TransFLP - Genetiği değiştirmek için bir yöntem Vibrio cholerae Doğal Dönüşüm ve FLP-rekombinasyon sonucu

Bu prosedürün amacı, doğal transformasyon ve flip kombinasyonuna dayanan bu hızlı ve eksik yöntemle vio cray'i genetik olarak manipüle etmektir. Bu işlem, öncelikle uygun bir kitin kaynağı hazırlanarak gerçekleştirilir; çünkü kitin, transformasyonun doğal indükleyicisidir. İkinci adımda, iki tur PCR kullanılarak bir DNA konstrüktü oluşturulur ve doğal transformasyonları gerçekleştirilir; böylece PBR flip plazmidi içeren bakterilerin PCR fragmanını alması ve bunu genomlarına entegre etmesi sağlanır.

Ardından, flip rekombinasyon hedefi veya FRT bölgeleriyle çevrelenmiş antibiyotik direnç kasetinin uzaklaştırılması için plazmid tarafından kodlanan lipaz enzimini indüklemek amacıyla bir sıcaklık artışı uygulanır. Son adımda, bakteriler FLP kodlayan plazmitten arındırılır. Nihayetinde, genetik manipülasyonun başarılı olduğunu göstermek için PCR ve sekanslama kullanılır.

Bu tekniğin, virüsleri genetik olarak manipüle etmek için intihar plazmitleri kullanmak gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, oldukça hızlı ve verimli olmasıdır. İşleme, standart 1,5 mililitrelik plastik tüplerde 50 ila 80 miligram kitin pulu örnekleri tartarak başlayın; ardından tüplerin kapaklarını açık tutarak pulları otoklavlayın, otoklav işlemi biter bitmez kapakları hemen kapatın ve otoklav kitini oda sıcaklığında saklayın. İlgilenilen DNA bölgelerinin yanı sıra FRT ile çevrelenmiş antibiyotik kasetini PCR ile çoğaltmak için en az altı oligonükleotid gereklidir. Ayrıca, eklenen PCR fragmanının dışında bir çift oligonükleotid primerin dahil edilmesi de önerilir.

Bu durum, FRT ile çevrelenmiş antibiyotik direnç kaseti tasarımının entegrasyonunun ve doğru eksizyonunun, iki, üç, dört ve beş numaralı oligonükleotitler ile dikkatlice kontrol edilmesine olanak tanır. Primer iki ve beş, genomik DNA'ya yeterince bağlanabilmek için en az 28 baz çifti içermelidir. Primer üç ve dört, kalıp olarak FRT içeren bir plazmit kullanılarak oluşturulmalıdır; primer iki ve üç ile sırasıyla primer dört ve beş arasında, beş prime ucunda kapsamlı tamamlayıcı baz eşleşmesine izin verecek şekilde primer iki ve beş'i tasarlayın.

Şimdi ilk PCR turu için, özel tasarlanmış konstrüktlerin ilgilenilen deneysel bölgesinin yukarı akış bölgesini amplifiye etmek amacıyla üç eş zamanlı ancak bağımsız PCR reaksiyonunun ilkini hazırlamak için bir ve iki numaralı oligonükleotidleri kullanın. Paralel olarak, FRT ile çevrelenmiş antibiyotik kasetini amplifiye etmek için üç ve dört numaralı oligonükleotidleri kullanarak ikinci PCR reaksiyonunu hazırlayın. Örneğin, bu deneyde kanamisin direncini kodlayan A PH geni kullanılmıştır.

Oligonükleotid beş ve altı ile genomik DNA'yı kalıp olarak kullanarak üçüncü PCR reaksiyonunu hazırlayarak aşağı akıştaki DNA bölgesini eş zamanlı olarak amplifiye edin. Ardından her üç PCR fragmanının saflaştırılmasından sonra her üç örnek için PCR reaksiyonunu başlatın; ikinci tur PCR'ı gerçekleştirmek için ilk turda elde edilen her üç fragmandan eşit miktarlarda oluşan bir karışımı kalıp olarak kullanın. Bu amplifikasyon, oligonükleotid bir ve altı tarafından katalize edilecektir.

