Name: Toprak Mikrobiyal Kalıntı Tayini için Aldononitrile Asetat türevlendirilmiş Glukozamin ve Muramic Asit GC tabanlı Algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Öğrenin toprak mikrobiyal kalıntı tayini için aldononitril asetat türevlendirilmiş glukozamin ve muramik asit GC analizi. Bu yöntem, amino şekerlerin asit hidrolizi, izolasyonu ve türevlendirilmesi adımlarını içerir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma DOE Great Lakes Biyoenerji Araştırma Merkezi (DE-FC02-07ER64494 Bilim DOE BER ofis) bağışları ile desteklenmiştir. Biz Dr Xudong Zhang ve protokol tamamlanmasına yardımcı teknik tartışmalar ve değerli yorumlarınız için kendi grubunun üyelerine minnettarız.

1. Numune Hazırlama ve Asit Ekstraksiyon <ol><li> Freeze-kuru toprak örnekleri alan koleksiyon sonra. </li><li> Bir bilyalı değirmen, toprak değirmeni veya bir havanda kullanarak toprak örnekleri eziyet ve homojenize. </li><li> 25 ml&#39;lik hidroliz balona toprak örnekleri (&gt; 0.3 mg N içeren) tartılır. </li><li> Her hidroliz balona 10 ml 6M HCl ekleyin, sıkı N 2 şişe gaz ve kap doldurun. </li><li> Otomatik zamanlayıcı anahtarı kullanarak 8 saat boyunca 105 ° küvözde C&#39;de hidroliz. </li></ol> 2. Örnek Arıtma <ol><li> Inkübatör gelen şişeler çıkarın; oda sıcaklığına kadar soğutulur. </li><li> Dönen karıştırın, her balona 100 mcL iç standart myo-inositol (suda 1 mg ml -1) ekleyin. </li><li> ST / NS 24 / istikrar için plastik bardaklar ayarlanan 40 eklem, 200 ml armut şeklinde matara drene plastik huni ayarlayın. </li><li> Katlama Whatman # 2 Kalitatif Circles (11 cm çapında) mahalle ve huni içine setine. </li&gt; <li> Swirl her hidroliz şişesi, ve (daha fazla su ~ 3 mL Her balona durulayın olabilir) filtre hunisi içine şerbeti dökün. </li><li> ~ 45 ° C&#39;de, vakum uygulanarak bir döner buharlaştırıcı kullanılarak Filtrat kuruyana. </li><li> 3 ~ 5 mL su (ve istenirse ultrasonik banyoda kullanan) ile her bir armut şişesi kurutulmuş tortu tekrar süspansiyon, ve bir 40 mL Teflon tüpüne dökülür; suyun ikinci bir kısım ile birlikte şişeye durulanır. </li><li> 6.8 çökelti metal iyonları ve diğer organik molekülleri 1M KOH çözeltisi kullanılarak - 6.6 pH ayarlayın. </li><li> 10 dakika boyunca 2000 rcf santrifüj ile tortulaşır çıkarın. </li><li> Bir 40 mL cam tüp içine dökülür süpernatan, -20 azından tüp parafilm olan açıklığı, dondurularak ° C kapsayan, daha sonra parafilm delikler karıştırmak. </li><li> Tüm sıvı kaldırmak için dondurulmuş süpernatant dondurun-kurulayın. </li><li> , 3 ml kuru metanol ile Kalıntı çözünmesi (ve istenirse ultrasonik banyoda kullanmak) iyice vorteks; kap tüpü ve sonra getirilmesi için 10 dakika süreyle 2000 rcf santrifüjlenirtuzları dışarı. </li><li> Bir 3 mL konik bir reaksiyon şişesi için süpernatan aktarılması; 45 ° C (veya arzu edildiği takdirde, kuru azot gazı akımı altında yumuşak) azından RapidVap makine tarafından kuruyana kadar buharlaştınlmıştır. </li><li> Her flakon için, 100 uL kurtarma standart N-metil-(suda 1 mg ml -1) ve 1 mL H 2 O eklemek -20 flakon