ CFU hedef inokulum için gerekli hacmi belirleyin. Daha fazla ayrıntı için lütfen yazılı protokole bakın. İnokulumun sayımı için plakaları hazırlamak amacıyla, mürekkep balığı yavrularını toplamak için her bir LBS plakasına beş adet steril ekim boncuğu ekleyin.İlk olarak, instant ocean tuzluluğunu ölçmek için bir refraktometre kullanın ve bir filtrasyon ünitesi ile bağlı bir vakum hattı veya vakum pompası kullanarak tuzluluğu 35 binde bir olarak ayarlayın; filtre sterilize edilmiş instant ocean elde etmek için instant ocean'ı filtreleyin. Her bir alikotu dağıtmadan önce suyu kuvvetlice çalkalayarak oksijenlendirin ve iki adet tek kullanımlık numune kasesinin her birine 40 ila 50 milliliters FSIO ekleyin. Kaselerden birini "erken" (early) ve diğerini "zamanında" (timely) olarak etiketleyin. Genç mürekkep balıklarını toplamak için, plastik transfer pipetlerinin uç kısmındaki en alt çıkıntıların yaklaşık bir santimetre üzerinden keserek fazla miktarda pipet hazırlayın.Bu, kalamarın toplama sırasında geçebileceği daha geniş bir alan sağlar; yüzeyi pürüzlü olan pipetleri atın ve önceden hazırlanmış transfer pipetlerini kullanın. Gece boyunca yumurtadan çıkmış olan larvaları toplayın ve FSIO içeren erken evre kabına aktarın. Bu larvalar yumurta sisteminde bir saatten fazla kalmışlardır ve kontamine v Fisher eye kolonizasyonuna karşı hassastırlar.Bu nedenle, hassas kolonizasyon deneyleri için erken çıkanları kullanmayın. Yeni çıkan yavrular için yumurta tanklarını her 30 ila 45 dakikada bir kontrol edin ve hepsini zamanında çıkanların bulunduğu FSIO kabına aktarın. Toplama işlemi tamamlandığında, mürekkep balıklarını, üç saatlik bir inokulasyon için kesintisiz ışık altında kolonize edilecekleri ana laboratuvara nakledin.Apo, simbiyotik veya kolonize edilmemiş kontrol dahil olmak üzere her işlem için inkübasyonun ardından, 40 mililitre FSIO içeren bir kap hazırlayın. Mürekkep balıklarını kaplara ekleyin. P 10 pipet kullanarak, önceden hesaplanmış miktardaki hazırlanan bakteriyi dağıtın.İlk inokülasyondan hemen sonra üç saatlik bir zamanlayıcı başlatın. Her işlem için, transfer pipetini kasenin kenarına yakın bir konuma getirip suyu ve kalamarı yaklaşık 10 saniye boyunca karıştırmak için tekrarlanan yukarı-aşağı pipetleme işlemiyle kasede bir girdap oluşturun. İnokülumun kalamarla termal olarak karıştırılması deneyin başarısı için kritik öneme sahiptir; bu işlem farklı yönlerde karıştırma ve tekrarlama yoluyla gerçekleştirilir. Ardından her kaseden 50 microliters alarak önceden hazırlanmış LBS auger plakasına ekleyin.Plaklama boncuklarıyla birlikte 25 ila 28 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ardından, her bir işlem için bir kaba 100 mL FSIO ekleyerek yıkama kaplarını hazırlayın. Her bir kalamar için dört mL FSIO içeren drosophila şişelerini hazırlayın.Üç saatlik inkübasyonun ardından, mürekkep balıklarını ilgili yıkama kaplarına aktarın. Her işlem için yeni belirlenmiş transfer pipetleri kullanarak, her bir mürekkep balığını FSIO içeren kendi drosophila tüpüne aktararak inokülasyonu durdurun. Tepsileri hava kararmadan önce mürekkep balığı tesisine taşıyın.İnokülasyondan bir gün sonra. Her mürekkep balığını FSIO içeren yeni bir drosophila tüpüne aktarın. İnokülasyondan iki gün sonra, gün batımından hemen önce, altı saniyelik entegrasyon ve kapak kapatıldığında otomatik okuma için ayarlanmış bir lüminometre kullanarak her bir işlem için belirlenmiş bir transfer pipeti kullanın.Her bir mürekkep balığının lüminesansını ölçün ve kaydedin. Arka planı kontrol etmek amacıyla, sadece FSIO içeren bir tüpü kör örnek olarak ölçün. Lüminesans ölçümünden sonra, her bir mürekkep balığını yaklaşık 700 µL hacmindeki sıvı ile birlikte 1,5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.Tüpleri karton bir dondurucu kutusuna yerleştirin. Kutunun kapağını kapatın ve gece boyunca -80 °C'de dondurun. Kolonizasyon seviyelerini ölçmek için numuneleri hazırlamak amacıyla, havan tokmağını ucu aşağı gelecek şekilde, yaklaşık üç santimetre yüksekliğinde %95 etanol ile doldurulmuş 50 mL'lik bir behere yerleştirin.Tokmakları beherden çıkarın ve uçlarını bir kim wipe ile silin. Ardından uçlarını tekrar etanolün içine daldırın. Tokmakları uçları yukarı bakacak şekilde bir mikrotüp rafına yerleştirin ve daha önce dondurulmuş kalamarları çözdürüp hacimleri 700 microliters seviyesine ayarladıktan sonra tamamen havada kurumaya bırakın.Hาวf kesesi yırtılana kadar hayvan dokusunu bir havan eli ile parçalayın. Havan elini çıkarın ve tüm dokunun tüp içerisinde kaldığından emin olun. Dokuyu 10 saniye boyunca vorteksleyin ve dokunun çökmesi için 10 dakika dinlenmeye bırakın.Kalan çözeltinin seri dilüsyonlarını yaptıktan sonra, her dilüsyonun 50 µL'sini LBS agar plaklarına ekleyin. Plakları 25 ile 28 °C'de gece boyunca inkübe edin. Yazılı protokolde belirtildiği şekilde veri analizine geçin.Burada, farklı göreceli lüminesans seviyeleri sergileyen iki V. fischeri suşunun kolonizasyon testi sonuçları gösterilmektedir. Her bir suş altı mürekkep balığına inoküle edilmiş ve altı mürekkep balığı da apo-simbiyotik veya kolonize olmamış kontroller olarak kullanılmıştır. Benzer inokülum seviyeleri, üç saat içinde %100 kolonizasyonla sonuçlanmış ve bu durum 48 saat boyunca devam etmiştir.Suşun kolonizasyon yeterliliğini değerlendirmek için lüminesans seviyeleri ve CFU sayıları belirlenmiştir. Burada gösterildiği gibi spesifik lüminesansın ölçülmesi, simbiyoz sırasında her bir bakterinin parlaklığının belirlenmesine olanak tanır. Bu videoyu izledikten sonra, bakterilerin ve mürekkep balıklarının kolonizasyon deneyi için nasıl hazırlanacağı, kolonizasyon deneyinin nasıl gerçekleştirileceği ve bakterilerinizin eco'yu ne ölçüde kolonize ettiğini belirlemek için deney sonuçlarının nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

