Name: Üç boyutlu Karışık-hücre Sfero Co-kültürden Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Keşfedin üç boyutlu karışık-hücre sferoid ko-kültürlerden meme epitel hücrelerinin izolasyonunu. Bu yöntem, stromal fibroblastların epitel hücre biyolojisi üzerindeki etkilerini analiz etmek için kullanılır ve tümör mikroçevresi araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Üç boyutlu Co-kültür oluşturulması <ol><li> Co-kültürler kuran bir gün önce, bir gecede 4 ° C&#39;de buzdolabında buz üzerinde dondurucu ve çözülme gelen Matrigel çıkarın. </li><li> % 10 bovin serumu, 5 ug / mL insülin ile DME/F12 orta: deney gününde, kullanılmak üzere epitelyal hücreleri için orta (bu örnekte HMEC orta karşılık gelen ortak kültürü için orta hazırlanması , 1 ug / mL hidrokortizon ve 1 ng / mL EGF). Önceden Matrigel ile karıştırılarak buz en az 1 saat orta tutun. </li><li> Çözülmüş Matrigel sulandırmak için, Matrigel toplam istenilen miktar belirlemek: orta (300 uL başına da 24-iyi plakalar için) ve buz üzerinde steril bir tüpe buz HMEC orta yarısı bu birimde ekleyin. Daha sonra bir 1:1 seyreltme elde etmek için tüpüne çözülmüş Matrigel aynı yarı-toplam hacim ekleyin. Buz tüpü tutun. </li><li> Yeri 50 Matrigel arasında uL: 24-kuyulu plakanın belirlenmiş kuyuların orta-iyi orta karışımı venemli hava ve% 5 CO2 içeren bir 37 ° C inkübatöründe 10 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Kuyuları, orta ve başka bir karışımı 60 dakika süreyle inkübe edilir: Matrigel ilave bir 450 uL ekleyin. </li><li> Kuluçka sırasında, 0.5 x 10 arasında derişimde fibroblast (burada GFP ifade s-tert-ölümsüzleştirilmiş İndirgeme Meme fibroblastlar) ve epitel hücreleri (burada RFP ifade s-tert-ölümsüzleştirilmiş insan meme epitel hücre çizgisi) 1:1 lik bir süspansiyon hazırlamak 5 hücreleri HMEC orta 0.5 ml her. </li><li> 60 dakikalık inkübasyon adım sonra, yavaşça katılaşmış jel üstüne hücre süspansiyonu bırakın ve inkübatör kültür dönün. </li><li> 2 gün boyunca kültürlerin rahatsız etmeyin. Bundan sonra, orta nazikçe iyi ve yavaşça taze HMEC orta yerine bir taraftan orta aspire edilerek 2-3 gün her değiştirilebilir. </li><li> Mikroskobu altında günlük sfero oluşumu izleyin. Kültürler 10-14 gün sonra genellikle olgun. Görüntü olarakışık veya floresan mikroskobu kullanarak uygun. Sfero boyutunu ve projeksiyon uzunluk ışık mikroskobu ile ölçülebilir. </li></ol> 2. Co-kültürler Sfero gelen Hücre İzolasyonu <ol><li> Steril 2 ml&#39;lik cam pipet ile çok nazikçe, kültürünü Pipeti ve aşağı 10x. Alternatif olarak, kültür Pipeti için% 70 etanol içinde otoklav veya daldırma ile steril makas kullanırken, 1000 mikrolitre plastik pipet ucunu kesti. Cam pipet veya steril bir 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne kesme plastik pipet ucu ve oda sıcaklığında 2000 rpm&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj ile ya kültürü transfer edin. Hücresel sferoidler tortu altında olacak. </li><li> Yavaşça, santrifüj tüpünün üst kesintiye Matrigel kaldırmak için steril bir Pastör pipet kullanın. </li><li> Pelet sferoidler 1 ml HMEC orta ekle, yukarı ve aşağı pipetleme 2-3 kez steril 2 ml&#39;lik cam pipet ile, ve 24-iyi bir kuyuya kültürü aktarmakdoku kültürü plakası. </li><li> Sferoidler orta değişen önce en az 48 saat çanak eklemek için izin ver. Zamanla hücreler küresel yapılar terk edecek ve mono tabakaları gibi büyür. </li><li> Hücrelerinin% 50 izdiham ulaşmak Pasajı hücre kültürleri. İlk 100 mm çanak (yaklaşık 3-5 gün) sonra bir 35 mm çanak (yaklaşık 2-4 gün) kültür genişletin ve. Her geçiş adımı hemen önce, elle mümkün olduğunca çok sayıda kalıntı &quot;hayalet sferoidler&quot; olarak kaldırmak için steril bir Pastör pipet kullanın. </li><li> Floresans hücre sıralama gerekirse, uygun hücre yüzey belirteçleri ve daha fazla ayrı ayrı hücre popülasyonu kullanarak nüfus saflık için akım sitometri ile hücrelerin analiz edin. Istediğiniz gibi izole hücreler daha fazla analiz için şimdi hazır. