Name: TransFLP - Genetiği değiştirmek için bir yöntem Vibrio cholerae Doğal Dönüşüm ve FLP-rekombinasyon sonucu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Öğrenin Vibrio cholerae genomlarını doğal dönüşüm ve FLP-rekombinasyon kullanarak hızlı ve verimli bir şekilde genetik olarak nasıl değiştireceğinizi. Bu yöntem gen silme ve DNA entegrasyonu için idealdir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ben teknik yardım için Olga de Souza Silva kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (SNSF) Hibe 31003A_127029 tarafından desteklenmiştir.

TransFLP yöntem (Şekil 1) üç farklı yaklaşımlar ile örneklenmiştir: I), V nin ölümcüllüğünün belirleyicilerini kodlayan genin iki bitişik silme cholera (örneğin, ΔctxAB), II) bir patojenisite ada (örn., ΔVPI-1) çıkarılması ve III) T7 RNA polimeraz promotörü sekans bağlı olan entegre bir gen yukan-of-ilgi, daha sonra izin veren, ilgili gerginlik arka planda yapay ifadesi (örneğin, T7-tfoX) (Şekil 2). 1. Chitin Taneli hazırlanması <ol><li> Standart bir 1.5 ml plastik tüp içinde kitin gevreği ağırlığı 50-80 mg. Bu, toplu olarak hazırlanabilir. Chitin pul Sigma (kat. numarası C9213) dan ticari olarak temin edilebilir. </li><li> Tüplerin kapaklarını açık tutarak gevreği otoklavlayınız. </li><li> Otoklav soğuduktan hemen sonra kapaklarını kapatın. </li><li> Mağaza otoklavlanmış kitin gevreğioda sıcaklığında. </li></ol> 2. Opsiyonel: V. Yapay Dönüşüm FLP Rekombinaz kodlama Plazmid ile cholerae <ol><li> Electrocompetent hazırlayın V. standart yöntemler kullanılarak 11 cholerae hücreleri. -80 Yetenekli hücrelerin alikotları saklayın ° C. </li><li> Electrocompetent plazmid pBR-bdp 5 düzenli bir mini hazırlık 1-2 ul ekleyin V. cholera hücresi ve bir elektroporasyon küvetine (0.2 cm boşluk genişliği) karışımı içine aktarın. </li><li> 1.6 kV bir darbe uygulayın. </li><li> 0.9 mL SOC orta ekleyin, hafifçe bir standart 14 ml tüp hücre aktarın. 30 2,5-3 saat süreyle hareketsiz inkübe ° C. </li><li> Levha 100 ul ve 30 ° C&#39;da gece boyunca 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden LB ve inkübe plakalar üzerinde 300 ul. </li><li> Gelecekte TransFLP deneyler için gliserol stok olarak tek bir klondan ve mağaza arındırın. </li></ol> 3. Oligonükleotid Tasarım ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu <ol><li> En az altı oligonükleotidler ilgilenilen DNA bölge (ler) de olduğu gibi PCR ile FRT yanlı antibiyotik kaseti (Şekil 3) yükseltmek için gereklidir. Aynı zamanda eklenen PCR parçası dış astar oligonükleotidler bir çift eklemek için tavsiye edilir. Bu entegrasyon ve FRT-sardığı antibiyotik direnç kasedi (örn. Şekil 3 ila 5 &#39;chk-up&#39; ve &#39;chk-down&#39; primerleri olarak tasvir) doğru eksizyon için kontrol sağlar. </li><li> Oligonükleotidler # 2, # 3, # 4 ve # 5 dikkatle tasarlayın. Onlar yeterince şablon DNA (örn. ~ 28 bp) tavlama gerekir. Şablon DNA primerleri için genomik DNA (gDNA) gibi pROD17 12 ve pBR-FRT-KAN-FRT (Bu çalışma) primerleri için # 3 ve # 4 (gibi # 2 ve # 5 ve FRT-Kan-FRT-içeren plazmid DNA Şekil 3A). </li><li> Izin # 5 primerler # 2 tasarımı sırasıyla, # 2 / # 3 ve # 4 / # 5 arasındaki 5&#39;-uç taban eşleştirme geniş (Şekil 3A </strong&gt; inset). PCR İki mermi izleyin. </li><li> PCR 1. yuvarlak olarak üç bağımsız PCR reaksiyonları gerçekleştirin. Ilk olarak bir oligonükleotidler # 1 ve # 2 yardımıyla gen / DNA bölge-of-ilgi yukan bölgesi yükseltecektir. PCR hücreleri içinde homolog rekombinasyon izin vermek için uzunluk olarak en az 500 bp&#39;lik bir fragmanı ile sonuçlanmalıdır. Shorter parçaları (~ 250 bp) yeterli 8 olabilir ama tavsiye edilmez. </li><li> Paralel olarak FRT-sardığı antibiyotik kaset yükselterek ikinci PCR gerçekleştirmek. Örnekler burada