Name: İnsan Embriyonik endotel hücre Co-kültür aracılık Olgunlaşma Bir Yönetmen Farklılaşma Yaklaşım Pankreas insülin üreten hücreler için Kök Hücre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Öğrenin, insüler üreten hücreler elde etmek için endotel hücre ortak kültürüyle çok aşamalı pankreas farklılaşması protokolü. Bu yöntem, insülin ekspresyonunda yüksek verim ve olgunlaşma sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz 116520 DP2 ve ORAU Ralph Powe Acemi Fakültesi Geliştirme Ödülü NIH Yeni Yenilikçisi Ödülü destek kabul ediyorsunuz.

1. Hücre Bakım <ol><li> Medya her gün değiştirmek ile H1 hESC (WiCell), mTeSR1 medya ile hESC nitelikli matrigel kuyucuklar da saklandı. F12: Wells DMEM ile 25 ml hESC matrigel 300 ul ilave edilerek hazırlanır seyreltik matrigel çözeltisi ile kaplandı. Bu matrigel çözeltinin 1 ml altı kuyulu plakanın her oyuğa ilave ya da 400 ul bir 12 kuyulu plakanın her oyuğa ilave edildi ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca kat etmesine izin verildi. Hücreler mekanik onlar 1 arasında ve çapı 1.5mm ulaştı kez koloniler kazınarak 1:4 bölünmüş bir oranında pasajlandı. </li><li> RHMVEC (VEC teknolojileri) medya her gün değiştirmek ile MCDB-131 ortamda sürdürüldü. % 80 izdiham 1:3 bölünmüş bir oranına ulaşılmıştır kez Hücreler tripsinizasyon ile ayrıldı. Pasajlar 3 ile 7 arasında endotel hücreleri, bu çalışma için kullanıldı. </li></ol> 2. Stok Çözümler hazırlanması <ol><li> Aktivin A steril P 50 mcg / mL &#39;de yeniden yapıldıBS sığır serum albümini içeren% 0.1. Çözelti -20 ° C&#39;de muhafaza edildi bölünüp </li><li> EGF steril 10 mM asetik asit içerisinde 500 ug / mL &#39;de yeniden çözüldü. Çözelti -20 ° C&#39;de muhafaza edildi bölünüp </li><li> İnsülin suyun 10 ml &#39;ye 0.1 ml glasiye asetik asit ilave edilerek asitleştirildi hazırlanan H2O (pH ≤ 2), ilave edilerek 10 mg / ml&#39; de yeniden çözüldü. </li><li> DAPT 18 mg / ml DMSO içinde yeniden çözüldü. F12, bölünüp -20 ° C&#39;de muhafaza: Bu daha DMEM 300 uM konsantrasyona seyreltildi </li><li> KAAD-Cyclopamine 5mg/ml DMSO içinde yeniden çözüldü. F12, bölünüp -20 ° C&#39;de muhafaza: Bu daha DMEM 2 uM konsantrasyona seyreltildi </li><li> All-trans retinoik asit% 95 etanol içinde 2.7 mg / ml olarak yeniden yapıldı. , F12 bölünüp -80 ° C&#39;de saklanır: Daha da DMEM içinde 2mm konsantrasyona seyreltildi </li></ol> 3. Definitive Endoderm (DE) ve Pankreas Progenitör (PP) İndüksiyon <ol><li> Saat sonraESC koloniler 1 ve çapı 1.5 mm arasında ulaşılır, DE indüksiyon DMEM eklenmesi ile yapıldı: B27 F12,% 0.2 BSA, A ve 4 gün boyunca 1 uM Wortmannin (gün 0-Gün 4) ortam ile 100 ng / ml aktivin ile desteklenmiş her gün değiştirin. </li><li> DE indüksiyonu tamamlandıktan sonra, pankreas progenitör indüksiyon DMEM için ortam değiştirerek oluşturuldu: F12 24 saat için 0.2 mM konsantrasyonda (Gün 4 Gün 5) B27,% 0.2 BSA ve KAAD-Cyclopamine ile desteklenmiş. </li><li> 24 saat sonra medya DMEM şekilde değiştirildi: F12 ile desteklenmiş B27,% 0,2 BSA, medya her gün değiştirmek ile 3 gün için 0.2 mM konsantrasyon ve 2 mM konsantrasyonda all-trans retinoik asit (Gün 5 Gün 8) KAAD-Cyclopamine . </li></ol> 4. Pankreas Olgunlaşma <ol><li> PP indüksiyonundan sonra, tüm gruplar DMEM oluşan olgunlaşma medyaya değiştirildi: F12 2 gün süresince B27,% 0,2 BSA, 10 mM Nikotinamid, 25 mcg / ml insülin, 30 nM Na 2 SeO 3 ve 50 mg / ml transferrin ile desteklendimedya ile ays (Gün 8 Gün 10) her gün değiştirin. </li><li> Olgunlaşması ortam içinde 2 gün sonra, son olgunlaşması adım paralel bir karşılaştırma için, birkaç farklı koşullar kullanılarak gerçekleştirilir. (I) kontrol olarak endotelial hücreleri olmaksızın, sadece eş-kültür ortamı kullanılarak ve (iii) RHMVEC hücrelerle temas co-kültürü ile çentik inhibitörü DAPT (ii) kullanılarak: farklılaşma aşağıdaki koşullar altında endüklenmiştir. Hücreler medya her gün değiştirin ile (Gün 10 Gün 17) bir hafta