Living Görselleştirilmesi Dinamik Kinetochore Protein Davranış ve Kromozom Hareket tarafından Mitotik Checkpoint incelenmesi

Bu deneyin amacı, canlı drosophila embriyolarındaki in vivo protein dinamiklerinin ve lokalizasyon paternlerinin time-lapse konfokal mikroskopi ile görüntülenmesini göstermektir. Bu işlem, öncelikle bakımı yapılan drosophila stoklarından embriyoların toplanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, embriyolar bir lama aktarılır ve ardından embriyolar üzerindeki koryonlar manuel olarak temizlenerek kaplanmış embriyolar elde edilir.

Ardından A, önceden hazırlanmış lamlara düzenli bir şekilde yerleştirilir ve deneye bağlı olarak uygun iğ ipliği kontrol noktası indükleyici reaktifler ile mikroenjeksiyon yapılabilir. Bu prosedürün son adımı, konfokal mikroskopi kullanarak embriyoların zaman ayarlı (time-lapse) görüntülemesini gerçekleştirmektir. Nihayetinde, zaman ayarlı ve odak mikroskopisi; iğ ipliği kontrol noktası proteinini, kolokalizasyon kromozom davranışlarını ve kontrol noktasıyla ilişkili transgenik oph hatlarında kontrol noktası indükleyici ajanların etkisini göstermek için kullanılır.

Bu yöntem, genetik hatlar kullanılarak iğ iplikçi kontrol noktası proteinlerinin mutasyonlarının veya eksikliklerinin diğer kontrol noktası bileşenlerinin kolokalizasyonu üzerindeki etkisi ve bunun iğ iplikçi montaj kontrol noktasının verimli bir şekilde işleme kapasitesi üzerindeki sonucu gibi, ME regülasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Transgenik sinekler, 25 °C'de, sinek yemi içeren plastik tüplerde ve üst kısımlarında ek kuru maya tozu ile muhafaza edilir. Tüpler, yetiştirme koşullarına bağlı olarak rutin olarak her iki ila üç haftada bir değiştirilir.

Sinek besiyeri hazırlamak için, uygun miktardaki sinek besiyeri karışımını, bileşenleri çözmek amacıyla peristaltik bir pompa kullanarak sürekli karıştırarak ısıtın ve bu ortamdan 8 ila 10 mililitreyi bulamaç şeklinde her bir plastik viyale dağıtın. Besiyeri bulamacı donduğunda ve oda sıcaklığına geldiğinde, her bir viyalin ağzını pamuklu köpük tıpa ile kapatın. Bu besiyeri viyallerini bir tepsiye yerleştirin, plastik bir torba ile mühürleyin ve küçük ölçekli yumurta toplama işlemi için 4 °C'de saklayın.

Embriyoların bırakılması için, yüzeyine ek kuru maya tozu eklenmiş taze bir sinek besin tüpüne yaklaşık 50 çift iki ila üç günlük yetişkin sineği aktarın. Bu durumda klima ile sabit tutulan sıcaklık olan 25 °C'de inkübe edin. Oda için her saat başı, sinekleri taze bir tüpe aktarın ve embriyoları 30 dakika boyunca bırakın.

Toplanan embriyoların bir kısmının nükleer bölünme döngüsü sekiz ile 10 arasında olduğundan emin olunmalıdır. İlk saatlik toplama, genellikle yumurtlama koşulları uygun olmadığında dişi vücutlarında kalan yaşlanmış embriyolar içerdiği için normalde atılır. Bu nedenle, bu deneylerde yalnızca ikinci saatten itibaren yapılan transferlerden elde edilen embriyolar kullanılacaktır.

Bu prosedür için mikroskop lamları ve 50 by 22 milimetre lamel kullanılır. Bir lamel alarak başlayın ve nemli, ince uçlu bir fırça yardımıyla bir tarafın dört köşesini çok küçük bir miktar su ile hafifçe ıslatın. Lameli bir mikroskop lamının üzerine yerleştirin.

İnce sıvı filmin neden olduğu kılcal yüzey gerilimi, lamın hareket etmesini engellemelidir. Lamın orta kısmına ince bir şerit halinde heptan tutkalı uygulayın. Heptan saniyeler içinde buharlaşmalı ve tutkal lam üzerinde kalmalıdır.

Ardından, bir elmas kalem kullanarak başka bir lamelin yaklaşık 1,5 milimetrekarelik küçük kareler halinde kesilmesini sağlayın. Bir kareyi alıp yapışkan şeridinin bir ucuna yerleştirin. Bu kare, mikroenjeksiyon gerektiğinde iğne ucunu açmak için kullanılacaktır.