sağlanan için biz esas aph (kan R) kullanılmıştır. Kullanım oligonükleotidler bu reaksiyon (Şekil 3A) için # 3 ve # 4. </li><li> Eş zamanlı PCR (üçüncü örnek) tarafından aşağı DNA bölgesinde yükseltmek. PCR parçası da uzunluğu en az 500 bp olması gerekir. Şablon ve oligonükleotidler # 5 ve # 6 (Şekil 3A) gibi gDNA ile PCR gerçekleştirin. </li><li> Her üç PCR saflaştırma sonrasındafragmanlar, PCR 2. turda gerçekleştirmek. Şablon olarak ilk turda elde edilen her üç parçaları eşit karışımı kullanın. Amplifikasyon oligonükleotidler # 1 ve # 6 tarafından katalize edilir. Ortaya çıkan PCR parçası (Şekil 3B) doğal transformasyon deneyi (Şekil 1) DNA dönüşüm olarak hizmet vermektedir. </li></ol> 4. Chitin indüklenen Doğal Dönüşüm <ol><li> Büyümek V. 30 zengin besiyerinde aerobik cholerae hücreleri ° C de yaklaşık 0.5 600 nm&#39;de absorbansı ulaşana kadar. </li><li> Santrifüjleme ile hasat bakteri. DASW 2 cilt hücreleri resuspending önce tanımlanan yapay ortam (DASW 6) kez pelet yıkayın. Steril kitin gevreği (nokta 1 altında açıklanan) 50-80 mg kültürü 1 ml ekleyin. Kültür ise bakteriler liman plazmid pBR-bdp (opsiyonel noktası 2), eklenti ampisilin (50 mg / ml). Hareket olmadan 16-24 saat süre ile 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> G &amp; Eklee; 2. boyunca PCR-türetilmiş fragmanı (Madde 3 altında açıklanmıştır) 200 ng. Yoğun kitin yüzeylerinden bakteri sökmeden dikkatlice karıştırın. Hareket olmadan 24 saat boyunca 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> ≥ 30 sn için yoğun Vorteks kültür. Seçici LB besiyeri yaprakları (burada sağlanan örnekler örneğin kanamisin veya gentamisin içeren LB plakalar) üzerine 100-300 ul yayılır. Bakteri diğer antibiyotiklere beraber ampisilin ekleyerek pBR-bdp plazmid liman eğer çift seçici tabak kullanın. 16-24 saat boyunca 30 ° C&#39;de inkübe plakaları veya koloniler görünür oluncaya kadar. </li><li> Seçici plakaları tek transformantlar ayırın. Böyle transformantlar çift çapraz olay nedeniyle PCR parçası tarafından özgün kromozomal lokus yerini almıştır. Antibiyotik kaset kaldırılması gerekli değildir, ve dolayısıyla bu suşlar direkt olarak başka deneyler için de kullanılabilir. </li></ol> 5. FLP tarafından Seçici Kaset giderimi (ler)-Rekombinasyon <ol><li> Doğal dönüşümü tahlilinden önce yapmadıysanız 2. maddede açıklandığı gibi yapay pBR-bdp plazmid ile transformantlar dönüşümü. </li><li> 16-24 saat boyunca 37 ° C&#39;de ampisilin içeren LB agar plaklarına bakteriler büyümek. Seçenekler: 40 2-3 saat süreyle arasındaki sıcaklık değiştirmek ° C plazmid pBR-bdp den bdp ifadesi olarak yüksek sıcaklıklarda 5,10 de-de bastırılanlardır; yakl taze plakaları transfer bakteri. Inkübasyon 8 sa. </li><li> Antibiyotik içeren ve antibiyotik içermeyen agar plaklarına paralel klonlar restreaking tarafından; antibiyotik duyarlılık (Şekil 1 kanamisin için buraya gösterdi) için test. Tek duyarlı koloniler izole edin. Eğer daha başka silme / TransFLP kullanarak ekleme ile gerginlik değiştirmek istiyorsanız, gliserol stok olarak ampisiline dirençli klon dondurun. </li></ol> 6. Plazmid Kür <ol><li> Aerobik koşullar altında gecede kültür büyütün ve30 ° C&#39;de Herhangi bir antibiyotik ilave olmadan zengin ortamı kullanın. </li><li> Opsiyonel: Taze antibiyotik içermeyen ortamda gecede kültürü 1:100 sulandırarak 3-6 saat süreyle taze kültür büyütün. </li><li> Levha veya çizgi düz LB agar plaka (lar) kültür seyreltme (lar) ve 30 inkübe ° 8-16 saat süreyle C (koloniler görebilir kadar). </li><li> Antibiyotik içeren ve antibiyotik içermeyen agar plakaları (Şekil 1) üzerinde paralel olarak klonlar restreaking ile klon ampisilin-duyarlılık için test edin. Gliserol stok olarak ampisilin duyarlı suşu dondurun. </li></ol>