Elde edilen PCR fragmanı, doğal transformasyon deneylerinde dönüştürücü DNA olarak kullanılacaktır. v cholera hücrelerini, 30 °C'de aerobik olarak zenginleştirilmiş ortamda büyüttükten sonra, bakterileri oda sıcaklığında santrifüj ile toplayın.

Ardından, bakteri kültürünü pullar halindeki kitin üzerine aktarın ve hücre süspansiyonunu 30 °C'de gece boyunca inkübe edin. Daha sonra, ikinci tur PCR'dan elde edilen fragmanlardan en az 200 ng'ı bakteri hücre süspansiyonuna dikkatlice karıştırın. Bakterilerin kitin yüzeylerinden aşırı derecede ayrılmamasına dikkat ederek, bu çözeltiyi hareketsiz bir şekilde 30 °C'de bir gün daha inkübe edin.

Şimdi, PBR flip plazmidi taşıyan bakteriler için kültürü en az 30 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin; hücre solüsyonundan 100 ila 300 µL'yi, ampisilin ve plakalardaki diğer antibiyotiği içeren çift seçici plakalara yayın. Bakteriyel hücre kültürlerini, koloniler görünür hale gelene kadar 30 °C'de inkübe edin. Ardından, seçici plakalardan tekil transformantları izole edin.

Bu adıma, bakterileri ampicillin içeren LB agar plaklarında 37 °C'de 16 ila 24 saat boyunca büyüterek başlayın. Opsiyonel bir adım olarak, PBR flip plazmidinden flip ekspresyonu daha yüksek sıcaklıklarda baskıdan kurtulduğu için sıcaklığı iki ila üç saat boyunca 40 °C'ye değiştirin. 37 °C'de sekiz saat daha inkübasyon yaptıktan sonra bakterileri taze plakalara aktarın.

Şimdi, antibiyotik duyarlılığını test etmek için klonları antibiyotik içeren ve antibiyotik içermeyen agar plaklarında paralel olarak kısıtlayın ve ardından ortaya çıkan tek bir antibiyotik duyarlı koloniyi izole edin. Bu adıma, kültürü 30 °C'de aerobik koşullar altında, antibiyotiksiz zenginleştirme besiyerinde gece boyunca büyüterek başlayın. Ertesi sabah, gece boyunca büyütülen kültürü taze antibiyotiksiz besiyerinde 1:100 oranında seyrelterek yeni bir kültürü üç ila altı saat boyunca büyütün; öğleden sonra kültür seyreltisini düz LB agar plaklarına ekle veya yayma yöntemiyle aktar ve ardından koloniler görünür hale gelene kadar plakları 30 °C'de sekiz ila 16 saat daha inkübe edin.

Komşu genler olan CTXA ve CTXB'nin silinmesini amaçlayan bu ilk deneyde, trans-flip yöntemi için oligonükleotitler üretildi; ardından ebeveyn suş, C-T-X-A-B'nin orijinal DNA lokusu yerine FRT ile çevrelenmiş antibiyotik direnç kasetini taşıyan ara suş ve C-T-X-A-B genleri silinmiş ve direnç kasetinden arındırılmış nihai suşun genotipleri test edildi. Bu deney için, transforme edilen PCR fragmanına değil, yalnızca kromozomal DNA'ya bağlanan primerler kullanılarak kapsamlı PCR gerçekleştirildi. PCR fragmanlarının boyutlarını belirlemek için standart agaroz jel elektroforezi ile ayırma işlemi yapıldı.

Birinci şeritte, dünya tipi B kolera suşu beklenen 3, 143 baz çifti fragman boyutunda yer almıştır. İkinci şeritte, delta C-T-X-A-B-F-R-T suşundan türetilen PCR fragmanı 3, 162 baz çiftinde yer almıştır.

Ve üçüncü şeritte, delta ctx A B FFR TP CR fragmanı, 1 KB merdivenine kıyasla 1.769 baz çiftinde konumlanmıştır. Tüm bir genomik adacığın çıkarıldığı ikinci örnekte, bu deney için hedef olarak Vibrio Patojenite adacığı bir veya VPI bir seçilmiştir. Trans-flip yöntemi iki adımda modifiye edilmiştir.

