Toprak Mikrobiyal Kalıntı Tayini için Aldononitrile Asetat türevlendirilmiş Glukozamin ve Muramic Asit GC tabanlı Algılama

Bu videonun genel amacı, topraklardan ekstrakte edilen glukozamin ve muiik asidin Aldon nitril asetat türevlerinin GC tabanlı analizine yönelik ayrıntılı bir açıklama sunmaktır. Süreç, organik polimerlerin parçalandığı ve glukozamin ile muiik asidin serbest bırakıldığı asit sindirimi ile başlar. Ardından, monomer amino şekerler karışım çözeltisinden izole edilir ve saflaştırılır.

Bunu, bu amino şekerleri gaz kromatografisi tabanlı analiz için uçucu aldon nitril asetatlara dönüştüren Türevlendirme işlemi takip eder. Prosedürün son adımı, sıvı-sıvı ekstraksiyonu ve GC tayinidir. Nihayetinde, alev iyonizasyon dedektörlü GC ile myo ve asetol ile metil glutamin standartları arasında elüye olan aldon nitril asetat amino şekerlerinin baz hattı ayrımını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin diğer yöntemlere göre temel avantajı; hassasiyet, basitlik, iyi kromatik grafik ayrımı ve numune saklama sırasındaki stabiliteyi optimal şekilde dengelemesidir. Bu yöntem, SSE mikroorganizmalarının stabil toprak karbon havuzlarına katkısı gibi küresel karbon döngüsü alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, topraklardaki mikrobiyal detritus birikimi hakkında içgörü ve bilgi sağlayabilmesinin yanı sıra okyanus sistemleri, biyolojik dokular ve hatta dünya dışı numuneler gibi diğer matrislere de uygulanabilir.

Bu protokole başlamak için, arazi toplama işleminin ardından toprak örneklerini dondurarak kurutun, bir bilyalı değirmen toprak öğütücü veya havan ve havan eli kullanarak toprak örneklerini öğütün ve homojenize edin. Öğütülmüş toprak örneklerini 25 mililitrelik hidroliz balonlarına tartın. Her bir hidroliz balonuna 10 mililitre altı molar hidroklorik asit ekleyin ve sıkıca kapatmadan önce azot gazı ile doldurun.

Bir inkübatörde 105 °C'de sekiz saat boyunca hidroliz edin. Otomatik bir zamanlayıcı anahtar kullanarak flaskları inkübatörden çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğutun.

Her bir balona 100 µL iç standart myo asetol ekleyin. Plastik hunileri 200 mL armut biçimli balonlara boşalacak şekilde kurup çalkalayarak karıştırın. Stabilite sağlamak için standart konik uçlu 24 40 rodajlı cam eklemleri plastik bardaklar üzerine yerleştirin.

2 numaralı Watman kalitatif süzgeç kağıtlarını dörtte bir şeklinde katlayıp hunilere yerleştirin. Her bir hidroliz balonjosunu çalkalayın ve süspansiyonu huniye boşaltın. Her bir örneği filtrelemek için, yaklaşık 45 °C'de vakum uygulayarak döner evaporatör yardımıyla filtratı kurutun.

Her bir çift balondan elde edilen kurutulmuş kalıntıyı üç ila beş mililitre su ile süspanse edin ve 40 mililitrelik bir Teflon tüpe aktarın. Her bir balonu ikinci bir su alikotu ile durulayın. Metal iyonlarını ve diğer organik molekülleri çöktürmek için numunelerin pH değerini bir molar potasyum hidroksit çözeltisi kullanarak 6,6 ile 6,8 arasına ayarlayın. Ardından, çökelekleri 2000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüj ederek uzaklaştırın.

Süpernatanları 40 mililitrelik cam tüplere aktarın ve tüp ağızlarını parafilm ile kapatıp süpernatanları dondurun, ardından parafilmin üzerine delikler açın. Tüm sıvıyı uzaklaştırmak için dondurulmuş süpernatanları liyofilize edin. Süpernatanlar kurutulduğunda, kalıntıyı üç mililitre kuru metanol ile çözün.

Tüpler iyice vortekslendikten sonra kapakları kapatılır ve ardından 2000 ×g hızında 10 dakika boyunca santrifüj edilir. Tuzların çöktürülmesi için süpernatantlar 3 mL'lik konik reaksiyon viyallerine aktarılır ve 45 °C'de hızlı bir vakumlu evaporatör veya hafif bir kuru nitrojen gazı akımı altında kurutuluncaya kadar buharlaştırılır. Buharlaştırma işlemi tamamlandığında, her bir viyale 100 µL geri kazanım standardı ve metil glutamin ile 1 mL su eklenir.

Ardından, türevlendirme işlemine başlamadan önce örnekleri dondurun. Standartları yazılı protokolde açıklandığı şekilde hazırlayın ve ardından hem örnekleri hem de standartları liyofilize edin. 32 mg/mL hidroksilamin hidroklorür ve 40 mg/mL içeren türevlendirme reaktifini hazırlayın.