parafilm ağızlara, donma ° C kapsayacak, parafilm delebilir ve sonra kuru dondurma . </li><li> Standartları hale: 100 uL muramic asit (metanol içerisinde 0.5 mg mL -1), 100 uL glukozamin (su içinde 1 mg mL -1), 100 uL myo-inositol (su içinde 1 mg mL -1), 100 uL N-ekleme metilglukamin (su içinde 1 mg mL -1), ve 1 ml H2O, parafilm herbir şişe, -20 ° C&#39;de dondurulmuş, daha sonra dondurularak kuru, parafilm perfore. </li></ol> 3. Türevlendirme <ol><li> 32 mg mL -1 hidroksilamin hidroklorür ve 40 mg mL -1 4-dimetilamino-py içeren türevlendirme reaktifi hazırlamakin ridine piridin-metanol (4:1 v / v). </li><li> Kapağı sıkıca ve iyice girdap, reactivials her birine türevlendirme reaktifi 300 uL ekleyin. </li><li> 35 dakika boyunca 75-80 ° C su banyosunda (de herhangi bir su şişeleri girmesine izin vermemek için flakon mühürlü) içinde şişeleri koyun. </li><li> Su banyosu, ve oda sıcaklığında serin şişeleri çıkarın. </li><li> 3 mL reactivials, sıkı bir şekilde kap, ve iyice vorteks her birine 1 mL asetik anhidrit ekleme, daha sonra 75-80 dakika boyunca 25 ° C&#39;de su banyosu içinde yeniden ısıtma. </li><li> Su banyosu, ve oda sıcaklığında serin şişeleri çıkarın. </li></ol> 4. Ayırma ve Ölçüm <ol><li> Her flakon, kapağı sıkıca ve iyice girdabına 1.5 mL diklorometan ekleyin. </li><li> Çözümler iki sözcük ayrı kadar rahatsız oturup bekleyin Her flakon için, kapağı sıkıca ve iyice girdabına 1 ml 1M HCl ekleyin, aspire ve 1000 uL pipet kullanarak üst (sulu) faz atın. </li><li> Aynı fashion, organik faz 3 kez ayıklamak 1 ml H 2 O ile (son yıkama adımla, sulu üst aşaması tüm kaldırıldı sağlamak için özel dikkat). </li><li> 45 de RapidVap kullanarak nihai çözelti kurumaya ° C (ya da kuru istenirse azot gazı kullanarak). </li><li> 300 uL, etil asetat-hekzan (1:1 v / v) ve küçük hacimli ve sıkı bir şekilde uç kapaklı 2 mL amber vida kapaklı küçük şişelerden transfer çözünmüştür. </li><li> ; Sabit faz% 5-fenil,% 95 metil-polisiloksan (DB-5 veya eşdeğeri) hidrojen ile 30 m uzunluğunda, 0.25 mm 0.25 um film kalınlığı: ölçümü için, erimiş silika apolar kapiler kolon kullanılarak GC-FID tarafından analiz veya helyum taşıyıcı gaz olarak, 0.5 mL min -1 sabit debide. Kromatografisi prim &quot;etkisiz&quot; fazları ve hidrojen taşıyıcı gaz daha iyi, ama daha yaygın çeşitleri ve helyum ile kabul edilebilir. Dedektör 300 ayarlar ve bunlar ° C; 400 mL dak -1 hava ve 30 mL dak -1 nitrojen ve hem dehidrojen makyaj gazlar. Enjeksiyon ve fırın parametreler şunlardır: ° C, 250 GC girişi ile 1 uL bölünmüş enjeksiyon (30:1); ilk fırın sıcaklığı 120 ° C; 1 dakika tutun; 10 fırın sıcaklığı artırmak ° C min. -1 ila 250 ° C; 2.5 dk tutun;. 