colonization-of-euprymna-scolopes-squid-by-vibrio-fischeri

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, Hawaii kuyruğu kesik kalamar hemocytes (kan hücreleri) elde etmek için nasıl...

Hawaii Bobteylleri Squid Hemocytes Alınması Euprymna scolopes Ve Simbiyotik ve Non-Simbiyotik Bakteriler bağlılık Gözlem

Biz biyofilm oluşumunu araştırmak için basit, yarı-nicel yöntem...

Buruşuk Koloni Gelişimi kullanarak Biyofilm Oluşumu değerlendirin Bir Yarı-kantitatif Yaklaşım

Kaynak: Heering, J., ve diğerleri. Hücresel Farklılaşmanın İndüksiyonu ve Vibrio parahaemolyticus Yüzücü ve Sürü Hücrelerinin Tek Hücre Görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, özel olarak hazırlanmış bir agar ortamı kullanılarak Vibrio parahaemolyticus'ta sürü hücre farklılaşmasının indüklenmesini göstermektedir. Demir tükenmesi, kalsiyum takviyesi ve yüzey teması gibi çevresel ipuçlarını manipüle ederek, bakteriler yüzücü formlarından lateral flagellalı uzun sürü hücrelerine geçiş için...

Vibrio parahaemolyticus'un Sürü Hücrelerine Farklılaşmasının İndüksiyonu

Kaynak: Heering, J., ve diğerleri., Hücresel Farklılaşmanın İndüksiyonu ve Vibrio parahaemolyticus Yüzücü ve Sürü Hücrelerinin Tek Hücre Görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2017).Bu video, floresan görüntüleme için bir Vibrio parahaemolyticus kolonisinden sürü hücrelerinin hazırlanmasını göstermektedir. Bakteriler, yüzücü hücrelerde tek kutuplu ve uzun sürü hücrelerinde iki kutuplu olarak lokalize olan ve görsel farklılaşmalarına izin veren florofor etiketli bir proteini eksprese etmek için genetik...

