Üç boyutlu Karışık-hücre Sfero Co-kültürden Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, stromal fibroblastların epitelyal hücre biyolojisi üzerindeki etkilerini analiz etmek amacıyla, üç boyutlu karma hücre doku kültürlerinden epitelyal hücreler elde etmektir. Bu işlem, öncelikle üç boyutlu karma hücre steroid ko-kültürleri oluşturularak gerçekleştirilir. Ardından, ko-kültür sonrası epitelyal hücreleri izole etmek için sferoidler matriks kültüründen ayrılır.

Bir sonraki adım, post ko-kültür epitel hücrelerini analiz için hazır hale gelene kadar pasajlamaktır. Nihayetinde, üç boyutlu kültürdeki fibroblastlara maruz kalmanın epitel hücre davranışı üzerindeki etkileri, kültürlerin mikroskopik görüntülemesi ve post ko-kültür analizi yoluyla değerlendirilebilir. Burada gösterildiği gibi, matriks invazyonunun floresan görüntülemesi ve Transwell migrasyonu gibi epitel hücreleri, prosedürü laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Quin gerçekleştirecektir; ko-kültürler bir gün önce kurulmuştur.

Matrigel'i dondurucudan çıkarın ve bir gece boyunca dört derece Celsius'luk bir buzdolabında buz üzerinde çözdürün. Deney gününde, kültür ortamını Matrigel ile karıştırmadan en az bir saat önce buz üzerine yerleştirin. Çözülmüş Matrigel'i seyreltmek için.

Kokültür için gerekli olan buz gibi soğuk H Mac medyumunun hacminin yarısını buz üzerinde bulunan steril bir tüpe ekleyin. Ardından, tüpü buz üzerinde tutmaya devam ederek, bire bir seyreltme elde etmek için çözülmüş matrigelin aynı yarı toplam hacmini tüpe ekleyin. Daha sonra, 24 kuyucuklu bir plakanın belirlenen kuyucuklarının ortasına 50 µL matrigel medyum karışımı yerleştirin ve plakayı nemlendirilmiş hava ve %5 CO2 içeren 37 °C'lik bir inkübatörde 10 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından kuyucuklara 450 µL daha matrigel besiyeri karışımı ekleyin ve 60 dakika daha inkübe edin. İkinci inkübasyon sırasında, her 0,5 mL HM besiyerinde 0,5 × 10⁵ hücre konsantrasyonunda olacak şekilde fibroblastların ve epitelyal hücrelerin bir bir süspansiyonunu hazırlayın. Matrigel besiyeri karışımı katılaştığında, hücre süspansiyonunu nazikçe jelin üzerine damlatın ve kültürü iki gün boyunca inkübatöre geri yerleştirin.

Besiyerini her iki ila üç günde bir, kuyucuğun kenarından çok nazikçe aspire ederek değiştirin ve yerine taze HEC besiyeri ekleyin; sferoid oluşumunu mikroskop altında günlük olarak izleyin ve uygun olduğunda ışık veya floresan mikroskopisi kullanarak görüntüleyin. Kültürü, steril iki mililitrelik bir cam pipet kullanarak 10 kez yukarı aşağı pipetleyerek işleme başlayın. Ardından kültürü cam pipetle steril 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 350 ×g hızında 10 dakika boyunca santrifüjleyin; santrifüjleme işleminden sonra hücresel sferoid tüpün dibine çökecektir.

Santrifüjün üst kısmındaki bozulmuş matrigel'i nazikçe uzaklaştırmak için steril bir pastör pipeti ucu kullanın. Hazırlık. Şimdi çökelmiş steroid'e bir mililitre H mac medyum ekleyin, steril iki mililitre cam pipet ile iki ila üç kez yukarı aşağı çekerek karıştırın ve kültürü 24 kuyucuklu bir doku kültürü plağındaki bir kuyucuğa aktarın. Medyum değiştirilmeden önce steroid'in kaba tutunması için en az 48 saat bekleyin.