270 rampa ° C ile 20 ° C min -1; 2 dakika tutun; 290 rampa ° C ile 20 ° C min -1, 5 dakika tutun. Taşıyıcı gaz akış hızını ayarlama böylece 250 ° C&#39;de inositol, glukozamin ve muramic asit türevleri elüt edilmesi, ve 270 de N-metilglukamin elutes ° C. </li></ol> 5.. Türev Doğrulama <ol><li> Moleküler iyon tanımlamak ve türevinin moleküler ağırlıkların belirlenmesi için yumuşak bir iyonizasyon LC-ESI-TOF-MS kullanabilir. </li><li> Türevin hedeflenen iyonları araştırmak için duyarlılık geliştirme için GC-EI-MS-SIM veya GC-EI-MSMS kullanın. </li><li> Türevlerinin hazırlanması için birden çok izotopik olarak etiketlenmiş bir reaktif kullanmak ve sonra kütle kayma kullanımıMS olanlar izotopik olarak etiketlenmiş türevlerinin molekül iyonu ve iyonu parçacıkları incelemek. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Yöntemin protokolü esas olarak dört adımları ihtiva etmektedir: sindirimi asit, Örnek saflaştırma, türevlendirme ve GC tayini (Şekil 1). Glukozamin ve standart stoktan ve bir toprak örneğinden muramic asit analizi için bir örnek, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Glukozamin ve muramic asit, mannosamine ve galaktosamin (glukozamin iki izomerler) yanı sıra, aynı zamanda yöntemi kullanılarak eş zamanlı olarak tespit edilebilir. İç standart myo-inositol ile ilgili standartların yanıt faktörlere dayanarak, toprak örneklerinde bu biyobelirteçleri ölçmek olabilir. Kurtarma standart nitelik türevlendirme sürecini izlemek üzere kullanılmıştır. Aldononitrile asetat türevlendirilmiş glukozamin ve muramic asit oluşumu için şemalar Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir </strong&gt;. Türevlerinin önerilen yapılar duyarlılığı geliştirme, ya da yumuşak iyonizasyon LC-ESI-TOF-MS 8 için GC-EIMS-SIM ile belirlenmiştir; elektron iyonizasyon üzerinde oluşmuş iyon parçalarının önerilen yapıları arasında iyon spektrumu karşılaştırarak incelenmiştir örnekleri, çeşitli izotop birleşmeleri 11 ile hazırlanır. Şekil 4, baskın iyon kütle kayması göstermektedir non-etiketli ajanlar, D-asetik anhidrit ve U -13 C-glukosamin ile hazırlanan üç senaryo, in aldononitrile asetat türevlendirilmiş glukozamin m / z 187. Diğer bilgi ve açıklamalar bizim son yayınları 8, 11 sevk edilebilir. Bu strateji, türev kimya okumak için bir model olarak hizmet verebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig1.jpg" /> Glukozamin analizi ve toprak muramic asit protokolü Şekil 1. Ölçüm akış şemasıörnekleri. Asit sindirim, Arıtma, türetme ve GC belirlenmesi: protokolü, 4 adımları içerir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig2.jpg" /> Şekil 2. Standartlara ve toprak için inositol, glukozamin, muramic asit, mannosamine, galaktosamin ve metilglucamin ve aldononitrile asetatlar GC-FID kromatogramları. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig3.jpg" /> Şekil 3. Aldononitrile asetat türevlendirilmiş glukozamin ve muramic asit oluşumu için Şema. 1 numara nitril reaksiyonu temsil eder. 2 numaralı asetilasyonu temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3767/3767fig4_lg.jpg"><img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig4.jpg" /></a> Şekil 4. Baskın iyon structur ile ilişkili aldononitrile asetat türevlendirilmiş glukozamin Kütle spektrumlarıEI modu altında es (A) non-etiketli maddeleri ile hazırlanmıştır, (B), D-asetik anhidrit, (C) U -13 C-glukosamin. Yıldız ağır izotop atomu veya izotop grubu temsil eder.