Purin metanol içindeki dört dimetil aminopürin. Reaktif tüplerin her birine 300 µL türevlendirme reaktifi ekleyin, kapaklarını sıkıca kapatın ve iyice vorteksleyin. Kapalı tüpleri 35 dakika boyunca 75 ila 80 °C sıcaklıktaki bir su banyosuna yerleştirin.

Flakonları su banyosundan çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğutun. Ardından, üç mililitrelik reaktif flakonların her birine bir mililitre asetik anhidrit ekleyin, kapaklarını sıkıca kapatın ve vortekslenerek iyice karıştırın. Ardından, 75 ila 80 °C sıcaklıktaki su banyosunda 25 dakika boyunca ikinci bir inkübasyon gerçekleştirin.

Viyalleri su banyosundan çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğutun. Ayırma ve ölçüm işlemlerine başlamak için her tüpe 1,5 milliliters diklorometan ekleyin ve ardından vorteksleyin. Her viyale bir mililitre bir molar hidroklorik asit ekleyip iyice vorteksledikten sonra, iki faz ayrılana kadar çözeltilerin rahatsız edilmeden bekletilmesine izin verin.

Üstteki sulu fazı aspire ederek atın. Aynı yöntemle 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak organik fazı üç kez ekstrakte edin, ancak son yıkama adımında bir mililitre su kullanın. Üstteki sulu fazın tamamının uzaklaştırıldığından emin olmak için özel özen gösterin.

Final çözeltiyi 45 °C'de hızlı bir VAP kullanarak veya bir nitrojen gazı akımıyla kurutun, her örneği 300 µL etil asetat heksan içinde çözün ve küçük hacimli insert içeren iki mililitrelik kehribar rengi vidalı kapaklı viallere aktarıp sıkıca kapatın; ardından yazılı protokolde belirtildiği üzere DB five gibi ergimiş silika non-polar kapiler kolon kullanılan, alev iyonizasyon dedektörlü gaz kromatografisi ile kantifikasyon analizi yapın. Standart çalıştırma ve analiz sonrası, asetol glukozamin ve mu amik asit türevlerinin 250 °C'de, end metil glutaminin ise 270 °C'de elüe olması için taşıyıcı gaz akış hızını ayarlayın.

Gaz kromatografisi çalışmasının ardından, GC giriş sıcaklığı 250 °C'ye ayarlanmış bir otomatik örnekleyici kullanarak bir mikrolitrelik 30'a bir split enjeksiyon gerçekleştirin. Bu prosedürün son adımı olarak, yazılı protokolde tartışılan kromatografi ve spektrometri yöntemlerini kullanarak türev doğrulamasını yapın. Standart stoklardan ve bir toprak örneğinden elde edilen glukozamin ve üremik asit analizlerine ilişkin örnekler burada gösterilmiştir; glukozamin ve müik asidin yanı sıra, glukozaminin iki izomeri olan osamin ve galaktozamin de, uygulanan standartlerin kesin miktarlarına ve her iki iç standardın yanıt faktörlerine dayalı olarak bu yöntemle eş zamanlı olarak belirlenebilir.

Toprak örneklerindeki bu biyobelirteçlerin miktarı belirlenebilir. Türevlendirme sürecini kalitatif olarak izlemek için geri kazanım standardı da kullanılmıştır. Aldon nitril asetat, türevlenmiş glukozamin ve mūkik asit oluşum şemaları burada gösterilmiştir.

Bir numara nitril reaksiyonunu, iki numara ise asetilasyonu temsil etmektedir. Elektron iyonizasyonu sonucunda oluşan iyon fragmanlarının önerilen yapıları, çeşitli izotop eklemeleriyle hazırlanan numunelerin iyon spektrumları karşılaştırılarak incelenmiştir. Burada, glukozamin aldon nitril asetat türevinin baskın iyonunun farklı senaryolardaki kütle kayması gösterilmektedir.

Bu örnekte, işaretlenmemiş ajanların yanı sıra izotopik olarak işaretlenmiş asetik anhidrit ve izotopik olarak işaretlenmiş glukozamin kullanılarak hazırlık yapılmıştır. Kimyasal yapı üzerindeki yıldız, ağır izotop atomunu veya izotop grubunu temsil eder. Bu prosedür uygulanırken, türevlendirme sırasında kesinlikle susuz koşulların korunması gerektiğini unutmamak önemlidir.

Bu aşamada kullanılan organik çözücüler ile cam malzemelerin her ikisinin de kuru olması gerekir. Birçok tedarikçi susuz çözücüler satsa da, eldeki çözücüler magnezyum sülfat gibi kurutucu reaktifler içeren kolonlardan geçirilerek kurutulabilir. Bu prosedürü takiben, makro beauty'nin nasıl tepki verdiği, karbon veya azotun topraklarda nasıl döndüğü ve biriktiği gibi ek soruları, gelişim sonrası canlı ve ölü makro s'leri ayırt ederek yanıtlamak amacıyla oran kütle spektrometrisi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu teknik, makro ekoloji, toprak biyolojisi ve kimyası alanındaki araştırmacıların, doğal veya yönetilen karasal sistemlerdeki toprak organik maddesine makro katkıyı ve karbon tutulumunu keşfetmelerinin yolunu açmıştır.