boyunca DAPT ya da ko-kültür ortamı da sağlandı. <ol><li> DAPT ortam 30 uM DAPT ile olgunlaşması ortam ilave kullanılarak hazırlandı. Bu grup hücreler 6 gün (Gün 11 Gün 17) için ilk 24 saat MCDB131 tamamlamak maruz kalan ve daha sonra DAPT medya maruz bırakıldı. </li><li> Co-kültür ortamı ile MCDB-131 ortam ilave hazırlandı B27,% 0.2 BSA, 10 mM Nikotinamid, 10 ng / ml EGF, 1 ug / ml hidrokortizon, 10 mg EndoGro, 90 ug / ml heparin. Medya kontrol koşulu için ayırt hücreleri maruz bırakıldımedya 6 gün (Gün 11 Gün 17) (hayır endotel hücreleri) için ko-kültür ortamı olarak değiştirildi sonra 24 saat boyunca MCDB-131 tam orta (Gün 10 Gün 11). </li><li> Kontakt co-kültürü durum için, bir milyon RHMVEC bağlanma izin vermek için 24 saat için tam MCDB-131 ortam içinde ayırt hücreleri (VEC teknolojiler) (Günlük 10 Günlük 11) ilave edildi. 24 saat medya medya ile 6 gün (Gün 11 Gün 17) için ko-kültür medya çevrildikten sonra her gün değiştirin. </li></ol></li></ol> 5.. QRT-PCR analizi <ol><li> Farklılaşma her aşamasında (; pankreas progenitör; endoderm olgun adacık) sonunda eridi edildi ve RNA üreticinin talimatlarına göre NucleoSpin II RNA ekstraksiyon kiti kullanılarak ekstrakte edildi. </li><li> RNA kalitesi SmartSpec Plus, spektrofotometre kullanılarak RNA ölçümü takiben, 260 nm ve 280 nm RNA absorbans kontrol ederek analiz edildi. </li><li> Ters transkripsiyon ImProm II ters transkripsiyon k kullanılarak gerçekleştirildiBu üreticinin talimatlarına göre. Bütün reaksiyonlar RNA 100 ng ile yapıldı. </li><li> QRT-PCR üreticinin talimatlarına göre Mx3005P qPCR sistemi (Agilent) ve Brilliant II SYBR Green qPCR ana karışımı kullanılarak gerçekleştirildi. Kullanılan primerler Tablo 1&#39;de verilmiştir. Başlatma adım 50 gerçekleştirildi 10 dakika boyunca 95 ° C&#39;de, ardından 2 dakika süreyle ° C. 50 amplifikasyon döngüsü şu şekilde yapıldı: 95 ° C de 30 saniye, 54 ° ve 30 saniye 1 dakika boyunca 72 ° C&#39;de. </li><li> Andiferansiye hücreleri üzerinde hedef mRNA ekspresyonu kat değişimi aşağıdaki formül kullanılarak CT değerleri hesaplandı: ΔCT (Marker i) = CT (Marker i) - CT (GAPDH) Δ ΔCT (Marker i) = ΔCT (Marker i) (Örnek) - ΔCT (Marker i) (Farklılaşmamış hücreleri) Bağıl ifade (Marker i) = 2-ΔΔCT(Işaretleyici i) </li></ol> 6. İmmünositokimya <ol><li> Farklılaşma her aşamasında (; pankreas progenitör; endoderm olgun adacık) sonunda hücreler oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 formaldehit tespit edildi. </li><li> Sabit hücreleri Triton X-100 (TX) 15 dakika boyunca% 0.25 ile permeabilize edildi. </li><li> Spesifik olmayan boyama 30 dakika boyunca TX% 0.05 &#39;in% 10 eşek serum inkübasyonu ile bloke edildi. </li><li> Primer antikor inkübasyon 4 &#39;de bir gece gerçekleştirildi tavsiye edilen seyreltme antikoru (bakınız Tablo 1) de tampon engelleme ° C. </li><li> Hücreler 5 dakika boyunca% 0.05 TX üç kez yıkandı. </li><li> Sekonder antikor inkübasyon tampon bloke edici ile sulandırılmış uygun bir antikor ile birlikte karanlık oda sıcaklığında bir saat süreyle gerçekleştirildi. </li><li> Hücreler 5 dakika boyunca% 0.05 TX üç kez yıkandı. </li><li> Nükleer boyanma PBS içinde 1:1000 dilusyonda leke Hoescht ile inkübasyon yapıldıPBS ile 3 yıkama izledi 5 dakika için. </li><li> Sabit ve boyanan hücrelerin Olympus IX81 inverted mikroskop ve Metamorph görüntüleme yazılımı kullanılarak görüntülendi. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar DE belirteçler Sox17, CXCR4 ve Foxa2 için QRT-PCR analizi ile teyit ve Şekil 2 &#39;de gösterildiği gibi Sox17 için İmmünoboyama olarak aktivin ilavesiyle A ve 4 gün boyunca andiferansiye hESC üzere Wortmannin kesin endoderm indüklemektedir. Cyclopamine ve retinoik asit ilave edildikten sonra pankreas progenitör hücrelerine farklılaşmasını pankreas progenitör belirteçler, Şekil 3 &#39;de gösterildiği gibi Pdx1 için İmmünoboyama QRT-PCR ile teyit edilmiştir. Farklılaşma son aşamada, güçlü hESC edilen pankreas progenitör hücrelerin insülin ifade upregülasyonu indüklenen RHMVEC hücreleri ile ko-kültür başvurun. Co-kültürü aracılı farklılaşma verim co ile analiz edildiDAPT kullanarak kontrol koşulu ile mparing. O anda pankreas olgunlaşması elde etmek için en yaygın olarak kullanılan yöntemlerin biri olduğu DAPT, bir pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Co-endotel hücreleri kültürünün destekleyici faktörleri ile desteklenmiş değiştirilmiş bir ortam içinde gerçekleştirildi beri, ek kontrol farklılaşması üzerinde ortam etkisinin doğrulanması için endotel hücrelerinin yokluğunda ortam ile gerçekleştirildi. Bu analizin ayrıntıları Şekil 4 &#39;de verilmiştir. <img alt="Şekil 1.." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig1.jpg" /> Şekil 1. Insülin salgılayan hücre içine hESC ayrımında Çok aşamalı protokolü. <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig2.jpg" /> Şekil 2. Insan embriyonik kök hücrelerin Definitive endoderm indüksiyon. A ve Wortmannin 4 gün boyunca aktivin maruz hESC hücrelerinde temsil DE belirteçlerinin A) QRT-PCR analizi. Sonuçlar ar<html> e farklılaşmamış hESC göre normalize. B) Sox17 boyama (Yeşil) ve DAPI (mavi) Sox17 nükleer ifade göstermektedir. Ölçek çubuğu: 50 mikron. <img alt="Şekil 3." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig3.jpg" /> Endoderm hücreleri elde edilen embriyonik kök hücre Şekil 3. Pankreas progenitör indüksiyon. DE indüksiyon sonrası 4 gün cyclopamine ve retinoik asit maruz hESC türetilmiş endoderm hücreleri erken pankreas belirteçlerin A) QRT-PCR analizi. Sonuçlar farklılaşmamış hESC göre normalize. B) Pdx1 boyama (mor) ve DAPI (mavi) Pdx1 nükleer ifade göstermektedir. Ölçek çubuğu: 50 mikron. &quot;&gt; <img alt="Şekil 4." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig4.jpg" /> Şekil 4. Pankreas olgunlaşma evresi A) QRT-PCR hESC pankreatik hormon analizi DAPT kullanarak pankreas olgunlaşma sonrasında, ortak kültür ve ortak kültür ortamı (kontrol) başvurun. Sonuçlar farklılaşmamış hESC göre normalize. p öğrenci t-testi ile elde edilen değerler. Dil-Ac-LDL etiketli RHMVEC (Kırmızı) ile B) Co-kültür boş alanlar (üst) varsa EC plaka takmak bölgeleri göstermek, diğer RHMVEC ayırt ESC (alt) ile doğrudan temas halinde bulunabilir. Ko-kültür yöntemi ile farklılaşmış hücreler için C) C-peptid (Yeşil) boyama. Ölçek çubuğu: 12.5 mikron (Üst) ve 50 mikron (Alt) D) RHMVEC ve İmmun Boyamanın RHMVEC hiç insülin ifade gösterir. <table border="1"><tbody><tr><td> Işaretleyici </td><td> Primer1 (5 &#39;den 3&#39;) &lt;/ Td&gt; <td> Primer2 (5 &#39;den 3&#39;) </td><td> Ref </td></tr><tr><td> SOX17 </td><td> CTCTGCCTCCTCCACGAA </td><td> CAGAATCCAGACCTGCACAA </td><td> 12 </td></tr><tr><td> CXCR4 </td><td> CACCGCATCTGGAGAACCA </td><td> GCCCATTTCCTCGGTGTAGTT </td><td> 4 </td></tr><tr><td> FOXA2 </td><td> GGAGCGGTGAAGATGGAA </td><td> TACGTGTTCATGCCGTTCAT </td><td> 12 </td></tr><tr><td> PDX1 </td><td> AAGTCTACCAAAGCTCACGCG </td><td> GTAGGCGCCGCCTGC </td><td> 4 </td></tr><tr><td> PTF1 </td><td> CATAGAGAACGAAACCACCCTTTGAG </td><td> GCACGGAGTTTCCTGGACAGAGTTC </td><td> 12 </td></tr><tr><td> HLXB9 </td><td> CACCGCGGGCATGATC </td><td> ACTTCCCCAGGAGGTTCGA </td><td> 4 </td></tr><tr><td> HNF6 </td><td> TGTGGAAGTGGCTGCAGGA </td><td> TGTGAAGACCAACCTGGGCT </td><td> 5 </td></tr><tr><td> PAX6 </td><td> CGAATTCTGCAGGTGTCCAA </td><td> ACAGACCCCCTCGGACAGTAAT </td><td> 5 </td></tr><tr><td> NKX6.1 </td><td> AGACCCACTTTTTCCGGACA </td><td> CCAACGAATAGGCCAAACGA </td><td> 5 </td></tr><tr><td> ISL1 </td><td> GATCTATGTCACCTCGCAAGG </td><td> TACAACCACCATTTCACTG </td><td> 12 </td></tr><tr><td> Glukagon </td><td> AGGCAGACCCACTCAGTGA </td><td> AACAATGGCGACCTCTTCTG </td><td> 4 </td></tr><tr><td> İNSÜLİN </td><td> AAGAGGCCATCAAGCAGATCA </td><td> CAGGAGGCGCATCCACA </td><td> 12 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Primerler qPCR reaksiyonlar için kullanılır.