<ol><li>Zelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+patterns+of+phospholipids+and+lipopolysaccharides+in+the+characterisation+of+microbial+communities+in+soil%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+and+Fertility+of+Soils%22%5BJournal%5D)">Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review.</a> Biology and Fertility of Soils. 29, 111-129 (1999).</li>
<li>Kirk, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+studying+soil+microbial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of studying soil microbial diversity.</a> Journal of Microbiological Methods. 58, 169-188 (2004).</li>
<li>Joergensen, R. G., Emmerling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+evaluating+human+impact+on+soil+microorganisms+based+on+their+activity%2C+biomass%2C+and+diversity+in+agricultural+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Nutrition+and+Soil+Science%22%5BJournal%5D)">Methods for evaluating human impact on soil microorganisms based on their activity, biomass, and diversity in agricultural soils.</a> Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 169, 295-309 (2006).</li>
<li>Guggenberger, G., Frey, S. D., Six, J., Paustian, K., Elliott, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+and+fungal+cell-wall+residues+in+conventional+and+no-tillage+agroecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Science+Society+of+America+Journal%22%5BJournal%5D)">Bacterial and fungal cell-wall residues in conventional and no-tillage agroecosystems.</a> Soil Science Society of America Journal. 63, 1188-1198 (1999).</li>
<li>Amelung, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmelung%2C+W+%22Assessment+Methods+for+Soil+Carbon%22">Assessment Methods for Soil Carbon</a>. Lal, R., Kimble, J. M., Follett, R. F., Stewart, B. A. , CRC/Lewis Publishers. Boca Raton, FL. 233-270 (2001).</li>
<li>Guerrant, G. O., Moss, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+monosaccharides+as+aldononitrile%2C+O-methyloxime%2C+alditol%2C+and+cyclitol+acetate+derivatives+by+gas-chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime, alditol, and cyclitol acetate derivatives by gas-chromatography.</a> Analytical Chemistry. 56, 633-638 (1984).</li>
<li>Zhang, X., Amelung, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+chromatographic+determination+of+muramic+acid%2C+glucosamine%2C+mannosamine%2C+and+galactosamine+in+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine, mannosamine, and galactosamine in soils.</a> Soil Biology and Biochemistry. 28, 1201-1206 (1996).</li>
<li>Liang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+molecular+ion+structure+for+aldononitrile+acetate+derivatized+muramic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Investigation of the molecular ion structure for aldononitrile acetate derivatized muramic acid.</a> Journal of Microbiological Methods. 86, 224-230 (2011).</li>
<li>He, H., Xie, H., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+GC%2FMS+technique+to+assess+15N+and+13C+incorporation+into+soil+amino+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel GC/MS technique to assess 15N and 13C incorporation into soil amino sugars.</a> Soil Biology and Biochemistry. 38, 1083-1091 (2006).</li>
<li>Glaser, B., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compound-specific+delta+13C+analysis+of+individual+amino+sugars+-+a+tool+to+quantify+timing+and+amount+of+soil+microbial+residue+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Compound-specific delta 13C analysis of individual amino sugars - a tool to quantify timing and amount of soil microbial residue stabilization.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 19, 1409-1416 (2005).</li>
<li>Liang, C., Balser, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+characterization+of+amino+sugar+aldononitrile+acetate+derivatives+used+for+isotope+enrichment+assessment+of+microbial+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric characterization of amino sugar aldononitrile acetate derivatives used for isotope enrichment assessment of microbial residues.</a> Soil Biology and Biochemistry. 42, 904-909 (2010).</li>