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar Co-kültürler üç boyutlu sfero olarak, mühendislik Tiam1 susturulması ile fibroblastlar ma içine arttı işgali nedenmeme epitel hücreleri tarafından trix (Şekil 1, D karşılaştırmak, E, A, F, B, C). Ile fibroblast Tiam1 aşırı ekspresyonu meme kanseri hücre hattı SUM159 (Şekil 1, G, H, I J, K, L karşılaştırın) azalarak matris işgaline neden mühendislik. Şekil 2 de gösterildiği gibi bir kez co-kültüre sferoidler kurulmuş, hücresi grupları, iki boyutlu bir bağlamda yeniden kaplanması ile sferoidler izole edilebilir. Test edilen hücrelerin nispi büyüme oranları bağlı olarak, saf popülasyonlarının seri kanalı yoluyla ortaya çıkabilir (Şekil 3 içinde gösterildiği gibi) veya uygun bir hücre belirteçler kullanılarak sıralanabilir. Ko-kültür 3D izolasyon sonra, epitel hücreleri analiz için yeterli fırsat sağlayan, uzun süre üzerinde fibroblastlar ile ko-kültür öngördüğü özelliklerini korurlar. Bu örnekte, Tiam1 eksikliği fibroblastlar maruz hafta süreyle devam co-kültürlü HMECs artan göç indüklenen bir3D ko-kültür arası fter izolasyonu (Şekil 4). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3760/3760fig1.jpg" /> Şekil 1. Işık ve floresan mikroskobu altında ortak kültürlerin kurulan sfero Görüntüleme. Sfero kültürleri meme epitel ve fibroblast hücre hatları ile kurulan ve 10-14 gün boyunca kültür büyümeye izin verilir. AF: epitel = HMEC-mCherry hücreler. GL: epitel hücreleri = SUM159-mCherry hücreler. AC, GI: fibroblast = kontrolü RMF-GFP hücreler. DF: fibroblast = RMF-GFP Tiam1 susturulması ile. JL: fibroblast = RMF-GFP Tiam1 fazla ifade ile. Oklar matris içine işgalci epitel projeksiyonları göstermektedir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3760/3760fig2.jpg" /> Şekil 2. Matrigel kültürden izolasyonu sonra ışık ve floresan mikroskobu altında kültürlerin Seri görüntüleme. Gün 0 hemen sonra izole görüntüleme temsil eder; günde 1, 2 ve5 izolasyon gün sonra göstermektedir. Zamanla sfero artar bırakarak hücrelerin korona. Sonunda çok az sayıda hücre ile bir &quot;hayalet&quot; sfero (ok) kalır. Çok az sferoidler hayalet kaldırılması ve ilk geçişini sonra kalır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3760/3760fig3.jpg" /> Matrigel co-kültürden sonra izole hücrelerin Şekil 3. Akış sitometrisi analizi. Co-kültürler steoid olgunlaşmış sonra, hücreler pipetleme ile eş-kültürü 3D ve pasajlanmasını seri izole edilir. Örnek alikotları akım sitometri ile analiz edilir (tanımlamak için yeşil floresan ve kırmızı floresan kullanarak bu örnekte GFP-ifade sırasıyla fibroblast ve mCherry-salgılayan epitel hücreleri) epitel ve fibroblast hücrelerin göreceli nüfusu belirlemek için. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3760/3760fig4.jpg" /> Şekil 4. HMECs arasında Transwell göç isolati sonra devamMatrigel ko-kültür itibaren. Saf popülasyonlarının kültür veya floresans hücre ayırma ile elde edilmiş bir kez istenildiği gibi, hücreler analiz edilebilir. İşte HMECs ya kontrol (C) veya delikli transwells arasında Tiam1 eksikliği (SHT) fibroblastlar ile ortak kültür göçü ko-kültür izolasyonu sonrası 2, 4 ve 8. haftalarda değerlendirildi.