Zamanla, hücreler küresel yapıdan ayrılarak tek katmanlar halinde büyüyecektir; hücre kültürleri %50 konfluense ulaştığında, hücrelerin daha ileri analizlerinden önce iki ila dört gün boyunca 35 mm'lik bir kaba, ardından üç ila beş gün boyunca 100 mm'lik bir kaba standart bir protokol kullanarak pasajlayın. Besiyerini aspire etmek için steril bir pastör pipeti kullanın ve ardından kalan sferoid kalıntılarını manuel olarak mümkün olduğunca temizleyin. Üç boyutlu sferoid ko-kültürlerinde, burada Şekil D, E ve F'de gösterildiği gibi mühendislik yoluyla TM1 susturulmuş fibroblastlar, Şekil A, B ve C'deki kontrol fibroblastlarına kıyasla meme epitel hücrelerinin matriks invazyonunu artırır. Şekil D ve F'de oklarla belirtildiği gibi, TM1 susturulmuş fibroblastlar içeren sferoidlerde matriks içine doğru istila eden epitel projeksiyonlarına dikkat edin. Burada Şekil J, K ve L'de gösterilen mühendislik yoluyla TM1 aşırı ekspresyonuna sahip fibroblastlar, Şekil G, H ve I'daki kontrol fibroblastlarına kıyasla SUM 159 meme kanseri hücre hattının invazyonunu azaltmıştır. Ko-kültür sferoidleri oluşturulduktan sonra, TM1 mühendislikli fibroblastlar içeren sferoidlerdeki epitel projeksiyonu eksikliğini, Şekil G ve I'deki oklarla belirtilen kontrol fibroblastlar içerenlerle karşılaştırın.

Hücre popülasyonları, iki boyutlu bir ortamda yeniden ekim yapılarak steroidlerden izole edilebilir. Bu birleşik görüntüler, matrigel kültüründen izolasyon sonrası ışık ve floresan mikroskobu altındaki kültürleri göstermektedir. Sıfırıncı gün, izolasyon sonrası hemen yapılan görüntülemeyi; birinci, ikinci ve beşinci günler ise izolasyondan sonraki günleri temsil etmektedir.

Bu steroidden ayrılan hücre koronasının zamanla nasıl arttığına dikkat edin. Sonunda, burada okla vurgulandığı gibi, çok az hücrenin kaldığı bir hayalet steroid kalır. Hayaletlerin temizlenmesi ve bir pasaj sonrası çok az steroid kalır.

Test edilen hücrelerin göreceli büyüme hızlarına bağlı olarak, seri pasajlama yoluyla saf popülasyonlar ortaya çıkabilir veya uygun hücre belirteçleri kullanılarak ayrıştırılabilir. Bu örnekte numune kuyucukları, epitel hücrelerinin ve fibroblastların göreceli popülasyonlarını belirlemek amacıyla, sırasıyla GFP eksprese eden fibroblastları ve mCherry eksprese eden epitel hücrelerini tanımlamak için yeşil floresan ve kırmızı floresan kullanılarak akış sitometrisi ile analiz edilir.

3B ko-kültürden izolasyon sonrası epitel hücreler, fibroblastlarla uzun süreli ko-kültür tarafından kazandırılan özellikleri korurlar; bu durum, analiz için geniş bir olanak sağlar. Bu örnekte, TM one eksik fibroblastlara maruz kalma, 3D ko-kültürden izolasyon sonrası haftalarca devam eden ve burada C olarak etiketlenen kontrol fibroblastlarına maruz kalmaya kıyasla ko-kültürle büyütülmüş H max hücrelerinde artmış migrasyonu tetiklemiştir. Bu prosedürün ardından, fibroblastların epitel hücreler üzerindeki etkilerine dair ek soruları yanıtlamak amacıyla gen ekspresyonu ve epigenetik işaretlerdeki değişiklikleri analiz etmeye yönelik diğer yöntemler uygulanabilir.