<ol><li>Miller, V. L., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+suicide+vector+and+its+use+in+construction+of+insertion+mutations%3A+osmoregulation+of+outer+membrane+proteins+and+virulence+determinants+in+Vibrio+cholerae+requires+toxR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR.</a> J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988).</li>
<li>Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+for+generating+deletions+and+gene+replacements+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 171, 4617-4622 (1989).</li>
<li>Kato, C., Ohmiya, R., Mizuno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+disrupting+genes+in+the+Escherichia+coli+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Biotechnol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid method for disrupting genes in the Escherichia coli genome.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 1826-1829 (1998).</li>
<li>Donnenberg, M. S., Kaper, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+eae+deletion+mutant+of+enteropathogenic+Escherichia+coli+by+using+a+positive-selection+suicide+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector.</a> Infect. Immun. 59, 4310-4317 (1991).</li>
<li>De Souza Silva, O., Blokesch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+Vibrio+cholerae+by+combining+natural+transformation+with+FLP+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of Vibrio cholerae by combining natural transformation with FLP recombination.</a> Plasmid. 64, 186-195 (2010).</li>
<li>Meibom, K. L., Blokesch, M., Dolganov, N. A., Wu, C. -Y., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitin+induces+natural+competence+in+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae.</a> Science. 310, 1824-1827 (2005).</li>
<li>Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+transformation+of+Vibrio+fischeri+requires+tfoX+and+tfoY%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY.</a> Environ. Microbiol. 12, 2302-2311 (2010).</li>
<li>Marvig, R. L., Blokesch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+transformation+of+Vibrio+cholerae+as+a+tool-optimizing+the+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Natural transformation of Vibrio cholerae as a tool-optimizing the procedure.</a> BMC Microbiol. 10, 155(2010).</li>
<li>Blokesch, M., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serogroup+Conversion+of+Vibrio+cholerae+in+Aquatic+Reservoirs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Serogroup Conversion of Vibrio cholerae in Aquatic Reservoirs.</a> PLoS Pathog. 3, e81(2007).</li>
<li>Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+in+Escherichia+coli%3A+TcR+and+KmR+cassettes+with+the+option+of+Flp-catalyzed+excision+of+the+antibiotic-resistance+determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.</a> Gene. 158, 9-14 (1995).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular Cloning: A laboratory manual</a>. Ford, N., Nolan, C., Ferguson, M. 1, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+positioning+and+action+of+Escherichia+coli+replisomes+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells.</a> Cell. 133, 90-102 (2008).</li>
<li>Karaolis, D. K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Vibrio+cholerae+pathogenicity+island+associated+with+epidemic+and+pandemic+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 3134-3139 (1998).</li>
<li>Ikeda, R. A., Ligman, C. M., Warshamana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T7+promoter+contacts+essential+for+promoter+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">T7 promoter contacts essential for promoter activity in vivo.</a> Nucleic Acids Res. 20, 2517-2524 (1992).</li>
<li>Pan, S. H., Malcolm, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+background+expression+and+improved+plasmid+stability+with+pET+vectors+in+BL21+%28DE3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Reduced background expression and improved plasmid stability with pET vectors in BL21 (DE3).</a> Biotechniques. 29, 1234-1238 (2000).</li>
<li>Faruque, S. M., Zhu, J., Asadulghani,, Kamruzzaman, M., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+diverse+toxin-coregulated+pilus-positive+Vibrio+cholerae+strains+fails+to+demonstrate+evidence+for+Vibrio+pathogenicity+island+phage%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Examination of diverse toxin-coregulated pilus-positive Vibrio cholerae strains fails to demonstrate evidence for Vibrio pathogenicity island phage.</a> Infect. Immun. 71, 2993-2999 (2003).</li>
<li>Joelsson, A., Liu, Z., Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+phenotypic+diversity+of+quorum-sensing+systems+in+clinical+and+environmental+isolates+of+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Genetic and phenotypic diversity of quorum-sensing systems in clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae.</a> Infect. Immun. 74, 1141-1147 (2006).</li>
<li>Heidelberg, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequence+of+both+chromosomes+of+the+cholera+pathogen+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae.</a> Nature. 406, 477-483 (2000).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