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hallmarks+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100, 57-70 (2000).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
<li>Kim, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+culture+models+in+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue culture models in cancer biology.</a> Semin. Cancer Biol. 15, 365-377 (2005).</li>
<li>Li, H., Fan, X., Houghton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment%3A+the+role+of+the+tumor+stroma+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment: the role of the tumor stroma in cancer.</a> J. Cell Biochem. 101, 805-815 (2007).</li>
<li>Tse, J. C., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+metastasis%3A+epithelial-to-mesenchymal+transition+and+contribution+of+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of metastasis: epithelial-to-mesenchymal transition and contribution of tumor microenvironment.</a> J. Cell Biochem. 101, 816-829 (2007).</li>
<li>Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+in+fibroblasts+modulates+the+oncogenic+potential+of+adjacent+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling in fibroblasts modulates the oncogenic potential of adjacent epithelia.</a> Science. 303, 848-851 (2004).</li>
<li>Bhowmick, N. A., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-stroma+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Tumor-stroma interactions.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 15, 97-101 (2005).</li>
<li>Havlickova, B., Biro, T., Mescalchin, A., Arenberger, P., Paus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+optimization+of+an+organotypic+assay+system+that+imitates+human+hair+follicle-like+epithelial-mesenchymal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Towards optimization of an organotypic assay system that imitates human hair follicle-like epithelial-mesenchymal interactions.</a> Br. J. Dermatol. 151, 753-765 (2004).</li>
<li>Kilani, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+cytotoxicity+of+gemcitabine+in+bladder+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Drugs%22%5BJournal%5D)">Selective cytotoxicity of gemcitabine in bladder cancer cell lines.</a> Anticancer Drugs. 13, 557-566 (2002).</li>
<li>Seidl, P., Huettinger, R., Knuechel, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fibroblast-tumor+cell+interaction+causes+downregulation+of+RACK1+mRNA+expression+in+breast+cancer+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fibroblast-tumor cell interaction causes downregulation of RACK1 mRNA expression in breast cancer cells in vitro.</a> Int. J. Cancer. 102, 129-136 (2002).</li>
<li>Silzle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+fibroblasts+recruit+blood+monocytes+into+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated fibroblasts recruit blood monocytes into tumor tissue.</a> Eur. J. Immunol. 33, 1311-1320 (2003).</li>
<li>Bartling, B., Demling, N., Silber, R. E., Simm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferative+stimulus+of+lung+fibroblasts+on+lung+cancer+cells+is+impaired+by+the+receptor+for+advanced+glycation+end-products%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proliferative stimulus of lung fibroblasts on lung cancer cells is impaired by the receptor for advanced glycation end-products.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 34, 83-91 (2006).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+fibroblasts+to+regulate+the+formation+of+three-dimensional+vessel-like+structures+from+endothelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290, C1385-C1398 (2006).</li>
<li>Liu, T., Lin, B., Qin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinoma-associated+fibroblasts+promoted+tumor+spheroid+invasion+on+a+microfluidic+3D+co-culture+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Carcinoma-associated fibroblasts promoted tumor spheroid invasion on a microfluidic 3D co-culture device.</a> Lab Chip. 10, 1671-1677 (2010).</li>
<li>Zengel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+therapy+for+synergic+inhibition+of+tumour+cell+invasion+and+tumour-induced+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multimodal therapy for synergic inhibition of tumour cell invasion and tumour-induced angiogenesis.</a> BMC Cancer. 10, 92-92 (2010).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A., Heyder, P., Schroeder, J., Knuechel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterologous+3-D+coculture+model+of+breast+tumor+cells+and+fibroblasts+to+study+tumor-associated+fibroblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A heterologous 3-D coculture model of breast tumor cells and fibroblasts to study tumor-associated fibroblast differentiation.</a> Exp. Cell Res. 266, 74-86 (2001).</li>
<li>Djordjevic, B., Lange, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+spheroids+maintained+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in spheroids maintained in suspension.</a> Acta Oncol. 45, 412-420 (2006).</li>
<li>Hirschhaeuser, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Hoevel, T., Macek, R., Swisshelm, K., Kubbies, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reexpression+of+the+TJ+protein+CLDN1+induces+apoptosis+in+breast+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Reexpression of the TJ protein CLDN1 induces apoptosis in breast tumor spheroids.</a> Int. J. Cancer. 108, 374-383 (2004).</li>
<li>Paduch, R., Kandefer-Szerszen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D%2C+tamoxifen+and+beta-estradiol+modulate+breast+cancer+cell+growth+and+interleukin-6+and+metalloproteinase-2+production+in+three-dimensional+co-cultures+of+tumor+cell+spheroids+with+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Biol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Vitamin D, tamoxifen and beta-estradiol modulate breast cancer cell growth and interleukin-6 and metalloproteinase-2 production in three-dimensional co-cultures of tumor cell spheroids with endothelium.</a> Cell. Biol. Toxicol. 21, 247-256 (2005).</li>
<li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods Mol. Med. 140, 141-151 (2007).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), e2720-e2720 (2011).</li>
<li>Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+fibroblast+Tiam1+in+tumor+cell+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The role of fibroblast Tiam1 in tumor cell invasion and metastasis.</a> Oncogene. 29, 6533-6542 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada anlatılan yöntem tümör hücreleri dahil olmak üzere, epitel hücreler, üzerine stromal fibroblastlann etkileri analiz için basit bir yaklaşım temsil eder. Daha fazla analiz için matristen hücrelerin kolaylıkla ekstraksiyon sağlarken Bu, hücre dışı bazal membran matris tarafından desteklenen bir üç-boyutlu bağlamında doğrudan hücre-hücre etkileşim için olanak sağlar. Bu fibroblast hatları tercih ve epiteliyal hatları Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, invaziv potansiyeli değişebilir ve sinyal yollar...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> BD Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356237 </td><td> Ücretsiz Fenol-kırmızı </td></tr><tr><td> Hyclone Klasik Sıvı Orta: DMEM F12 </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30023.01 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone Sığır Buzağı Serumu </td><td> ThermoScientific </td><td> SH3007303 </td><td></td></tr><tr><td> Ensülin </td><td> Merck Kimyasallar </td><td> 407709 </td><td> 0.005N HCI içinde çözülür; 0.22 uM filtresi </td></tr><tr><td> Hidrokortizon </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4001 </td><td> % 50 EtOH içinde çözünmesi; 0.22 um bir filtreden </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9644 </td><td> 10 mM asetik asit içinde çözülür; filtre 0.22 uM </td></tr></tbody></table>

