TransFLP - Genetiği değiştirmek için bir yöntem Vibrio cholerae Doğal Dönüşüm ve FLP-rekombinasyon sonucu

Bu işlemin amacı, doğal transformasyon ve flip kombinasyonuna dayanan bu hızlı ve eksik yöntemi kullanarak vio cray'i genetik olarak manipüle etmektir. Bu, önce uygun bir kitin kaynağı hazırlanarak gerçekleştirilir, çünkü kitin dönüşümün doğal indükleyicisidir. İkinci adım sırasında, iki tur PCR kullanılarak bir DNA yapısı oluşturulur ve bunların doğal dönüşümü gerçekleştirilir, bu da plazmit PBR çevirme içeren bakterilerin PCR fragmanını almasına ve genomlarına dahil etmesine izin verir.

Daha sonra, flip rekombinasyon hedefinin veya FRT bölgesi ile çevrili antibiyotik direnç kasetinin çıkarılması için plazmid kodlu lipaz enzimini indüklemek için bir sıcaklık artışı kullanılır. Son adımda, bakteriler FLP kodlayan plazmidden kürlenir. Sonuç olarak, genetik manipülasyonun başarılı olduğunu göstermek için PCR ve dizileme kullanılır.

Bu tekniğin, vire'yi genetik olarak manipüle etmek için intihar plazmitlerinin kullanılması gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bu yöntemin çok hızlı ve verimli olmasıdır. Standart 1,5 mililitrelik plastik tüplerde 50 ila 80 miligram kitin gevreği örneğini tartarak başlayın, ardından tüplerin kapaklarını açık tutun, otoklav hemen çağrıldıktan sonra pulları otoklavlayın, kapakları kapatın ve otoklav kitini oda sıcaklığında pullar halinde saklayın, ilgilenilen DNA bölgelerini amplifiye etmek için en az altı oligonükleotid gereklidir, yanı sıra PCR ile FRT kanatlı antibiyotik kaseti. Ayrıca, yerleştirilen PCR fragmanının dışına bir çift oligonükleotid primerinin dahil edilmesi önerilir.

Bu, FRT kanatlı antibiyotik direnç kaset tasarımının, iki numaralı, üç numaralı, dört numara ve beş numaralı oligonükleotidlerin dikkatlice entegrasyonunun ve doğru eksizyonunun kontrol edilmesini sağlar. İkinci ve beşinci primerler, genomik DNA ve primerlere yeterince diz çökebilmek için en az 28 baz çifti içermelidir. Üç ve dördüncü, sırasıyla iki ve üç primerler ve dört ve beş primerler arasında beş asal uçta kapsamlı ücretsiz baz eşleşmesine izin vermek için şablon olarak plazmid içeren bir FRT kutu FRT ile yapılmalıdır: primerler iki ve beş.

Şimdi PCR'nin ilk turu için, özel olarak tasarlanmış yapıların deneysel ilgi bölgesinin yukarı akış bölgesinin amplifikasyonu için üç eşzamanlı, ancak bağımsız PCR reaksiyonundan ilkini hazırlamak için oligonükleotid bir ve ikinci kullanın. Paralel olarak, FRT kanatlı antibiyotik kasetini amplifiye etmek için oligonükleotid üç ve dört kullanarak ikinci PCR reaksiyonunu hazırlayın. Örneğin, bu deneyde, kanin direncini kodlayan A PH geni kullanıldı.

Şablon olarak beş ve altı oligonükleotid ve genomik DNA kullanarak üçüncü PCR reaksiyonunu hazırlayarak aşağı akış DNA bölgesini eşzamanlı olarak çoğaltın. Ardından, PCR fragmanlarının üçünün de saflaştırılmasından sonra üç numune için de PCR reaksiyonunu başlatın, ikinci bir PCR turu gerçekleştirmek için şablon olarak ilk turda elde edilen üç parçanın tümünün eşit miktarlarda bir karışımını kullanın. Bu amplifikasyon, oligonükleotidler bir ve altı tarafından katalize edilecektir.