Başka bir mikroskop lamı alın, üzerine iki santimetre uzunluğunda çift taraflı yapışkan bant yapıştırın ve embriyoları kaplama prosedürüne başlamak için koruyucu kağıdı soyun. Sinekleri nemli ve ince uçlu bir fırça yardımıyla taze besiyerli bir viale aktarın. Hazırlanan lam üzerindeki çift taraflı yapışkan banda yaklaşık 50 yumurta aktarın.

Yumurtaların yayılmasını sağlamak için uygun miktarda sıvı kullanın. Sıvı buharlaştığında, yumurtalar diseksiyon mikroskobu altında banda yapışacaktır. Korion kırılıp açılana kadar, bir cımbızın iki ucundan birinin dış tarafıyla yumurtalara uzun eksenleri boyunca birkaç kez nazikçe dokunun.

Hızlı su kaybını önlemek için embriyoyu Corian kabuğu içinde bırakın. Bu işlemi 10 ila 20 yumurta işleme alıncaya kadar tekrarlayın. Ardından, embriyoları tek tek alarak Corian kabuğundan çıkarın ve embriyoları nazikçe dikey bir şeride yerleştirin.

Yapıştırıcı şerit üzerine. Embriyoları, uzun kenarları yapıştırıcı şeridin uzun kenarına antiparalel olacak şekilde hizalayın. Embriyoları üç ila sekiz dakika boyunca bir kurutma odasında bekletin.

Son olarak, mikroenjeksiyondan önce aşırı su kaybını önlemek için embriyoları uygun miktarda volter sol tennis yağı ile kaplayın. Mikroenjeksiyon, bu prosedürün en zor kısımları arasındadır. Mikroenjeksiyonu mümkün olduğunca kolay ve verimli hale getirmek için, slayt hazırlamaya yönelik özel protokole uyulmalıdır.

Embriyolar, mikroenjeksiyon için optimal durumda olacak şekilde dikkatlice hazırlanmalıdır. Embriyoların mikroenjeksiyonu için kullanılacak iğneler önceden hazırlanır. İnce bir yükleme ucu kullanarak, bir iğneyi enjeksiyon tamponundaki uygun konsantrasyondaki reaktife ait bir ila iki mikrolitre ile doldurun.

Enjektör iğnesini, basınç borusu enjeksiyon kontrol sistemine bağlı olacak şekilde, bir Leica TCSP iki ters konfokal mikroskoptaki iğne tutucuya yerleştirin. 40 kat objektif altında bir embriyo bulun. Ardından, odak düzlemini değiştirmeden iğnenin gölgesini bulun.

Bu işlem, iğnenin görüş alanının merkezine getirilmesi ve yavaşça sağ odak düzlemine indirilmesiyle gerçekleştirilir. Yapıştırıcı şeridin bir ucuna önceden monte edilmiş olan küçük kare lamel parçasını bulmak için mikroskop tablasını çok nazikçe hareket ettirin. İğne ucu, küçük kare lamelin kenarına çarpıp onu nazikçe kırana kadar iğneyi çok yavaşça hareket ettirin.

Embriyolar tekrar görüş alanına girecek şekilde sahneyi hareket ettirin ve enjeksiyon için uygun yaştaki bir embriyoyu seçin. Embriyoyu dikkatlice iğneye yaklaştırın ve hem embriyo hem de iğne için odak düzlemini yeniden ayarlayın. Embriyoyu iğnenin içine doğru hareket ettirin.

Embriyonun yan tarafına bir damla reaktif enjekte edin ve ardından embriyoyu uzaklaştırın. Canlı embriyoların zaman ayarlı (time-lapse) veya tekil görüntüleri, 40 kat yağ daldırmalı objektife sahip bir Leica TCSS SP iki ters konfokal mikroskopi sistemi kullanılarak toplanır. Spektrumları örtüşen ve aynı embriyoda ko-eksprese edilen birden fazla florofor görüntülendiğinde, her bir floresan protein emisyon dalga boyu ardışık olarak toplanır.

Görüntüler, zamanraflatımlı görüntüleme için zaman çerçeveleri ayarlanırken daha sonra ortaya çıktı. Bu faktörler göz önünde bulundurulmalıdır. Genellikle tek bir görüntü, iki tarama hattının ortalaması olarak elde edilir.

