Için Basitleştirilmiş Tekniği

Bugün, kadavradan alınan insan oküler globundan kornea ve retinal doku çıkarma işlemini gerçekleştiren basitleştirilmiş bir tekniği tanıtıyoruz. Burada anlatılan teknik, oküler globun diğer dokularına zarar vermeden transplantasyon, cerrahi ve oral araştırma amaçlarıyla kullanılacak yüksek kaliteli dokuların elde edilmesine yardımcı olacaktır. 18 yıllık uzmanlığımız ve her yıl gerçekleştirdiğimiz kornea transplantasyonları ile, yeni teknikler geliştirerek ve becerilerimizi her gün artırarak çalışmalarımızda yüksek bir standart sürdürdük.

Bunu başarmak için, önce korneayı, ardından retina evizini çıkarırız. Kornea, ışığın retinaya iletilmesini sağlayan avasküler bir dokudur ve bu amaçla her zaman iyi derecede şeffaflık korumalıdır. Kornea; epitel, Bowman tabakası, stroma, Descemet membranı ve endotelyum olmak üzere beş tabakadan oluşur.

Kornea hasar görmüşse, uygun bir donör korneanın yardımıyla değiştirilebilir. Koroid, sklera ile retina arasındaki ara tabakadır, içten Bruch membranı ile sınırlanmıştır ve gözdeki kan akışından sorumludur. Koroidin uygun şekilde evisere edilmesi, retinanın çıkarılması kadar önemlidir.

Retina, kornea ve lensten gelen ışığın alınmasına yardımcı olur ve bunu nihayetinde beyne iletilen kimyasal enerjiye dönüştürür. Şeffaf ve hassas olan optik sinirin yardımıyla, kaliteli bir doku elde etmek için sistematik bir şekilde evisserasyon yapılmalıdır. Laminer hava akışlı kabini çalıştırın.

Laminar akış kabinini %70 izopropil alkol kullanarak temizleyin. Cerrahi bone, steril eldiven ve koruyucu kolluklar gibi kişisel koruyucu kıyafetleri giyin. Aseptik teknik kullanarak, steril bir örtü ve önceden sterilize edilmiş bir enstrüman tepsisi yerleştirerek steril alanı hazırlayın.

Steril alet paketini aseptik olarak açın ve herhangi bir kontaminasyondan kaçınarak steril alana ters çevirin. Tüm steril malzemeleri ve aletleri steril alana yerleştirin ve göz kürelerini içeren göz kavanozlarını steril alanın kenarına yakın olacak şekilde konumlandırın. Kullanım kolaylığı için şişeleri önceden hazırlanmış saklama ortamı ile etiketleyin; iyot poliol pirol kapağını sodyum th sülfat ve steril fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisinin üzerine yerleştirin.

Steril besiyerinin dışında, buzdolabında dört derece Celsius'ta saklanan oküler dokuların ve solüsyonların normal oda sıcaklığına ulaşmasını bekleyin. Tekrarlanan ısıtma veya soğutma döngülerinden kaçının. Göz kavanozundaki gazlı bezleri ve süngerleri steril pensler kullanarak çıkarın.

Oküler küreyi kapağın üzerine yerleştirin ve ek bandajları çıkarın. Oküler küreyi optik sinirle birlikte dikkatlice alın ve küreyi steril IPVP içine daldırın. Oküler küreleri iki dakika boyunca steril IPVP ile dekontamine edin.

Küreyi bir dakika boyunca steril sodyum tiyosülfata aktarın. Küreleri steril fosfat tamponlu hücre hattı solüsyonuna aktarın ve işlem sırası gelene kadar bekletin. Laminar hava akışlı kabin altında çalışarak, oküler küreyi PBS ile yıkayıp çıkarın ve steril alanın altına yerleştirin.

Korneayı ve korneadan yaklaşık beş milimetrelik sklera bölgesini açıkta bırakacak şekilde göz küresini steril bir bezle sarın; göz küresi basitçe el ile tutulabilir. Steril makas kullanarak uygun basıncı koruyun. Korneaya zarar vermeden konjunktivanın tüm olası kalıntılarını temizleyin.

Limbus bölgesinden üç ila dört milimetrelik bir skleral insizyon gerçekleştirmek için tek kullanımlık bir bistüri ucu kullanın. Ardından, alttaki uveal dokuyu perfore etmemeye veya korneanın normal kurvaturunda herhangi bir deformasyona neden olmamaya dikkat ederek insizyonu 360 derece genişletin. Vitreus cisminin sızmasını önleyecek şekilde, dört küçük boşluk bırakarak dört büyük insizyon yapın.