<ol><li>De Vos, J., Assou, S., Tondeur, S., Dijon, M., Hamamah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Les+cellules+souches+embryonnaires+humaines+%3A+de+la+transgression+de+l%27embryon+humain+%C3%A1+la+m%C3%A9decine+r%C3%A9g%C3%A9n%C3%A9ratrice+de+demain%5BTitle%5D)+AND+%22Gyn%C3%A9cologie+Obst%C3%A9trique+%26+Fertilit%C3%A9%22%5BJournal%5D)">Les cellules souches embryonnaires humaines : de la transgression de l'embryon humain á la médecine régénératrice de demain.</a> Gynécologie Obstétrique & Fertilité. 37, 620-626 (2009).</li>
<li>Murtaugh, L. C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes%2C+Signals%2C+and+Lineages+in+Pancreas+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genes, Signals, and Lineages in Pancreas Development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).</li>
<li>Kubo, A., Shinozaki, K., Shannon, J. M., Kouskoff, V., Kennedy, M., Woo, S., Fehling, H. J., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+definitive+endoderm+from+embryonic+stem+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture.</a> Development. 131, 1651-1662 (2004).</li>
<li>D'Amour, K. A., Bang, A. G., Eliazer, S., Kelly, O. G., Agulnick, A. D., Smart, N. G., Moorman, M. A., Kroon, E., Carpenter, M. K., Baetge, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotech. 24, 1392-1401 (2006).</li>
<li>Zhang, D., Jiang, W., Liu, M., Sui, X., Yin, X., Chen, S., Shi, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+differentiation+of+human+ES+cells+and+iPS+cells+into+mature+pancreatic+insulin-producing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells.</a> Cell Res. 19, 429-438 (2009).</li>
<li>Basma, H., Soto-Gutiérrez, A., Yannam, G. R., Liu, L., Ito, R., Yamamoto, T., Ellis, E., Carson, S. D., Sato, S., Chen, Y., Muirhead, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+Transplantation+of+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Hepatocytes.</a> Gastroenterology. 136, 990-999 (2009).</li>
<li>Phillips, B. W., Hentze, H., Rust, W. L., Chen, Q. -P., Chipperfield, H., Tan, E. -K., Abraham, S., Sadasivam, A., Soong, P. L., Wang, S. T., Lim, R., Sun, W., Colman, A., Dunn, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+into+the+Pancreatic+Endocrine+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Directed Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into the Pancreatic Endocrine Lineage.</a> Stem Cells and Development. 16, 561-578 (2007).</li>
<li>Kim, S. K., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+development+is+promoted+by+cyclopamine%2C+a+Hedgehog+signaling+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pancreas development is promoted by cyclopamine, a Hedgehog signaling inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 13036-13041 (1998).</li>
<li>Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+development+of+the+islets+of+Langerhans%3A+implications+for+the+treatment+of+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Growth and development of the islets of Langerhans: implications for the treatment of diabetes mellitus.</a> Current Opinion in Pharmacology. 1, 641-649 (2001).</li>
<li>Nikolova, G., Jabs, N., Konstantinova, I., Domogatskaya, A., Tryggvason, K., Sorokin, L., Fässler, R., Gu, G., Gerber, H. -P., Ferrara, N., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vascular+Basement+Membrane%3A+A+Niche+for+Insulin+Gene+Expression+and+%5Bbeta%5D%3E+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The Vascular Basement Membrane: A Niche for Insulin Gene Expression and [beta]> Cell Proliferation.</a> Developmental Cell. 10, 397-405 (2006).</li>
<li>Yoshitomi, H., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+interactions+initiate+dorsal+pancreas+development+by+selectively+inducing+the+transcription+factor+Ptf1a%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell interactions initiate dorsal pancreas development by selectively inducing the transcription factor Ptf1a.</a> Development. 131, 807-817 (2004).</li>
<li>Osafune, K., Caron, L., Borowiak, M., Martinez, R. J., Fitz-Gerald, C. S., Sato, Y., Cowan, C. A., Chien, K. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+differences+in+differentiation+propensity+among+human+embryonic+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines.</a> Nat. Biotech. 26, 313-315 (2008).</li>
<li>Banerjee, I., Sharma, N., Yarmush, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+co-culture+on+pancreatic+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Impact of co-culture on pancreatic differentiation of embryonic stem cells.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 5, 313-323 (2010).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Pankreas gelişimi sırasında, ayırt pankreas hücreleri aortadan endotel hücreleri ile birbirine yakın olduğu, ayrıca, pankreas adacık kan şekeri ve adacık hormonların hızlı değişimi teşvik etmek yoğun vaskülarize vardır. Bu gerçekler göz önüne alındığında, endotel hücreleri pankreas organogenez sürecinde önemli bir rol oynaması şaşırtıcı değil. Pankreas geliştirme sırasında endotel hücreleri önemi giderek takdir edilirken, embriyonik hücreler in vitro ayrımında rolünü daha az araştırılmıştır. Daha önceki yazımız...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Konsantrasyonları </td></tr><tr><td> mTeSR1 (ek ile) </td><td> Kök Hücre Teknolojileri </td><td> 5850 </td><td></td></tr><tr><td> hESC nitelikli matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354277 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11330-032 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB-131 </td><td> Invitrogen </td><td> 10372019 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB-131 (Tamamlandı) </td><td> VEC Teknolojileri </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> B27 Supplement </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td><td></td></tr><tr><td> Bir aktivin </td><td> Ar-Ge </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/338-ac.pdf">338-AC</a> </td><td> 100ng/ml </td></tr><tr><td> Wortmannin </td><td> Invitrogen </td><td> W3144 </td><td> 1 mikrona </td></tr><tr><td> KAAD-Cyclopamie </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4116 </td><td> 0.2μM </td></tr><tr><td> All-trans retinoik asit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R2625 </td><td> 2μM </td></tr><tr><td> DAPT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5942 </td><td> 30μM </td></tr><tr><td> Nikotinamid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N0636 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Sodyum selenit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td><td> 30 nM </td></tr><tr><td> Ensülin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I1882 </td><td> 25 ug / ml </td></tr><tr><td> Transferrin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8158 </td><td> 50 mcg / ml </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Ar-Ge </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/236-eg.pdf">236-EG</a> </td><td> 10 ng </td></tr><tr><td> EndoGro </td><td> VEC Teknolojileri </td><td> ENDOGRO </td><td> 10mg </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 90μg/ml </td></tr><tr><td> Hidrokortizon </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H0888 </td><td> 1μg/ml </td></tr><tr><td> NucleoSpin RNA II </td><td> Macherey Nagel </td><td> 740955 </td><td></td></tr><tr><td> ImProm II ters transkripsiyon Sistemi </td><td> Promega </td><td> A3800 </td><td></td></tr><tr><td> Brilliant II SYBR Green qPCR master miks </td><td> Straragene </td><td> 600548 </td><td></td></tr><tr><td> Sox17 keçi poliklonal IgG </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-17.355 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> PDX1 keçi poliklonal IgG </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-14662 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> Poliklonal C-Peptid Tavşan </td><td> Hücre Sinyali </td><td> 4593 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 eşek anti-tavşan IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-21206 </td><td> 1/1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 eşek anti-keçi IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-21447 </td><td> 1/1000 </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Reaktifler ve Setleri.