Vibrio parahaemolyticus Swarmer Hücrelerinin Görüntüleme İçin Hazırlanması

Kaynak: Nag, D. ve diğerleri. Yetişkin Zebrafish modelinde Vibrio kolera kolonizasyonu ve ishalinin nicelendirilmesi. J. Vis. Exp. (2018)Bu video, antibiyotiklere dirençli Vibrio cholerae stürüyle enfekte olmuş yetişkin zebrafishlerde bağırsak bakteri yükünü niceliklendirmek için bir protokolü göstermektedir. Ötenazi ve diseksiyon sonrası, bağırsak sistemi izole edilir, cam boncuklarla homojenleştirilir ve bakteriler serbest bırakılmak için işlenir. Ortaya çıkan homojenat, seçici bir ortama...

Vibrio cholerae ile enfekte olan zebrabalıklarda bağırsak bakteri yükünün nicelendirilmesi

Kaynak: Nag, D. , et.al. Yetişkin Zebrafish modelinde Vibrio kolera kolonizasyonu ve ishalinin nicelendirilmesi. J. Vis. Exp. (2018)Bu video, yetişkin zebra balıklarının patojenik Vibrio cholerae sturu ile aşılanmasını ve bağırsak kolonizasyonunu ve hastalık sonuçlarını incelemeyi göstermektedir. Bakteriyel toksinlerin bağırsak bütünlüğünü nasıl bozduğunu, bu da balıkların daha fazla analiz için hazırlanmadan önce sıvı sızıntısına, mukus salgılanmasına ve sulu ishale neden olduğunu gösteriyor.

Yetişkin Zebrabalıklarda Vibrio cholerae ile bağırsak kolonizasyonu ve ishal indüksiyonu

Bu protokol, farklı olarak farklı Vibrio parahaemolyticus yüzücü ve swarmer hücrelerinin tek hücreli mikroskobu sağlar. Yöntem, tek hücreli analiz için kolayca bulunabilen bir swarmer hücreleri popülasyonu üretir ve hücre kültürlerinin hazırlanmasını, swarmer farklılaşmasının indüksiyonunu, numunenin hazırlanmasını ve görüntü analizini kapsar.

Hücresel Farklılaşma ve Tek Hücreli Görüntüleme İndüksiyonu<emVibrio parahaemolyticus</em&gt; Yüzücü ve Swarmer Hücreleri

Zebra balığı vardır doğal Vibrio cholerae ev sahipliği ve özetlemek ve iletim tüm bulaşıcı döngüsüne kolonizasyon üzerinden çalışma için kullanılabilir. Burada, V. cholerae kolonizasyon düzeylerini değerlendirmek ve ishal içinde zebra balığı ölçmek nasıl gösterir.

Vibrio cholerae kolonizasyon ve ishal yetişkin zebra balığı modelindeki miktarının

Zebra balığı (Danio rerio) yaygın olarak kullanılan omurgalı hayvan için bir model mikrobiyal kolonizasyon ve Patogenez hale gelmektedir. Bu iletişim kuralı protozoon Terliksi Hayvan caudatum gıda kaynaklı hastalık içinde zebra balığı larva için bir araç olarak açıklar. P. caudatum kolayca bakteri içselleştirmesi ve doğal preying davranış ile larva zebra balığı tarafından alınan.

Protozoon Terliksi Hayvan caudatum zebra balığı larva gıda kaynaklı enfeksiyonlar için bir araç olarak kullanma

Bakteriler, interbakteriyel rekabetle uğraşmak için farklı mekanizmalar kodlayabilir. Burada, bakteriyel izolatlar ve karma bir nüfusun uzamsal yapısını nasıl etkilediğini arasında rekabetçi etkileşimleri karakterize etmek için kültür tabanlı bir protokol sunuyoruz.

Vibrio fischeri Izolatlar arasında rekabetçi etkileşimleri ölçmek için kokuluçak assay

Bu makalede, kokültürdeki bakteriyel rekabeti görselleştirmek ve ölçmek için tek hücreli floresan mikroskopisi kullanma yöntemi açıklanmaktadır.

Tek Hücreli Floresan Görüntüleme Kullanılarak Interbakteriyel Rekabetin Nicelemesi

Keşfedin Euprymna scolopes mürekkep balığının Vibrio fischeri ile kolonizasyonunu. Bu yöntem, bakteri konsantrasyonunun kolonizasyon başarısı üzerindeki etkisini değerlendirmeye ve mikrobiyal simbiyoz araştırmalarına katkı sağlar.

Kolonizasyon Euprymna scolopes Squid tarafından Vibrio fischeri

Daha fazla video keşfet