İlk olarak, kanamisin direnç geninin entegrasyonu, PI bir'in başlangıcındaki tek bir FRT bölgesi ile gerçekleştirildi. Ardından, patojenite adasının sonuna ikinci bir FRT bölgesiyle birlikte Gentamisin direnci şeklinde ek bir antibiyotik direnç markerının yerleştirilmesine izin veren ikinci bir doğal transformasyon turu uygulandı. İlgili primer çiftleri her jel görüntüsünün üzerinde belirtilmiştir ve trans FLP yöntemine az önce gösterildiği şekilde devam edilmiştir.

Ebeveyn, ara ve final suşlarının tamamı, birinci şeritteki saflaştırılmış genomik DNA'nın PCR'ı ile doğrulanmıştır. Vahşi tip V cholera suşunun PCR fragmanı ikinci şeritte yürütülmüştür. VPI bir FRT can GM FRT suşundan elde edilen PCR fragmanı yürütülmüştür.

Üçüncü şeritte ise, delta VPI one FRT suşundan elde edilen PCR ürünü analiz edilmiştir. Primer çiftleri, her bir jel resminin üzerinde belirtilmiştir. Nihai suş, VPI one'ın tamamından yoksundur.

Bu üçüncü örnekte, standart protokolden küçük bir değişiklikle trans flip yöntemi kullanılarak, doğal transformasyonun temel düzenleyicisi olan Gene T fox'un yukarı akışına bir T seven RNA polimeraz bağımlı promotör dizisi entegre edilmiştir. T seven RNA bağımlı promotör konsensüs dizisi, bu DNA dizisinin kromozom içinde korunması amacıyla dört ve beş numaralı oligonükleotitlere sarkımlar (overhangs) olarak eklenmiştir. Antibiyotik direnç kaseti çıkarıldıktan sonra, konstrükt T seven RNA polimeraz içeren bir V colorized suşuna entegre edilmiştir.

Bu suşta, T seven RNA polimeraz bağımlı T Fox ekspresyonunu test etmek amacıyla, T seven RNA polimeraz geninin ekspresyonu LAC UV beş promotörü tarafından yönlendirildi. Doğal transformasyon deneyleri LB ortamında gerçekleştirildi. Zengin ortamda T FOX transkripsiyonunun olmaması ve doğal indükleyicisi kitinin yokluğu nedeniyle, Gene T Fox'tan önce gelen T seven bağımlı promotörden yoksun olan parental suş, bu koşullar altında doğal olarak transformasyona açık değildir. Bu fenotip, T seven RNA polimerazın IPTG ile yapay olarak indüklenip indüklenmediğinden bağımsızdı.

Ancak, kompetans geni T Fox'un yukarısında T7 RNA polimeraz bağımlı promotör içeren trans flip kaynaklı suş, LB medyumunda LAC UV beş promotörünün sızıntısı nedeniyle zenginleştirilmiş medyumda gerçekten doğal olarak transformasyon yeteneğine sahipti. Üretilen T7 RNA polimeraz, IPTG ile indüksiyon olmaksızın T7 RNA polimeraz bağımlı promotörden T FOX'u zaten transkribe etmişti. Bu durum, entegre edilen T7 RNA polimeraz bağımlı promotör dizisinin işlevselliğini doğrulayarak doğal kompetansı ve transformasyonu başlatmıştır.

Bu fenotip, LAC UV beş promotörünün indükleyicisi olan IPTG'nin eklenmesiyle T seven RNA polimerazın tam indüksiyonu sonucunda önemli ölçüde artırılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, kitinle indüklenen doğal transformasyon ve flip rekombinasyon kombinasyonunu kullanarak V. cholera'nın genetik olarak nasıl manipüle edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Bu teknik uzmanlaşıldığında, sadece birkaç gün içinde genlerin veya genomik adaların silinmesine ve ayrıca DNA dizilerinin bölgeye özgü bir şekilde entegre edilmesine olanak tanır.