İnsan embriyonik endotel hücre co-kültür aracılık olgunlaşma bir yönetmen farklılaşma yaklaşım pankreas insülin üreten hücreler için kök hücre

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Embriyonik kök hücreler (ESC) iki ana özellikleri: onlar sonsuza kadar böylece birden fazla soy içine ayırt etmek için potansiyeli olan, farklılaşmadan in vitro koşullarda yayılır ve pluripotenttir olabilir. Bu özellikleri hücre temelli tedavi ve rejeneratif tedavi uygulamaları 1 için EKH son derece cazip kılmaktadır. Ancak gerçekleştireceği tam potansiyelini için hücreleri zor bir görev olduğunu olgun ve işlevsel fenotipleri, ayrılabilir gerekir. Hücresel farklılaşmadan indükleyecek şekilde umut verici bir yaklaşım yakından in vitro ortamda organogenezisin yolu taklit etmektir. Pankreas gelişimi karaciğer ve pankreas gibi çeşitli organlar, dönüşebilir endoderm ile başlayan, belli aşamalarına 2 oluştuğu bilinmektedir. Endoderm indüksiyon çeşitli büyüme faktörleri 4-7 ile kombinasyon halinde bir 3 aktivin ilavesi yoluyla nodal yolunun modülasyonu ile elde edilebilir </&gt; sup. Kesin endoderm hücreleri daha sonra cyclopamine 8 ilavesi ile in vitro olarak elde edilebilir sonik kirpi inhibisyonu, inhibe ederek pankreas kararlılığını geçirilir. Pankreas olgunlaşma çentik sinyal inhibisyonu gibi çeşitli paralel etkinlikler aracılığıyla olur; pankreas progenitörlerin agregasyon 3 boyutlu kümeler halinde; vaskülarizasyonu indüksiyon; birkaç isim. En başarılı ESC türetilmiş pankreas progenitör hücrelerin in vitro maturasyonu By DAPT takviyesi 9 ile sinyalizasyon çentik inhibisyonu yoluyla elde edilmiştir. Başarılı olsa da, sınırlı işlevsellik ile olgun fenotip düşük verim elde edilmektedir. Daha az çalışma alanı giderek in-vivo pankreas adacık olgunlaşma 10,11 önemli bir faktör olarak takdir ediliyor pankreas olgunlaşmasında sinyal endotel hücre, etkisidir. Çalışmada endotel tür etkilerini araştıranial adacık hücresi benzeri hücreler üreten insülin içine insan ESC türetilmiş pankreas progenitör hücrelerinin olgunlaşmasında sinyalizasyon. Biz insan EKH ilk PI3K yolun inhibisyonu ile birlikte bir aktivin tarafından endoderm doğru indüklenirler çok aşamalı yönettiği farklılaşma protokolü sunduk. Endoderm hücrelerinin pankreas spesifikasyonu retinoik asidin eklenmesiyle retinoid indüksiyon ile birlikte Cyclopamine tarafından sonik kirpi sinyalleşme inhibisyonu ile elde edilir. Olgunlaşmanın son aşamasında bir ko-kültür yapılandırma elde endotel hücre sinyal sayesinde meydana gelir. Birkaç endotel hücreleri ko-kültür olarak test edilirken, burada öncelikle analiz kolaylığı için, sıçan kalp mikrovasküler endotel hücreleri (RHMVEC) ile verileri sunmak.