Üç boyutlu karışık-hücre sfero co-kültürden meme epitel hücrelerinin İzolasyonu

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

Muazzam çabaları kolay hücre manipülasyonu için izin klasik iki boyutlu hücre kültür modelleri kullanılarak çok bu işin yapılmıştır normal ve malign hücre davranışları 1-2, yer sinyal yolları ve moleküller girmiş iken. Bu hücre içi sinyal yollarının boyutluluğu ve 3-4 hücre yüzey gerilimi gibi ekstraselüler güçleri tarafından etkilendiğini açıkça ortaya çıktı. Çoklu yaklaşımlar daha doğru biyolojik mimari doku 3 temsil ettiği üç boyutlu modeller geliştirmek için alınmıştır. Bu modeller çok boyutluluğu ve mimari gerilmeler dahil ederken, hücrelere sonuç etkileri çalışma modellerinin sınırlamaları ve sonraki analiz için hücre ayıklanması zorluk nedeniyle iki boyutlu doku kültürü daha az becerikli olduğunu. Tümörogenez ve tümör davranış tümörlerin yaklaşık mikroçevresinin önemli rol ilar giderek 4 tanınmış oldu. Tümör stromanın birden fazla hücre türleri ve hücre dışı moleküller oluşur. Tümör gelişimi sırasında tümör hücreleri ve stromal hücreleri 5 arasında çift yönlü sinyaller vardır. Tümör stromanın co-evrimi katılan bazı faktörler tespit edilmiş olmasına rağmen, sistematik olarak belirlemek ve bu sinyalleri 6 tam diziyi incelemek için basit bir teknik geliştirmek için hala gereksinim vardır. Fibroblastlar normal veya tümörle ilgili stromal dokularda en bol hücre tipi olup, birikimi ve bazal membran ve parakrin büyüme faktörleri 7 bakım katkıda bulunmaktadır. Birçok grup tümör tedavilere yanıt, bağışıklık hücrelerinin işe alma, sinyal molekülleri, proliferasyon, apoptoz, anjiyogenez ve işgali 8-15 gibi çeşitli hücresel fonksiyonları üzerinde fibroblast rolünü incelemek için üç boyutlu kültür sistemleri kullanılmıştır. Biz eşek için basit bir yöntem optimizekarışık hücre popülasyonlarının (co-kültür) 16-22 üç boyutlu kültür oluşturmak için piyasada bulunan hücre dışı matriks modeli kullanılarak meme epitel hücreleri üzerinde meme fibroblastların etkileri Essing. Devam ko-kültür ile hücrelerin iç fibroblastlar kümeleme ve büyük ölçüde parçacıklarının dış ve matriks içine çok hücreli çıkıntılar oluşturan epitel hücreleri ile sferoidler oluştururlar. Değişmiş epitel hücre invaziv yol açar fibroblastların Manipülasyon kolayca numaraları ve epitel projeksiyonları 23 uzunluğu değişiklikler ile belirlenebilir. Dahası, epitel davranışı üzerindeki fibroblast maruz etkileri analizi kolaylaştırır, üç boyutlu bir ko-kültür epitelyal hücreleri izole etmek için bir yöntem geliştirmişlerdir. Biz ortak kültürün etkileri birden fazla testleri gerçekleştirmek için yeterli zaman tanıyarak, epitel hücre izolasyonu haftalar sonra devam bulduk. Bu metod ile hücrelerin uyarlanabilirmalign potansiyeli değişen ve hiçbir özel ekipman gerektirir. Bu teknik birden koşullar altında in vitro hücre modellerinde hızlı değerlendirme için izin verir, ve karşılık gelen sonuçları in vivo hayvan doku modelleri yanı sıra, insan doku örneklerine göre olabilir.