TransFLP yöntemi 5 yoğun laboratuarımızda kullanılmıştır yukarıda ve yerde anlatılmıştır. Mümkün olan genetik manipülasyon tür diğerlerinin yanı sıra şunları içerir: tek genler ve gen kümelerinin silinmesi, genomik adalar silme (örn., VPI-1), ilgilenilen bir gen (örneğin, promoter dizileri) yukarı akış yönünde dizilerin yerleştirilmesi ve ekleme , belirli bir gen (örneğin, kodlama afinite etiketleri) sonunda dizileri. TransFLP için önemli bir önkoşul ve ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Chitin gevreği </td><td> Sigma </td><td> C9213 </td><td> Gerekli Otoklavlama </td></tr><tr><td> İSTEĞE BAĞLI: Micropulser (durumda antibiyotik kaset pBR-bdp kodlanmış FLP Rekombinaz tarafından eksize edilmesi gerekir) </td><td> BioRad </td><td> 165-2100 </td><td> Veya karşılaştırılabilir electroporators </td></tr></tbody></table>

transflp - genetiği değiştirmek için bir yöntem<em&gt; vibrio cholerae</em&gt; doğal dönüşüm ve flp-rekombinasyon sonucu

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Çeşitli yöntemler bakteri kromozomu 1-3 işlemek için kullanılabilir. Bu protokollerin çoğu (örneğin, pir-bağımlı veya ısıya duyarlı Replikon 1,2 yataklık) şartlı replikatif plazmid ekleme güveniyor. Bu plazmid homoloji-aracılı rekombinasyon bazlı bakteri kromozomu içine entegre edilmiştir. Bu tür mutantlar insersiyonal çoğu kez direkt olarak deney ortamlarda kullanılır. Alternatif olarak, onun kaybı, ardından plazmid çıkarılması için seçim sık sık SACB gen tarafından kodlanan 4 karşı tarafından seçilebilir levan sukraz enzimi dayanır Gram-negatif bakteriler için, hangi gerçekleştirilebilir. Eksizyonu ya da ön-yerleştirme genotip ya da kromozom ve modifiye geninin plazmid ile kodlanmış kopya arasında bir değişim ile sonuçlanır geri olabilir. Bu yöntemin bir dezavantajı, zaman alıcı olmasıdır. Plazmid ilk klonlanmış gerekmektedir; bunu V. içine yatay transferi gerektirir cholerae (en fazla n<html> otably E ile çiftleştirilerek coli suşu verici) ya da ikinci bir yapay dönüştürülmesi; ve plazmid eksizyonu ve rasgele ya da ilk genotip geri ya da herhangi bir pozitif seçim sarf edilir ise, istenen değişikliği oluşturabilir. Burada, V. hızlı manipülasyon için bir yöntem mevcut cholerae kromozom (lar) 5 (Şekil 1). Bu TransFLP yöntem, V. gibi cins Vibrio bu organizmanın 6 ve diğer temsilci doğal yetkinlik yeni keşfedilen kitin-aracılı indüksiyon dayanmaktadır fischeri 7. Doğal yetkinlik PCR tarafından oluşturulan DNA parçaları dahil olmak üzere ücretsiz DNA alımını sağlar. Bir kez alınır, DNA homolog bölgenin 8 sınırdaş 250-500 bp asgari varlığını verilen kromozomu ile yeniden birleştirilmesi kastedilmektedir. Bu komşu bölgeleri arasındaki bir seçim işaretleyici İçeren sık görülen transformantlar kolay algılanmasını sağlar. T &quot;&gt; Bu yöntem, V. cholerae, farklı genetik manipülasyonu için kullanılabilir ve potansiyel olarak da diğer doğal olarak yeterli bakteri olabilir. bizim daha önce yayınlanmış bir gen silme üzerinde çalışma ve ek olarak, bu yöntem tarafından gerçekleştirilebilir ne üç yeni örnekler sağlamak benzerlik etiketlenmesi sekansları 5 ek. kitin kaynaklı doğal dönüşüm 6 başlangıç ​​protokolünü ilgili birçok iyileştirme adımlar bu TransFLP protokol içinde bu buluşa katılmıştır. Bunlar, diğerlerinin arasında ticari olarak mevcut kitin pul 8, PCR tarafından yardım yengeç kabuk parçalarından replasman, madde 9, ve FLP-rekombinasyon hedef sitesi (FRT) 5 transforme ilave olarak türetilmiş DNA. FRT sitesi FLP rekombinaz 10 tarafından aracılık seçim işaretleyicinin her bölge-yönlendirmeli eksizyon izin verir.