Çalışmada insan embriyonik kök hücreleri pankreas farklılaşma uyarması yönlendirilmiş bir farklılaşma yaklaşım anlatılmaktadır. Büyük önem insülin salgılayan hücrelerin içine pankreas ataları edilen insan embriyonik kök hücre bulma olduğu endotel hücre ko-kültür aracılık olgunlasmasi.

İnsan Embriyonik endotel hücre Co-kültür aracılık Olgunlaşma Bir Yönetmen Farklılaşma Yaklaşım Pankreas insülin üreten hücreler için Kök Hücre

Embriyonik kök hücrelerin (EKH) iki temel özelliği vardır: in vitro ortamda farklılaşmamış halde sınırsız bir şekilde çoğaltılabilirler ve...

Bu protokol, önceden geliştirilen protokollere göre daha yüksek verimle insülin üreten hücreler elde etmek için etkili bir yaklaşım olan insan embriyonik kök hücrelerinin çok aşamalı farklılaşmasını sunmaktadır; öncelikle aktif in a ve PI three K inhibitörü ile definitif endoderm indüklenir. Ardından, pankreatik progenitör indüksiyonunu teşvik etmek için hücreler topamine A ve retinoik asite maruz bırakılır. Sonrasında, pankreatik progenitörlerin insülin eksprese eden hücrelere olgunlaşmasını sağlamak için endotel hücrelerle ko-kültür yapılır.C-peptid ekspresyonunu ve insülin artışını (upregulation) göstermek için immünofloresan mikroskopi ve QPCR ile fonksiyonel analizlere geçiniz. Bu tekniğin, mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bu yöntemin hem daha yüksek insülin artışı sağlaması hem de ekspresyon yapan hücre kültüründen daha yüksek cpep verimi elde edilmesidir. İnsan embriyonik kök hücre kolonilerini, çapları 1 ile 1,5 milimetre arasında olacak büyüklüğe kadar kültüre ediniz ve hücreleri CO 12'ye aktarınız.Bu sırada, kuyuk başına 1 mL D-M-E-M-F 12 Medyum ile seyreltilmiş HESC matrigel içeren kuyucuklu plaka hazırlayın; ardından HSC'lerden medyumun aspirasyonunu gerçekleştirin ve mTR-1 ile değiştirin. Sonrasında hücreleri sıyırma yöntemiyle hasat edin. Hücreleri 15 mL'lik konik tüpe aktarıp taze mTR-1 ekleyin ve ardından 12 kuyucuklu plakanın önceden matrigel ile kaplanmış kuyucuklarına 1:4 bölme oranıyla ekim yapın.Propagasyon aşamasındaki hücreler 1 ila 1,5 mm çapına ulaştığında, aktif A ve PI3K inhibitörü içeren definit endoderm indüksiyon ortamı eklenerek diferansiyasyon başlatılır. Kültür dört gün boyunca sürdürülür.Besiyerini her gün yenileyiniz. Öncelikle 0,2 micromolar KAAD, cycl dopamine içeren tam D-M-E-M-F 12 içerisinde 24 saat boyunca kültüre ederek pankreatik progenitor indüksiyonuna geçiniz. Ardından, besiyerini 0,2 micromolar KAAD Cycl dopamine ve iki micromolar all trans retinoic acid içeren tam D-M-E-M-F 12 ile değiştiriniz ve besiyerini her gün yenileyerek üç gün boyunca inkübe ediniz.Bölme işleminden önce, notch inhibitörü DAPT ile ESC kaynaklı pankreatik progenitor hücrelerin in vivo olgunlaşması için pozitif kontrol olarak, hücreleri final olgunlaştırma adımından önceki iki gün boyunca olgunlaştırma medyasında tutun. Endotel hücrelerini mikroskop altında inceleyin, ardından kontakt ko-kültür koşulu için hücreleri tripsinize edin ve sayın. Diferansiyasyon aşamasındaki hücrelere, komple MCDB 1 31 medyası içinde 1 milyon sıçan kalp mikrovasküler endotel hücresi ekleyin.Ayrıca, yalnızca endotel hücrelerimizin bulunduğu ko-kültür ortamından oluşan bir kontrol kültürü hazırlayın. Tüm işlem koşullarını, ortam değişimi yaparak altı gün boyunca bir inkübatörde bekletin. Diferansiyasyon sürecinin her aşamasının sonunda günlük olarak örnek hücreler toplayın.Endo dam, pankreatik progenitör ve olgun adacık ekstrakt RNA'larını, üretici