Diğer herhangi bir dokunun çıkarılmadığından emin olarak dört boşluğun tamamı kesilir. Küçük skleral plakların varlığı kesme işlemini zorlaştırabilir, bu nedenle skleral eksizyonun mikrocerrahi makasla tamamlandığından emin olun. Bu işlem, koroid retina ve vitreus gövdesine zarar vermeden gerçekleştirilmelidir.

İnsizyonun tamamlandığından emin olmak için kontrol edin. İnsizyon doğru şekilde gerçekleştirildiyse, korneal skleral kenar siliyer gövdeye yalnızca korneye karşılık gelen noktada yapışır; oküler globu steril alanın merkezine yakın bir yere yerleştirin. Kornea çıkarma işlemini steril pensler kullanarak tamamlayın.

Sklera kenarını sabit tutun ve kornea sklera kenarını oküler ışımdan uzaklaştıracak şekilde kesin. Kalan tüm komşu dokuları korno sklera butonundan nazikçe ayırın. Kornea sklera kenarını, korneada çapraz gerginliğe yol açabilecek şekilde asla çekmeyin ve ön kamara üzerine geri düşmesine izin vermeyin.

Korneanın endotel hücre yoğunluğu hipotonik solüsyon kullanılarak, hücre mortalitesi ise yaklaşık bir dakika boyunca tripan mavisi boyaması ile kontrol edilir. Tripan mavisi boyası steril bir tel gazlı bezle temizlenir ve kornea steril PBS ile yıkanır. Ardından, sakroz solüsyonu ile doldurulmuş steril bir Petri plakasına aktarılır.

Bu solüsyon, hipotonik bir ortam oluşturmaya ve hücrelerin görsel olarak tanımlanmasına yardımcı olur. Hüçreler daha sonra optik mikroskop altında yüz kat büyütme ile sayılır ve milimetrekare başına hücre sayısı olarak ölçülür. Hücreler genellikle hücre yoğunluğu, hücreler arası sınırlar, polimorfizm, dejenerasyon, distrofi ve hücre mortalitesi gibi morfolojik özellikler açısından incelenir.

Kornea kalınlığı, eksize edilen korneanın iyi bir şeffaflık oranının yanı sıra transplantasyon için önemli bir özelliktir. Korneayı sklera kenarına sabitlemek için steril kornea CLO kullanılır; sklera kenarının kilitlenmesi için deliğin yeterli genişlikte olduğundan emin olmak adına kornea CLO bükülür ve kornea sklera kenarı, bir kornea karanfil kullanılarak oda sıcaklığında hazırlanmış olan, daha önceden hazırlanmış kornea saklama ortamına aktarılır. Ardından kornea, dört haftalık saklama süresi boyunca 31 derece SIU'larda korunmalıdır.

Saklama medyası, B 9 2 4 0 cihazı kullanılarak çeşitli mikrobiyolojik testlere tabi tutulur. Saklama sırasında kornea, transplantasyon için gereken normal boyutundan daha fazla kalınlaşır. Göz bankaları, kalınlığı azaltmak için şişme önleyici ajanlar kullanır; korneayı normal boyutuna döndürmek için %6 Dextron T 500 ve taşıma medyumu kullanılır.

Retinal eksizyon öncesinde, RNAsız bir ortam oluşturmak için steril aletleri RNA away ile temizleyin. Steril alanı hazırlayın ve oküler globun bütün olduğundan, sadece korneanın ve skleral kenarın çıkarıldığından emin olun. Eğer vitreus gövdesi dışarı sızıyorsa, retinal dokunun çıkarılması zorlaşır.

Donör 65 yaşın altındaysa, serolojik testlerin ardından sklera, cerrahi amaçlarla %70 alkol içinde korunur. Bu gibi durumlarda sklera kesilmez, sadece vitreus cismi çıkarılır ve retinal eksizyon için skleranın tamamı muhafaza edilir. Steril pens ve makas kullanarak, skleranın kornea tarafına yakın bir noktadan küçük bir kesi veya insizyonla başlayıp optik sinire doğru ilerleyin.

Sklera kısmını steril pensle tutun ve vitreus yumrusuna zarar vermemeye dikkat ederek, makasla optik sinir yönüne doğru parça parça kesin. Koroid tıkaçlar birbirine yapışmış olduğu için skleradan ayrılmalıdır. Koroid dokusunu açığa çıkarmak için skleranın tamamını kesin. Nedir?

Sklera tamamen kesildiğinde, optik sinire yakın bir yerden keserek sklerayı geri kalan dokulardan ayırın; böylece vitreus gövdesini örten koroid tabakasının tamamı görünür hale gelecektir. İki steril pens kullanarak, bu steril RNA'dan arındırılmış eppendorf tüplerini iki ml RL ile doldurun. Bir pensle optik siniri tutup diğeriyle koroidi kaldırarak, koroid tabakasını nazikçe çıkarın.