Üç örnek Örnek 6 için sonuçlar Şekil 4&#39;te gösterilmiştir. İlk yaklaşım komşu genlerin CTxA ve ctxB silinmesi hedeflenmiştir. Birlikte V. önemli virulans faktörü kodlayan cholerae kolera toksin. Yukarıda tarif edilen ve Şekil 3&#39;e uygun olarak biz TransFLP yöntem için oligonükleotidler tasarlanmıştır. Ebeveyn zorlanma, ctxAB orijinal DNA lokusu ve ctxAB için silinir ve direnç kasedi kurtulmuş nihai gerilimlerde...

Arasında genomunu değiştirmeye hızlı bir yöntem<em&gt; V. cholerae</em&gt; Tarif edilmektedir. Bu değişiklikler tek genlerin, gen kümeleri ve genomik adaları gibi kısa dizileri (örn. promotor elemanlarına veya benzeşim-etiket dizileri) ve entegrasyon silme içerir. Yöntem, doğal transformasyon ve FLP-rekombinasyon dayanmaktadır.

TransFLP - Genetiği değiştirmek için bir yöntem<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Doğal Dönüşüm ve FLP-rekombinasyon sonucu

Bakteriyel kromozomları manipüle etmek için çeşitli yöntemler mevcuttur1-3. Bu protokollerin çoğu, koşullu replikasyon yeteneğine sahip plazmidlerin yerleştirilmesine dayanmaktadır...