talimatlarına uygun olarak nucleus spin E-R-R-N-A ekstraksiyon kiti kullanarak izole edin. Bir smart spec plus spektrofotometre ve kuvars küvet kullanarak, 260 nanometreye karşı 280 nanometre absorbsiyans oranı ile RNA kalitesini belirleyin. Ayrıca, örnek başına 100 nanogram RNA şablonu olacak şekilde örnek konsantrasyonlarını hesaplayın.Impromptu ters transkripsiyon kiti kullanarak RT reaksiyonlarını gerçekleştirin. Gösterilen primerleri kullanarak QPCR kurulumunu yapın, reaksiyonları termosikletöre yükleyin ve QPCR programını çalıştırın. Ardından, CT değerlerini kullanarak diferansiyasyonun her aşamasının sonunda, hedef mRNA ekspresyonunun diferansiye olmamış hücrelere göre kat değişimini hesaplayın.Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 formaldehit ile fikse edin. Ardından, spesifik olmayan boyanmayı engellemek için 0,25% Triton X 100 ile 10 dakika boyunca permeabilize edin. %0,05 TX içinde %10 eşek serumunu 30 dakika boyunca ekleyin.Ardından, bloklama tamponu içindeki primer antikoru ekleyin ve dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Örnekleri %0,05 Triton X ile beş dakika boyunca yıkayın. Daha sonra, bloklama tamponunda seyreltilmiş sekonder antikoru ekleyin ve oda sıcaklığında, karanlıkta bir saat boyunca inkübe edin.Çekirdekleri sabitlemek için %0.05'lik x ile üç kez beşer dakikalık yıkama yapın; ardından 1/1000 dilüsyonundaki horse stain çözeltisini PBS içinde hazırlayıp beş dakika inkübe edin ve PBS ile üç kez yıkayın. Sabitlenmiş ve boyanmış hücrelerin görüntülerini, ters mikroskop ve görüntüleme yazılımı kullanarak elde edin.Farklılaşmamış insan embriyonik kök hücrelerine dört gün boyunca aktivin A ve wart manin eklenmesi, definit endoderm oluşumunu uyarır. Q-R-T-P-C-R analizi, beklenen definit endoderm markerları olan SOX 17, CXCR 4 ve Fox A 2'nin varlığını doğrulamıştır.Yeşil renkteki SOX 17 immün boyaması, burada mavi DPI ile boyanmış çekirdek ile kolokalizasyon göstermektedir. Siklo, amin ve retinoik asit eklenmesi sonrası pankreatik progenitör hücrelere farklılaşma, pankreatik progenitör belirteçlerinin Q-R-T-P-C-R analizi ve ayrıca PDX 1 immün boyaması ile doğrulanmıştır. Farklılaşmanın son aşamasında, sıçan kalp mikrovasküler endotel hücreleri ile temaslı ko-kültür, HESC kaynaklı pankreatik progenitör hücrelerde insülin ekspresyonunun güçlü bir şekilde yukarı regülasyonunu tetiklemiştir.AC LDL ile işaretlenmiş RHM VEC ile birlikte kültürlenen L ko-kültürleri, ECS'nin plakaya yapıştığı bölgeleri göstermektedir. Boş alanlar mevcut olduğunda, beklendiği üzere diğer RHM VEC'lerin farklılaşan ESC ile doğrudan temas halinde olduğu görülebilir. RHM VEC'lerin immün boyaması, tespit edilebilir bir insülin ekspresyonu olmadığını göstermektedir.Eptide boyaması, ko-kültür yönteminin geliştirilmesinden sonra bu yöntemle farklılaştırılan hücreler için aynı zamanda yararlı bir belirteçtir. Bu teknik, olgun fenotipin işlevselliğini belirgin şekilde artıran kök hücre farklılaşma sürecindeki hücre-hücre etkileşimlerinin incelenmesine olanak sağlamıştır.

endothelial-cell-co-culture-mediates-maturation-human-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Izole etmek için bir protokol, insan fetal pankreas hücrelerden türetilen kültür ve görüntü adacık hücre kümeleri (SKK) tarif edilmektedir. Yöntem, doku kültür mono-tabaka olarak veya agrega olarak süspansiyon halinde ve proliferasyon belirteçler ve pankreatik hücre hayati kararlar için resimdeki ÜAK'lerin oluşturmak için gerekli adımları göstermektedir.