Elde edilen PCR fragmanı, doğal dönüşüm deneylerinde dönüştürücü DNA olarak hizmet edecektir. V kolera hücreleri büyüdükten sonra, 30 santigrat derecede aerobik olarak zenginleştirilmiş ortam. Bakterileri oda sıcaklığında santrifüjleme ile hasat edin.

Daha sonra, bakteri kültürünü pullar halinde uçurtma üzerine aktarın ve hücre süspansiyonunu gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, ikinci tur PCR türevli fragmanların en az 200 nanogramını bakteri hücresi süspansiyonuna dikkatlice karıştırın. Bakterileri kitin yüzeylerinden yoğun bir şekilde ayırmamaya dikkat edin, daha sonra bu çözeltiyi bir gün daha hareket etmeden 30 santigrat derecede inkübe edin.

Şimdi girdap, kültür, PBR flip plazmidini barındıran bakteriler için en az 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde 100 ila 300 mikrolitre hücre çözeltisine yayılır ve ampisilin içeren çift seçici plakalara yayılır. Plakalardaki diğer antibiyotiğe ek olarak, bakteri hücre kültürlerini koloniler görünene kadar 30 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra tekli transformatörleri seçici plakalardan izole edin.

Bu adıma, bakterileri ampisilin içeren LB agar plakaları üzerinde 16 ila 24 saat boyunca 37 santigrat derecede büyüterek başlayın. İsteğe bağlı bir adım olarak, PBR flip plazmitinden çevirme ifadesi daha yüksek sıcaklıklarda bastırıldığından, sıcaklığı iki ila üç saat boyunca 40 santigrat dereceye değiştirin. 37 santigrat derecede sekiz saat daha inkübasyondan sonra, bakterileri taze plakalara aktarın.

Şimdi, antibiyotik duyarlılığını test etmek için klonları antibiyotik içeren ve antibiyotik içermeyen agar plakaları üzerinde paralel olarak kısıtlayın ve ardından ortaya çıkan tek bir antibiyotiğe duyarlı koloniyi izole edin. Bu adıma, kültürü gece boyunca aerobik koşullar altında 30 santigrat derecede büyüterek başlayın, ortamı antibiyotiksiz zenginleştirin. Ertesi sabah, gece boyunca kültürü öğleden sonra çizgisinde veya kültürün düz LB agar plakalarına plaka seyreltilmesinde taze antibiyotik içermeyen ortamda bir ila 100 oranında seyrelterek üç ila altı saat boyunca yeni bir kültür büyütün ve daha sonra koloniler görünene kadar plakaları 30 santigrat derecede sekiz ila 16 saat daha inkübe edin.

Bu ilk deneyde komşu genler CTXA ve CTXB'yi silmeyi amaçladı. Trans flip yöntemi için oligonükleotidler, ebeveyn suşunu az önce gösterildiği gibi üretildi, C-T-X-A-B'nin orijinal DNA lokusu yerine FRT ile çevrili antibiyotik direnç kasetini barındıran ara suş ve C-T-X-A-B için silinen ve direnç kasetinden serbest bırakılan son suşun tümü genotipleri için test edildi Bu deney için dönüştürücü PCR fragmanına diz çökmeyen primerler kullanılarak toptan PCR yapıldı, ama sadece kromozomal DNA'ya. PCR fragmanları, boyutlarını belirlemek için standart aerojel elektroforezi ile ayrıldı.

Birinci şeritte, dünya tipi B kolera türü, 3.143 baz çiftinin beklenen parça boyutunda bulunuyordu. İkinci şeritte, delta C-T-X-A-B-F-R-T suşundan türetilen PCR fragmanı olabilir. FRT, 3.162 baz çiftinde bulunuyordu.

Ve üçüncü şeritte, delta ctx AB FFR TP CR parçası, bir KB'lık merdivene kıyasla 1.769 baz çiftinde bulunuyordu. Bütün bir genomik adanın çıkarıldığı ikinci örnekte, bu deney için hedef olarak Vibrio Patojenite adası veya VPI biri seçildi. Trans flip yöntemi iki aşamada değiştirildi.