Basit bir metodu ile ilişkili epitel hücreleri üzerindeki doku fibroblastlann etkileri analiz etmek için tarif edilmiştir. Bu yöntem, üç boyutlu bir doku kültürü kombinasyonu 3D izole sonra hücrelerin analizi kolaylaştırabilir. Tekniği tümör hücreleri üzerindeki tümör-stroma etkileri ile ilişkili sistematik çalışma izin veren, habis potansiyeli değişen hücreleri için de geçerlidir.

Üç boyutlu Karışık-hücre Sfero Co-kültürden Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Normal ve malign hücre davranışlarında yer alan sinyal yolaklarının ve moleküllerin tanımlanması için büyük çabalar sarfedilmiş olsa da1-2, bu çalışmaların çoğu...

Bu prosedürün genel amacı, stromal fibroblastların epitelyal hücre biyolojisi üzerindeki etkilerini analiz etmek amacıyla, üç boyutlu karışık hücreli doku kültürlerinden epitelyal hücreler elde etmektir. Bu işlem, öncelikle üç boyutlu karışık hücreli steroid ko-kültürlerinin oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, ko-kültür sonrası epitelyal hücreleri izole etmek için sferoitler matriks kültüründen ayrılır.Bir sonraki adım, ortak kültür sonrası epitel hücreleri analiz için hazır hale gelene kadar pasajlamaktır. Nihayetinde, üç boyutlu kültürde fibroblastlara maruz kalmanın epitel hücre davranışı üzerindeki etkileri, kültürlerin mikroskobik görüntülemesi ve ortak kültür sonrası analizlerle değerlendirilebilir. Burada gösterilen matris invazyonunun floresan görüntülemesi ve Transwell migrasyonu gibi epitel hücre analizleri gerçekleştirilecektir. Prosedürü, ortak kültürlerin kurulduğu günden bir gün sonra, laboratuvarımdan araştırma görevlisi Quinle gerçekleştireceğiz.Matrigel'i dondurucudan çıkarın ve bir gece boyunca dört derece Celsius'luk bir buzdolabında buz üzerinde çözdürün. Deney günü, kültür ortamını Matrigel ile karıştırmadan en az bir saat önce buz üzerine yerleştirin.

isolation-mammary-epithelial-cells-from-three-dimensional-mixed-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz 3D doku parçacıklarının ve potansiyel uygulama üreten hücre-hücre etkileşimleri farklılıkları ölçmek için basit ve hızlı bir yöntem açıklanmaktadır.

3D parçacıklarının Üretimi için Basit Asma Bırak Hücre Kültürü Protokolü

Insan meme cerrahi ıskarta malzeme işlemek için bir yöntem tarif edilmiştir. Organoids şeklinde işlenmiş doku, süresiz olarak dondurulmuş ya da uzun süreli büyüme için kültür içinde yerleştirilmiş saklanabilir. Bu yöntem deneysel normal insan epitel hücre biyolojisi incelenmesi ve eksojen pertürbasyonların etkileri sağlar.

Hücre Kültürü İnsan Azaltma Meme Cerrahisi ve Mastektomi Doku İşleme

İnsan meme epitelinin hormon etkisini incelemek için uygun bir 3D kültür modelini tanımlıyoruz.