Kısmen ayırın ve çıkarmayı kolaylaştırmak için koroidi kesin. Retinaya zarar vermemeye dikkat ederek makas yardımıyla koroid tabakası kesilebilir. Eksize edilen koroid tabakasını RNA later çözeltisi içine yerleştirin ve 24 saat boyunca dört derece Celsius'da saklayın.

Retinal dokuyu açığa çıkarmak için tüm ek koroid tabakasını temizleyin. Tüm koroid tabakası kaldırıldığında, şeffaf bir retina tabakası görülecektir. Belirgin bir şekilde, koroid tabakasının iç kısmında, yine kaldırılabilecek olan bir brush membranı bulunur, ancak bunu çıplak gözle tanımlamak zordur.

Benzer şekilde, retinal tabakayı çıkarmak için iki pens kullanın. Optik sinir yakınına eksizyon yapıldığında, yüksek miktarda retina izole etmek kolaydır. Gözün tüm tabakaları artık görülebilir.

Eksize retinayı RNA later solüsyonu içine yerleştirin ve 24 saat boyunca dört derece Celsius'ta saklayın. Çalışma alanını %70'lik izopropil alkol kullanarak temizleyin. Trypan blue ile boyanmış endotelyal hücreler, ters bir mikroskobun yüz kat büyütmesi altında incelenebilir.

Milimetrekare başına 200'den fazla hücreye sahip uygun bir kornea, genellikle daha sonraki kullanım için saklanır. Bunların orta dereceden mükemmel kaliteye kadar derecelendirilmesi, karşılaştırmalı çalışmalar için yardımcı olacaktır. Genellikle kornea transplantasyon için hazır olduğunda kalınlık ve şeffaflık not edilir ve uygun bir kornea, korneanın tamamının nakledildiği penetran keratoplasti için kullanılır.

Hücre mortalitesi, maviye boyanmış hücrelerin gözlemlenmesiyle kontrol edilir ve ölü hücrelerin yüzdesi olarak değerlendirilir. Koruma sırasında %2'den fazla olan genel hücre mortalitesi uygunsuz kabul edilir. Hücre yoğunluğu milimetrekare başına 2200 hücreden düşükse veya mortaliteye bağlı hasar varsa, kornea anterior laminer keratoplasti için kullanılabilir.

Anterior travma hasarlıysa ve kornea iyi bir endotelyal hücre yoğunluğuna sahipse, kornea posterior laminer keratoplasti için kullanılabilir. Organ kültürü sırasında kornea kalınlığı genellikle artar. Taşıma medyumu, korneanın normal şeklini ve yapısını yeniden kazanmasına yardımcı olur.

Ayrıca, organ kültürü korneanın yeniden epitelizasyonuna yardımcı olur ve uzun saklama süresi sayesinde uygun donör seçimini kolaylaştırır. Mikrobiyolojik ve serolojik testler gerçekleştirilir. Bu yöntem, cerrahi operasyonun organize edilmesi için yeterli zaman sağlar ve yüksek postmortem süre nedeniyle mümkün olmadığı durumlarda endotelyal hücre yoğunluğunun ve morfolojisinin kontrol edilmesine yardımcı olur.

Böylece, tarif edilen prosedür takip edildiğinde, kornealar diğer dokulara herhangi bir zarar vermeden eksize edilebilir. Kornea transplantasyon için uygun değilse; yeni besiyerleri ve koruma koşulları geliştirmek, oküler yüzey hastalıklarını incelemek, limbal kök hücreleri izole etmek ve ilaçların kornea üzerindeki etkilerini araştırmak amacıyla araştırma süreçlerinde kullanılabilir. Retina için ise, RNA örneklerinin diğer dokularla çapraz kontaminasyonunu önleyebilir ve temel öneme sahip olan RNA bütünlüğünü koruyabiliriz.

Araştırma amaçları için vazgeçilmez olan bu dokular; oküler dokuların transkriptomunun karakterize edilmesi, rejeneratif tıp projeleri için kök hücrelerin izole edilmesi ve normal veya etkilenmiş deneklerden alınan dokular arasındaki histolojik farkların değerlendirilmesini amaçlamaktadır. Retinal doku çıkarıldıktan sonra farklı amaçlar için kullanılabilir ve bu nedenle koruma için kullanılan sonraki adımlar ve koşullar buna göre değişiklik gösterebilir. Örneğin retinal doku; RNA veya DNA ekstraksiyonu için r nator veya thisis tamponu gibi RNA stabilizasyon reaktifleri içeren tüplere veya hücre izolasyonu için displase veya tripsine yerleştirilebilir.

İmmünohistokimya için dokuları parafin veya OCT içine gömmeden önce tespit solüsyonları ile sabitleme. Bu videoyu izlediğiniz için teşekkürler, araştırmalarınızda başarılar dileriz.