<li>Liang, C., Pedersen, J. A., Balser, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminoglycoside+antibiotics+may+interfere+with+microbial+amino+sugar+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Aminoglycoside antibiotics may interfere with microbial amino sugar analysis.</a> Journal of Chromatography A. 1216, 5296-5301 (2009).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Aldononitrile asetat türevlendirilmiş glukozamin ve muramic asit analizi için sunulmuş GC-bazlı yöntem toprak ekstrakte bu amino şekerler, ölçmek için göreceli olarak hızlı bir yöntem sağlar. Türevleri kimyasal açıdan kararlı olan ve bir analize tespit edilebilir. Yöntemi toprak örnekleri ile sınırlı değildir, ve non-toprak matris örnekler için basitleştirilmiş olabilir. Bu yöntemde kullanılan vakum pompası aside dirençli olması için yapılmıştır. Biz daha 6M HCI çözümler buharlaşan zaman pom...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Muramic asit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2503-25mg </td></tr><tr><td> D-(+)-glukosamin hidroklorür </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1514-100G </td></tr><tr><td> N-metil-D-glukamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2004-500G </td></tr><tr><td> Myo-inositol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A307003G025 </td></tr><tr><td> Metanol (kuru) </td><td> Acros organik </td><td> AC326950010 </td></tr><tr><td> 4-dimetilamino-piridin </td><td> Acros organik </td><td> AC148270050 </td></tr><tr><td> Etil asetat </td><td> VWR International </td><td> BJGC100-4 </td></tr><tr><td> Hydroxlamine hidroklorür </td><td> Fisher Scientific </td><td> H330-100 </td></tr><tr><td> Piridin </td><td> Fisher Scientific </td><td> P368-500 </td></tr><tr><td> Asetik anhidrit </td> &lt;td&gt; Fisher Scientific </td><td> A10-100 </td></tr><tr><td> Diklorometan (Metilen klorür) </td><td> Fisher Scientific </td><td> D37&#39;ye-500 </td></tr><tr><td> Hekzan </td><td> Fisher Scientific </td><td> H303-4 </td></tr><tr><td> Hidroklorik asit (6M) </td><td> Fisher Scientific </td><td> S456-4 </td></tr><tr><td> Hidroksilamin hidroklorür -15 N </td><td> Simge hizmetleri </td><td> IN5280 </td></tr><tr><td> Asetik anhidrid -2 H (D 6 C 4 O 3) </td><td> Acros organik </td><td> AC174670050 </td></tr><tr><td> D-glukoz-U -13 C </td><td> Cambridge izotop laboratuvarı </td><td> CLM-1396-1 </td></tr><tr><td> Amonyum sufate -15 N </td><td> Cambridge izotop laboratuvarı </td><td> NLM-713-1 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Tip </td></tr><tr><td> Rapid-Vap </td&gt; <td> Labconco </td><td> 790002 </td></tr><tr><td> Vakum pompası </td><td> KNF Neuberger </td><td> D-79112 </td></tr><tr><td> Hidroliz şişesi </td><td> Fisher Scientific </td><td> 06 423A </td></tr><tr><td> Türevlendirme microvial </td><td> Fisher Scientific </td><td> 06-100E </td></tr><tr><td> GC </td><td> Hewlett-Packard </td><td> 6890 </td></tr><tr><td> MS </td><td> Hewlett-Packard </td><td> 5972 </td></tr><tr><td> LC-ESI-TOF-MS </td><td> Agilent </td><td> Agilent 1200 serisi HPLC sistemi Agilent LC / MSD-TOF birleştiğinde </td></tr></tbody></table>

toprak mikrobiyal kalıntı tayini için aldononitrile asetat türevlendirilmiş glukozamin ve muramic asit gc tabanlı algılama

GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

Karakterize eden mikroorganizmalar nicel yaklaşımlar ekosistemler içindeki mikrobik durumu ve işlevini daha geniş bir anlayış için çok önemlidir. Mikrobiyal analiz için güncel yaklaşımlar, geleneksel laboratuvar kültür-bağımlı teknikleri ve doğrudan çıkarma ve bazı biyo 1, 2 belirlenmesi esasına dayanan bu iki içerir. Toprak yaşayan mikrobiyal türlerin çeşitliliği arasında çok az kültüre, dolayısıyla kültür-bağımlı yöntemleri önemli önyargıları, biyomarker analizinde eksik bir sınırlama tanıtmak edilebilir. Glukozamin, mannosamine, galaktosamin ve muramic asit de toprak sistemleri 3 en önemli unsurlar olan bu glukozamin (en bol) ve muramic asit (benzersiz bakteri hücre dan), canlı ve ölü mikrobiyal kütle hem tedbirler olarak hizmet edilmiştir , 4. Ancak, analiz konusunda bilgi eksikliği bilimsel emsalleri arasında geniş yaygınlaşması kısıtlar. Tüm exi arasındaaldononitrile için, türevlendirme analitik yöntemler sting GC tabanlı analizi takip asetatlar optimum hassas dengeleme açısından iyi bir seçenek olarak ortaya çıkmıştır, hassasiyet, basitlik, numune saklama 5 üzerinde iyi kromatografik ayırma ve kararlılık. Burada, aldononitrile asetatlar onların dönüşüm sonra topraktan glukozamin ve muramic asit güvenilir ve nispeten basit bir analizi için detaylı bir protokolü sunarız. Protokolü, dört adımdan oluşmaktadır: asit sindirim, örnek arıtma, türevlendirme ve GC belirlenmesi. Adım adım prosedürü eski yayınları 6, 7 göre ayarlanır. Buna ek olarak, yapısal olarak elektron iyonizasyon üzerinde oluşmuş türevi ve iyonu parçacıkları moleküler iyon doğrulamak için bir strateji sunulmaktadır. Biz aldononitrile asetat türevlendirilmiş glukozamin ve mur moleküler ağırlıkların belirlenmesi için GC-MS-EI-SİM, LC-ESI-TOF-MS ve izotopik olarak etiketlenmiş bir reaktif uygulananAmic asit; her türevleri 8 iyonu parçacıkları araştırmak için iyon spektrumunda izotop etiketli türevlerinin kütle kayma kullanılır. Teorik aydınlatılması ek olarak, türev ve iyonu parçacıkları moleküler iyon doğrulama δ 13 C ya da biyokimyasal çalışmalarda 9, 10, bu biyolojik iyon parçaları araştırmacılar kullanılarak yararlı olacaktır.