İnsan Meme Bezi Epitelinin Bir Hormon duyarlı 3D Kültür Modeli

Bu yazıda, üç boyutlu (3D) tek tip diziler ekstraselüler matriks çevrili tanımlanan geometri epitel doku mühendisi yumuşak litografi tabanlı teknik anlatılmaktadır. Bu yöntem, hücre tipleri ve deneysel bağlamlarda çeşitli için uygun olan ve aynı çoğaltır yüksek verimli tarama sağlar.

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

Bu protokol, adherent / mezenkimal meme epitel hücrelerinden ekstraselüler veziküller (EV) / ekzozomların arıtılması, nicelendirilmesi ve karakterize edilmesine yönelik yöntemleri ve meme bezi oluşturma yeteneğini luminal meme epitel hücrelerine aktarmak için kullanmayı açıklamaktadır. Gövde benzeri meme epitel hücrelerinden türetilmiş EVs / eksozomlar, bu hücre özelliğini EV'leri / eksosomları emen hücrelere aktarabilir.

Membran Bazal Epitelyal Hücreler ile Membran Luminal Hücreler Arasındaki Meme Bezi Oluşturma Yeteneğinin Ekstraselüler Vesiküller / Ekzozomlar Yoluyla Transferi

İnsan primer prostat epitel hücreleri kullanarak, kök benzeri hücrelerin küresel tabanlı etiket tutma testi ile fonksiyonel karakterizasyonu için yeni bir biyomarker-free yöntemi ni rapor ediyoruz. BrdU, CFSE veya Far Red 2D hücre etiketlemesi için adım adım bir protokol tanımlanır; üç boyutlu küresel oluşum; immünositokimya ile etiket tutucu kök benzeri hücre tanımlama; ve FACS tarafından izolasyon.

3 Boyutlu Spheroid Kültürlerden Kök Benzeri Hücrelerin İzolasyon

Meme bezi, dış miyoepitelyal ve iç luminal epitel hücrelerinden oluşan çift katmanlı bir yapıdır. Sunulan diferansiyel trippsinizasyon kullanarak organoidler hazırlamak için bir protokoldür. Bu verimli yöntem araştırmacılar ayrı ayrı meme bezi formu ve fonksiyonu rollerini ile ilgili soruları keşfetmek için bu iki hücre türleri işlemek için izin verir.

Diferansiyel Tripsinizasyon a göre Mozaik Meme Organoidlerinin Üretimi

Meme epitel hücreleri ve endotel hücreleri arasındaki çapraz konuşma, meme kanserinin ilerlemesine, tümör büyümesine ve metastaz yapmasına önemli ölçüde katkıda bulunur. Bu çalışmada meme kanseri hücrelerinden vasküler ve/veya lenfatik endotel hücreleri ile birlikte sferoidler yapılmış ve meme kanseri araştırmaları için in vitro sistem olarak uygulanabilirliklerini ortaya koymaktadır.

Meme Kanseri Araştırmaları için Potansiyel Fonksiyonel In vitro Model Olarak Meme Epitel ve Endotel Hücre Sferoidleri

Bu çalışma, primer insan meme epitel hücrelerini (HMEC'ler) küçük miktarlarda meme dokusundan verimli bir şekilde izole etmek ve büyütmek için daha kolay, zaman kazandıran ve ekonomik bir protokol bildirmektedir. Bu protokol, hem laboratuvar hem de klinik uygulamalar için birincil HMEC'lerin hızlı bir şekilde üretilmesi için uygundur.

Primer İnsan Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Kanser metastazını incelemek için heteroselüler karışmayı yakalayan 3D kanser modellerine kritik bir ihtiyaç vardır. Çalışmamız, invazyon ve hücresel mekansal dağılımları incelemek için kullanılabilecek iskele ve iskelesiz bir ortamda heteromultisellüler stromal-epitel oluşumunu sunmaktadır.

İstilayı Yönlendirmek İçin Epitelyal Kanser Hücrelerinin İskelesiz 3D Kültürlerinde Heteromultihücreli Stromal Hücreler

Keşfedin üç boyutlu karışık-hücre sferoid ko-kültürlerden meme epitel hücrelerinin izolasyonunu. Bu yöntem, stromal fibroblastların epitel hücre biyolojisi üzerindeki etkilerini analiz etmek için kullanılır ve tümör mikroçevresi araştırmalarına katkı sağlar.

Üç boyutlu Karışık-hücre Sfero Co-kültürden Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Daha fazla video keşfet