Bu prosedürün amacı, doğal transformasyon ve flip kombinasyonuna dayanan bu hızlı ve verimli yöntemle vio cray'i genetik olarak manipüle etmektir. Bu işlem, öncelikle transformasyonun doğal indükleyicisi olan uygun bir kitin kaynağı hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adımda, iki tur PCR kullanılarak bir DNA konstrüktü oluşturulur ve ardından doğal transformasyon uygulanır; böylece PBR flip plazmidi içeren bakterilerin PCR fragmanını alması ve bunu genomlarına entegre etmesi sağlanır.Ardından, flip rekombinasyon hedefinin veya FRT bölgesiyle çevrelenmiş antibiyotik direnç kasetinin uzaklaştırılması için plazmit tarafından kodlanan lipaz enzimini indüklemek amacıyla sıcaklık artışı uygulanır. Son adımda, bakteriler FLP kodlayan plazmitten arındırılır. Nihayetinde, genetik manipülasyonun başarılı olduğunu göstermek için PCR ve sekanslama kullanılır.Bu tekniğin, intihar plazmidleri kullanarak virüsleri genetik olarak manipüle etmek gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, oldukça hızlı ve verimli olmasıdır. Standart 1,5 mililitrelik plastik tüplere 50 ila 80 miligram kitin pulu örnekleri tartarak başlayın, ardından tüplerin kapaklarını açık tutarak pulları otoklavlayın; otoklav işlemi biter bitmez kapakları hemen kapatın ve otoklav kitini oda sıcaklığında saklayın. İlgi duyulan DNA bölgelerinin yanı sıra FRT ile çevrelenmiş antibiyotik kasetini PCR ile çoğaltmak için en az altı oligonükleotid gereklidir. Ayrıca, eklenen PCR fragmanının dış kısmına bir çift oligonükleotid primeri eklenmesi önerilir.Bu durum, FRT ile çevrelenmiş antibiyotik direnç kaseti tasarımının entegrasyonunun ve doğru eksize edildiğinin kontrol edilmesine olanak tanır; iki, üç, dört ve beş numaralı oligonükleotidler dikkatle hazırlanmalıdır. Genomik DNA'ya yeterince bağlanabilmeleri için iki ve beş numaralı primerler en az 28 baz çifti içermelidir. Üç ve dört numaralı primerler, kalıp olarak FRT içeren bir plazmid ile yapılandırılmalıdır; iki ve üç numaralı primerler ile dört ve beş numaralı primerlerin beş prime uçlarında kapsamlı tamamlayıcı baz eşleşmesine izin verecek şekilde iki ve beş numaralı primerleri tasarlayın.Şimdi ilk PCR turu için, özel tasarlanmış konstrüktlerin ilgilenilen deneysel bölgesinin yukarı akış (upstream) bölgesini amplifiye etmek amacıyla, eş zamanlı ancak bağımsız yürütülecek üç PCR reaksiyonunun birincisini hazırlamak için birinci ve ikinci oligonükleotidleri kullanın. Paralel olarak, FRT ile çevrelenmiş antibiyotik kasetini amplifiye etmek için üçüncü ve dördüncü oligonükleotidleri kullanarak ikinci PCR reaksiyonunu hazırlayın. Örneğin bu deneyde, kanamisin direncini kodlayan A PH geni kullanılmıştır.Oligonükleotid beş ve altı ile genomik DNA'yı kalıp olarak kullanarak üçüncü PCR reaksiyonunu hazırlayarak aşağı akış DNA bölgesini eş zamanlı olarak amplifiye edin. Daha sonra, her üç PCR fragmentinin saflaştırılmasının ardından üç örnek için de PCR reaksiyonunu başlatın; birinci turda elde edilen üç fragmentin eşit miktarlarda karışımını, ikinci tur PCR'ı gerçekleştirmek için kalıp olarak kullanın. Bu amplifikasyon, oligonükleotid bir ve altı tarafından katalize edilecektir.Elde edilen PCR fragmanı, doğal transformasyon deneylerinde transforme edici DNA olarak kullanılacaktır. v cholera hücrelerini, 30 °C'de aerobik olarak zenginleştirilmiş besiyerinde büyüttükten sonra, bakterileri oda sıcaklığında santrifügasyon ile hasat edin.Ardından, bakteri kültürünü pul halindeki kitine aktarın ve hücre süspansiyonunu 30 °C'de gece boyunca inkübe edin. Daha sonra, ikinci tur PCR ile elde edilen fragmanlardan en az 200 ng'ı bakteri hücre süspansiyonuna dikkatlice karıştırın. Bakterilerin kitin yüzeylerinden aşırı derecede ayrılmamasına dikkat ederek, bu çözeltiyi 30 °C'de, hareket ettirmeden bir gün daha inkübe edin.Şimdi, PBR flip plazmidini taşıyan bakteriler için kültürü en az 30 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin; ardından hücre çözeltisinin 100 ila 300 µL'sini, ampicillin içeren çift seçici plakalara yayın. Plakalardaki diğer antibiyotiğe ek olarak, bakteri hücre kültürlerini koloniler görünene kadar 30 °C'de inkübe edin. Ardından, seçici plakalardan tekil transformantları izole edin.Bu adıma, bakterileri ampicillin içeren LB agar plaklarında 37 °C'de 16 ila 24 saat boyunca büyüterek başlayın. İsteğe bağlı bir adım olarak, PBR flip plazmidinden flip ekspresyonu daha yüksek sıcaklıklarda dereprese olduğu için sıcaklığı iki ila üç saat boyunca 40 °C'ye çıkarın. 37 °C'de sekiz saatlik ek inkübasyonun ardından bakterileri taze plakalara aktarın.