İlk olarak, kanamisin direnç geninin entegrasyonu, PI birin başlangıcında tek bir FRT bölgesi tarafından ilerletildi. Daha sonra, ek bir antibiyotik direnç belirtecinin, yani Gentamisin direncinin ve ardından patojenite adasının sonunda ikinci bir FRT bölgesinin yerleştirilmesine izin veren ikinci bir doğal dönüşüm turu gerçekleştirildi. İlgili primer çiftleri her bir jel resminin üzerinde belirtilmiştir ve trans FLP yöntemi az önce gösterildiği gibi devam etmiştir.

Ebeveyn, orta ve son suşların tümü, birinci şeritteki saflaştırılmış genomik DNA'nın PCR'si ile doğrulandı. Yabani tip V kolera suşunun PCR fragmanı ikinci şeritte çalıştırıldı. Suş VPI'den kaynaklanan PCR fragmanı bir FRT kutusu GM FRT çalıştırıldı.

Ve üçüncü şeritte, suş delta VPI bir FRT türevi PCR ürünü analiz edildi. Primer çiftleri her jel resminin üzerinde belirtilmiştir. Son suş, tüm VPI türünden yoksundur.

Bu üçüncü örnekte, bir T yedi RNA polimeraz bağımlı promotör dizisi, standart protokolden hafif bir modifikasyon ile trans flip yöntemi kullanılarak doğal dönüşümün ana düzenleyicisi olan Gene T fox ile yukarı akışa entegre edildi. T yedi RNA'ya bağımlı promotör konsensüs dizisi, dört ve beş numaralı oligonükleotidlere çıkıntılar olarak dahil edildi, böylece bu DNA dizisi kromozom içinde tutuldu. Antibiyotik direnç kaseti eksize edildikten sonra bile, yapı daha sonra V renklendirilmiş suş içeren bir T yedi RNA polimeraz içine entegre edildi.

Bu suşta, T yedi RNA polimeraz geninin ekspresyonu, T Fox'un T yedi RNA polimeraz bağımlı ekspresyonunu test etmek için LAC UV beş promotörü tarafından yönlendirildi Doğal transformasyon testleri LB ortamında gerçekleştirildi. Gen T Fox'tan önce gelen T yedi bağımlı promotöründen yoksun olan ebeveyn suşu, zengin ortamda T FOX transkripsiyonunun olmaması ve doğal indükleyici kitinin yokluğu nedeniyle bu koşullar altında doğal olarak dönüştürülemez. Bu fenotip, T yedi RNA polimerazın IPTG tarafından yapay olarak indüklenip indüklenmediğinden bağımsızdı.

Bununla birlikte, Gene T Fox yeterliliğinin yukarı akışında T yedi RNA polimeraz bağımlı promotörü içeren trans flip tarafından oluşturulan suş, LB ortamında LAC UV beş promotörün sızması nedeniyle gerçekten de doğal olarak dönüştürülebilir zenginleştirilmiş ortamdı. Üretilen T yedi RNA polimeraz, IPTG tarafından indüksiyon yapılmadan T yedi RNA polimeraz bağımlı promotöründen T FOX'u zaten kopyaladı. Bu, entegre T yedi RNA polimeraz bağımlı promotör dizisinin işlevselliğini doğrulayan doğal yeterlilik ve dönüşümü başlattı.

Bu fenotip, LAC UV beş promotör IPTG'nin indükleyicisinin eklenmesine bağlı olarak T yedi RNA polimerazın tam indüksiyonu ile önemli ölçüde arttırılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, kitin kaynaklı doğal dönüşüm ve flip rekombinasyonunun bir kombinasyonunu kullanarak VI kolerasının genetik olarak nasıl manipüle edileceğini iyi anlamalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, genleri veya genomik adaları silmenize ve DNA dizilerini yalnızca birkaç gün içinde siteye yönlendirilmiş bir şekilde entegre etmenize olanak tanır.