İnsan Fetal Pankreas Hücre Kümeleri İzolasyon, Kültür ve Görüntüleme

Bu protokol açıklanan üç boyutlu kültür yöntemi dallı bir organ haline onların önemli genişleme, farklılaşma ve morfojenezinin dahil dağınık embriyonik fare pankreas atalarıdır, gelen pankreas gelişimini özetlediği. Bu yöntem, görüntüleme, niş fonksiyonel müdahale ve manipülasyon için uygun değildir.

Dağınık Fare Embriyonik progenitörlerin gelen Vitro Pankreas organogeneziste

Burada in vitro NKX6-1 + pankreas atalarıdır insan embriyonik kök hücreleri ayırt etmek için 4 aşamalı bir protokol açıklar. Bu protokol, insan pluripotent kök hücre hatları çeşitli uygulanabilir.

Pluripotent Verimli Farklılaşma NKX6-1 için Kök Hücreler<sup&gt; +</sup&gt; Pankreas Progenitörler

Protokoller iCRISPR platformu kullanılarak hPSC mutan çizgileri oluşturmak için ve tarif edilen glukoz duyarlı β-benzeri hücrelere hPSCs ayırt etmek. hPSC yönettiği farklılaşma ile genom düzenleme teknolojisini birleştirerek insan gelişimi ve hastalık seyrinde soy belirleyicilerinin rolü sistematik analizi için güçlü bir platform sunmaktadır.

İnsan Pankreas Geliştirme Lineage Belirleyicileri sorgulanması için Genom Düzenleme ve hPSCs arasında Yönetmen Farklılaşma

Bu protokol, insan diş pulpası kök hücrelerini (hDC'ler) pankreas soylarına in vitroolarak ayırt etmek için iki farklı indüksiyon protokolü arasında bir karşılaştırma sunar: bütünleştirici protokol ve bütünleştirici olmayan protokol. Bütünleştirici protokol daha fazla insülin üreten hücre (IPC) üretir.

Tüp bebek pankreas soylarına doğru İnsan Diş Pulpası Kök Hücrelerinin İndüksiyonu

Mevcut protokol, düzlemsel tek katmanlı insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) türetilen pankreas progenitörlerinde PDX1 ve NKX6.1 transkripsiyon faktörlerinin birlikte ekspresyonunu arttırmak için geliştirilmiş bir yöntemi açıklamaktadır. Bu, taze matrisin yenilenmesi, hücre yoğunluğunun manipüle edilmesi ve endodermal hücrelerin ayrışmasıyla elde edilir.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinin 2D Kültür Sisteminde Pankreatik Beta Hücre Öncüllerine Farklılaşması

Kök hücrelerin adacık hücrelerine farklılaşması, geleneksel diyabet tedavisine ve hastalık modellemesine alternatif bir çözüm sunar. Bir tabakta insülin salgılayan, kök hücreden türetilen adacıkların üretilmesine yardımcı olmak için ticari bir farklılaşma kitini önceden onaylanmış bir yöntemle birleştiren ayrıntılı bir kök hücre kültürü protokolünü açıklıyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinin İnsülin Üreten Adacık Kümelerine Farklılaşması

Bu makale, β hücreli benzeri hücrelerin yönlendirilmiş farklılaşması ve fonksiyonel analizi için bir protokol sunmaktadır. İnsülin üreten pankreas hücreleri oluşturmadan önce insan pluripotent kök hücreleri için optimal kültür koşullarını ve pasajlarını tanımladık. Altı aşamalı farklılaşma, kesin endoderm oluşumundan, glikoza yanıt olarak insülin salgılayan fonksiyonel β hücreli hücrelere doğru ilerler.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Fonksiyonel Pankreas İnsülin Salgılayan Hücreler Üretmek için Optimize Edilmiş Protokol

İnsan kök hücresinden türetilen pankreas kök hücresi adacıklarının immunodefisive farelere in vivo implantasyon ve sonraki analizler için kas içi nakli için minimal invaziv bir protokol sunuyoruz.

Farelerde İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilen Pankreas Endokrin Hücrelerinin Intramusküler Nakli

Bu video laboratuarımızda rutin tripsin tonlar insan embriyonik kök hücre hatları geçişleri nasıl göstermektedir.

Tripsin ile Pasajlanması tonlar İnsan Embriyonik Kök Hücre hatları

Öğrenin, insüler üreten hücreler elde etmek için endotel hücre ortak kültürüyle çok aşamalı pankreas farklılaşması protokolü. Bu yöntem, insülin ekspresyonunda yüksek verim ve olgunlaşma sağlar.

İnsan Embriyonik endotel hücre Co-kültür aracılık Olgunlaşma Bir Yönetmen Farklılaşma Yaklaşım Pankreas insülin üreten hücreler için Kök Hücre (Video) | JoVE Journal

İnsan Embriyonik endotel hücre Co-kültür aracılık Olgunlaşma Bir Yönetmen Farklılaşma Yaklaşım Pankreas insülin üreten hücreler için Kök Hücre

Daha fazla video keşfet