Şimdi, antibiyotik duyarlılığını test etmek için klonları antibiyotik içeren ve antibiyotik içermeyen agar plaklarında paralel olarak kısıtlayın ve ardından ortaya çıkan tek bir antibiyotik duyarlı koloniyi izole edin. Bu adıma, kültürü aerobik koşullar altında 30 °C'de, antibiyotiksiz zenginleştirme besiyerinde gece boyunca büyüterek başlayın. Ertesi sabah, gece boyunca büyütülen kültürü taze antibiyotiksiz besiyerinde 1:100 oranında seyrelterek üç ila altı saat boyunca yeni bir kültür büyütün; öğleden sonra kültür seyreltisini düz LB agar plaklarına ekim yapın veya plaklayın ve ardından koloniler görünür hale gelene kadar plakları 30 °C'de sekiz ila 16 saat daha inkübe edin.Komşu genler olan CTXA ve CTXB'nin silinmesini amaçlayan bu ilk deneyde, trans flip yöntemi için gerekli oligonükleotidler daha önce gösterildiği gibi oluşturulmuştur. Ebeveyn suş, C-T-X-A-B'nin orijinal DNA lokusu yerine FRT bölgeleriyle çevrelenmiş antibiyotik direnç kasetini taşıyan ara suş ve C-T-X-A-B'nin silindiği ve direnç kasetinden arındırıldığı final suşun genotiplerinin tamamı test edilmiştir. Bu deney için, transforme eden PCR fragmanına değil, yalnızca kromozomal DNA'ya bağlanan primerler kullanılarak kapsamlı PCR gerçekleştirilmiştir. PCR fragmanlarının boyutlarını belirlemek için standart agaroz elektroforezi ile ayırma işlemi yapılmıştır.Birinci şeritte, dünya tipi B kolera suşu 3.143 baz çifti beklenen fragman boyutunda yer almıştır. İkinci şeritte, delta C-T-X-A-B-F-R-T suşundan türetilen PCR fragmanı 3.162 baz çiftinde yer almıştır.Üçüncü kanalda ise, delta ctx A B FFR TP CR fragmanı, 1 KB merdiven ile karşılaştırıldığında 1.769 baz çiftinde yer almıştır. Tüm bir genomik adanın çıkarıldığı ikinci örnekte, bu deney için hedef olarak Vibrio Patojenite adası bir veya VPI bir seçilmiştir. Trans-flip yöntemi iki adımda modifiye edilmiştir.İlk olarak, kanamisin direnç geninin entegrasyonu, PI bir'in başlangıcındaki tek bir FRT bölgesi ile gerçekleştirilmiştir. Ardından, patojenite adasının sonundaki ikinci bir FRT bölgesini takiben Gentamisin direnci şeklinde ek bir antibiyotik direnç belirtecinin eklenmesine olanak tanıyan ikinci bir doğal transformasyon turu uygulanmıştır. İlgili primer çiftleri her jel görüntüsünün üzerinde belirtilmiştir ve trans FLP yöntemine az önce gösterildiği şekilde devam edilmiştir.Ebeveyn, ara ve final suşlarının tamamı, birinci şeritteki saflaştırılmış genomik DNA'nın PCR'ı ile doğrulandı. Vahşi tip V cholera suşunun PCR fragmanı ikinci şeritte çalıştırıldı. VPI one FRT can GM FRT suşundan elde edilen PCR fragmanı çalıştırıldı.Üçüncü şeritte ise delta VPI bir FRT türevli PCR ürünü analiz edilmiştir. Primer çiftleri her jel görüntüsünün üzerinde belirtilmiştir. Nihai suş, VPI bir'in tamamından yoksundur.Bu üçüncü örnekte, standart protokolden hafif bir modifikasyonla trans flip yöntemi kullanılarak, doğal transformasyonun ana düzenleyicisi olan Gene T fox'un yukarı akımına bir T seven RNA polimeraz bağımlı promotor dizisi entegre edilmiştir. T seven RNA bağımlı promotor konsensüs dizisi, bu DNA dizisinin kromozom içinde korunması amacıyla dört ve beş numaralı oligonükleotidlere sarkıntı (overhang) olarak eklenmiştir. Antibiyotik direnç kaseti eksize edildikten sonra, konstrükt T seven RNA polimeraz içeren bir V colorized suşa entegre edilmiştir.Bu suşta, T7 RNA polimeraz bağımlı T-Fox ekspresyonunu test etmek için T7 RNA polimeraz geni ekspresyonu LAC UV5 promotörü ile yönlendirilmiştir. Doğal transformasyon deneyleri LB ortamında gerçekleştirilmiştir. T-Fox genini önceden takip eden T7 bağımlı promotörden yoksun olan ebeveyn suş; zengin ortamda T-FOX transkripsiyonunun gerçekleşmemesi ve doğal indükleyici kitinin yokluğu nedeniyle bu koşullar altında doğal olarak transforme edilemez. Bu fenotip, T7 RNA polimerazın IPTG ile yapay olarak indüklenip indüklenmediğinden bağımsızdır.Buna rağmen, kompetans geni T Fox'un yukarısında T7 RNA polimeraz bağımlı promotör içeren trans flip ile oluşturulan suş, LB medyumundaki LAC UV five promotörünün sızıntısı nedeniyle zenginleştirilmiş medyumda gerçekten doğal olarak transformablé idi. Üretilen T7 RNA polimeraz, IPTG ile indüksiyon olmadan T7 RNA polimeraz bağımlı promotörden T FOX'u zaten transkribe etmişti. Bu durum, entegre edilen T7 RNA polimeraz bağımlı promotör dizisinin işlevselliğini doğrulayarak doğal kompetansı ve transformasyonu başlatmıştır.Bu fenotip, LAC UV beş promotörünün indükleyicisi olan IPTG'nin eklenmesi sayesinde T seven RNA polimerazın tam indüksiyonu ile önemli ölçüde artırılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, kitin indüklemeli doğal transformasyon ve flip rekombinasyon kombinasyonunu kullanarak V. cholera'nın genetik olarak nasıl manipüle edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Uzmanlaşıldığında bu teknik, yalnızca birkaç gün içinde genlerin veya genomik adaların silinmesine ve ayrıca DNA dizilerinin bölge yönelimli bir şekilde entegre edilmesine olanak tanır.