Ortalama iki kare tarama ile, eşzamanlı tarama modunda 12 x 12 piksel boyutundaki beş görüntüyü taramak ve iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek minimum 6,3 saniye sürerken, ardışık tarama modunda bu süre 15,44 saniyedir. Pinhole normalde bir ila iki au veya airy birimine ayarlanır ve herhangi bir belirgin fotobleaching'i önlemek için lazer gücü mümkün olan en düşük seviyeye getirilir. Bu temsili zamanlaşmış film, canlı ophis cial embriyolarda CDC 20'nin dinamik kinetik kor भर्ती alımını ve kromozom hareketini göstermektedir.

G-F-P-C-D-C 20'yi (yeşil renkte) ve RFP his stone two B'yi (kırmızı renkte) ko-eksprese eden transjenik bir başlangıç embriyosundan zaman atlamalı (time-lapse) görüntüler alınmıştır. Çekirdek bölünme döngüleri sırasında, her 10 saniyede bir yedi ila sekiz kare alınmış ve hücrelerin profazda olduğu kare sıfırıncı zaman noktası olarak kabul edilmiştir. Bu şekil, zaman atlamalı filmden kareleri göstermektedir; G fp CDC 20'nin, sırasıyla üçüncü ve dördüncü görüntülerdeki beyaz oklarla belirtildiği üzere profaz ve prometafaz kinetokorlarında kolayca gözlemlenebildiği ve sırasıyla beşinci ve altıncı görüntülerde gözlemlendiği üzere metafaz ve anafaz kinetokorlarında kalmaya devam ettiği görülmektedir.

G-F-P-C-D-C 20, birinci görüntüde beyaz ok başı ile belirtilen arayüz çekirdeğinin dışında yer alır ve ikinci görüntüde gösterildiği üzere erken profazda çekirdeğe girer. Sekizden 14'e kadar olan görüntülerde, birlikte eksprese edilen RFP histone two B belirteçleri kullanılarak birleştirilmiş kromatin morfolojileri belirlenmiştir. Görüntüler alt sırada gösterilmektedir.

Bu protokol kullanılarak, SAC'yi potansiyel olarak tetikleyen antikorların, floresan işaretli proteinlerin veya ilgili kimyasal bileşiklerin mikroenjeksiyon yoluyla embriyolara uygulanmasıyla iğ ipliği montaj kontrol noktası veya SAC fonksiyonları incelenebilir. Bu örnekte, mikrotübülleri depolimerize ederek SAC'yi tetiklemek amacıyla embriyolar colchicine ile işlenmiş ve SACG FP CDC 20 veya GFP MAD kullanılmıştır. Hücre döngüsü ilerleme belirteçleri olarak iki kinetik çekirdek sinyali kullanılmıştır.

Üst panelde, ARES iki ile altı arasındaki görüntülerdeki durdurulmuş esci'leri belirtmektedir. Birinci görüntüde okla işaretlenen alan, kolşisin tedavisi öncesini göstermektedir; G-F-P-C-D-C 20 geç interfaz çekirdeğinin dışındadır. Orta paneldeki görüntüler, endojen MAD iki yokluğunda, yedi ile on iki arasındaki görüntülerde oklarla belirtilen G-F-P-C-D-C 20'nin çekirdeğin içine ve dışına ve kinetikor seyri boyunca üzerine ve dışına salınım yapmaya devam ettiğini göstermektedir.

Sitokinez kusurlu görünse de, bu durum Kolşisin tedavisine yanıt olarak hücrelerin durdurulmasında SAC fonksiyonunun başarısız olduğunu göstermektedir. Kız kardeş çekirdeklerin ayrılmasının başarısız olduğu bir örneğe görüntü 10'da rastlanmaktadır. Son olarak, görüntü 14 ile 18 arasındaki alt paneldeki ok uçları, GFP MA two füzyon proteinlerinin biriktiği kinetik çekirdekleri işaret etmektedir; bu da fonksiyonel GFP MA two'nun, MA two mutant embriyosundaki sac defekt fenotipini düzelttiğini göstermektedir.

Görüntü 13'teki ok ucu, geç interfaz evresindeki bir çekirdekteki GFP MAD 2 birikimini göstermektedir. Bu videoları izledikten sonra, mikromanülasyon için lamlar hazırlamadan önce sapları koruyarak iki yazılım embriyosunun nasıl hasat edileceğini ve embriyoların manuel olarak nasıl ayrılacağını, ardından konfokal mikroskopi kullanarak in vivo zaman ayarlı görüntüleme işleminin nasıl gerçekleştirileceğini iyi bir şekilde anlamış olmalısınız.