transflp-method-to-genetically-modify-vibrio-cholerae-based-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Üretimi C. elegans Recombineering yoluyla transgenlerin GalK Seçilebilir Marker

Önceden hazırlanmış alıcı suşlar olarak adlandırılan iniş takımı suşları, içine faiz yabancı DNA entegre hızlı ve verimli bir yöntem tarif edilmiştir. Metodu ΦC31 integraz konjugasyonu ve ifadesi ile, belirli bir lamine suşun iniş pedi odağına içine bir DNA kasetinin site-specific entegrasyon sağlar.

Siteye özgü Bakteriyel Kromozom Mühendislik: ΦC31 integraz Aracılı Kaset Borsası (IMCE)

Kaynak: Erdoğan, F., ve diğerleri, Bakteriyel Konjugasyonda Yer Alan Transfer Proteinlerinin Diziye Özgü Analizi için Konjugatif Çiftleşme Deneyleri. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, bir kurtarma plazmidi kullanarak bir F plazmitinin donörden alıcı E. coli hücrelerine aktarılması ve ikili antibiyotik direnci yoluyla transkonjuganların seçilmesi prosedürünü göstermektedir. İşlem, bakteri kültürlerinin karıştırılmasını, çalkalanmadan inkübasyonu, çiftleşme çiftlerinin bozulmasını ve başarılı plazmit...

E. coli'de F Plazmid Transferi ve İkili Antibiyotik Seçimi

Elektroporasyon dönüşüm olarak bilinen bir süreç içinde bakteri DNA'nın verilmesi için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Elektro-hücrelerinin hazırlanması için geleneksel protokoller zaman alıcı ve emek yoğundur. Bu makalede, bir alternatif, hızlı ve şu anda bazı laboratuarlarda tarafından kullanılan elektro-hücrelerinin hazırlanması için etkili bir yöntem tarif eder.

Elektrokompetan Hazırlanması için hızlı Protokolü<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Ve<em&gt; Vibrio cholerae</em

Enterobacter sp. YSU glukoz az tuz ortamında büyür. Oksotroflan rastgele bir konakçı genom içine kendisini ekleyen bir transposome ile dönüştürülmesiyle oluşturulur. Mutantlar minimal orta karmaşık ortamdan replika plaka tarafından bulundu. Kesilen gen, kurtarma ve dizileme ile tespit edilir.

Üretilmesi Enterobacter Sp. YSU oksotroflan transpozon mutajenezi kullanarak,

Sentetik Biyoloji Mühendisliği proteinlerin kanonik olmayan amino asitlerin co-translational ekleme kullanarak benzersiz özellikleri ile sağlar. Burada, GFP türü fluorophore "altın" floresan protein (GdFP) olarak adlandırdığı roman Floresans spektroskopik özellikleri ile hayalice kırmızı kaymıştır bir türevi E. coli seçici basınç birleşme (SPI) yolu ile nasıl üretilir sundu.

Mühendislik kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından 'Altın' floresan ve kütle spektrometresi ve floresan göre Protein analizi

Burada tanımlanan floksed kaset allelic değişim mutagenezi, FLAEM kullanarak Chlamydia trachomatis hedefli, markerless gen delemesi için bir yöntemdir.

Klamidya trachomatis Floxed Kaset Allelic Exchange Mutagene tarafından Markerless Gen Deletion

Burada FLIM-FRET ölçümleri kullanılarak canlı Pseudomonas aeruginosa'da çok farklı ifade edilmiş iki protein arasındaki protein-protein etkileşimlerini karakterize eden bir protokol uyguluyoruz. Protokol, bakteri gerinim konstrüksiyonları, bakteri immobilizasyonu, görüntüleme ve görüntüleme sonrası veri analizi rutinlerini içermektedir.

Canlı Bakterilerde Protein-Protein Etkileşimlerinin FLIM-FRET Ölçümleri.

Yöntemine göre Hawaiian Bobteylleri squid prosedür...

Kolonizasyon Euprymna scolopes Squid tarafından Vibrio fischeri</em

Enfekte THP1 hücreleri ile bir parazit-kurtarma ve dönüşüm...

Hücre içi Karşı Antileishmanial Tarama için Parasite Kurtarma ve Dönüşüm Testi<em&gt; Leishmania donovani</emTHP1 İnsan Akut Monositik Lösemi Hücre Hattı&gt; Amastigotes

Öğrenin Vibrio cholerae genomlarını doğal dönüşüm ve FLP-rekombinasyon kullanarak hızlı ve verimli bir şekilde genetik olarak nasıl değiştireceğinizi. Bu yöntem gen silme ve DNA entegrasyonu için idealdir.

TransFLP - Genetiği değiştirmek için bir yöntem

Daha fazla video keşfet