Biz, glukozamin ve toprak ekstrakte muramic asit aldonitrile asetat türevlerinin GC-bazlı analizi için bir yöntem tarif protokolü. Kimyasal mekanizmasının aydınlatılması için, biz de türev ve elektron iyonizasyon halinde oluşan iyon parçalarının yapısını onaylamak için bir strateji sunmak.

Toprak Mikrobiyal Kalıntı Tayini için Aldononitrile Asetat türevlendirilmiş Glukozamin ve Muramic Asit GC tabanlı Algılama

Mikroorganizmaları karakterize etmeye yönelik nicel yaklaşımlar, ekosistemler içindeki mikrobiyal durumun ve işlevin daha geniş bir çerçevede anlaşılması için kritik öneme sahiptir.

Bu videonun genel amacı, topraklardan ekstrakte edilen glukozamin ve muiik asidin Aldon nitril asetat türevlerinin GC tabanlı analizine yönelik ayrıntılı bir açıklama sunmaktır. Süreç, organik polimerlerin parçalandığı ve glukozamin ile muiik asidin serbest bırakıldığı asit sindirimi ile başlar. Ardından, monomer amino şekerler karışım çözeltisinden izole edilir ve saflaştırılır.Bunu, bu amino şekerleri gaz kromatografisi tabanlı analiz için uçucu aldon nitril asetatlara dönüştüren Türevlendirme işlemi takip eder. Prosedürün son adımı, sıvı-sıvı ekstraksiyonu ve GC tayinidir. Nihayetinde, alev iyonizasyon dedektörlü GC ile myo ve asetol ile metil glutamin standartları arasında elüye olan aldon nitril asetat amino şekerlerinin baz hattı ayrımını gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin diğer yöntemlere göre temel avantajı; hassasiyet, basitlik, iyi kromatik grafik ayrımı ve numune saklama sırasındaki stabiliteyi optimal şekilde dengelemesidir. Bu yöntem, SSE mikroorganizmalarının stabil toprak karbon havuzlarına katkısı gibi küresel karbon döngüsü alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, topraklardaki mikrobiyal detritus birikimi hakkında içgörü ve bilgi sağlayabilmesinin yanı sıra okyanus sistemleri, biyolojik dokular ve hatta dünya dışı numuneler gibi diğer matrislere de uygulanabilir.Bu protokole başlamak için, arazi toplama işleminin ardından toprak örneklerini dondurarak kurutun, bir bilyalı değirmen toprak öğütücü veya havan ve havan eli kullanarak toprak örneklerini öğütün ve homojenize edin. Öğütülmüş toprak örneklerini 25 mililitrelik hidroliz balonlarına tartın. Her bir hidroliz balonuna 10 mililitre altı molar hidroklorik asit ekleyin ve sıkıca kapatmadan önce azot gazı ile doldurun.Bir inkübatörde 105 °C'de sekiz saat boyunca hidroliz edin. Otomatik bir zamanlayıcı anahtar kullanarak flaskları inkübatörden çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğutun.Her bir balona 100 µL iç standart myo asetol ekleyin. Plastik hunileri 200 mL armut biçimli balonlara boşalacak şekilde kurup çalkalayarak karıştırın. Stabilite sağlamak için standart konik uçlu 24 40 rodajlı cam eklemleri plastik bardaklar üzerine yerleştirin.2 numaralı Watman kalitatif süzgeç kağıtlarını dörtte bir şeklinde katlayıp hunilere yerleştirin. Her bir hidroliz balonjosunu çalkalayın ve süspansiyonu huniye boşaltın. Her bir örneği filtrelemek için, yaklaşık 45 °C'de vakum uygulayarak döner evaporatör yardımıyla filtratı kurutun.Her bir çift balondan elde edilen kurutulmuş kalıntıyı üç ila beş mililitre su ile süspanse edin ve 40 mililitrelik bir Teflon tüpe aktarın. Her bir balonu ikinci bir su alikotu ile durulayın. Metal iyonlarını ve diğer organik molekülleri çöktürmek için numunelerin pH değerini bir molar potasyum hidroksit çözeltisi kullanarak 6,6 ile 6,8 arasına ayarlayın. Ardından, çökelekleri 2000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüj ederek uzaklaştırın.Süpernatanları 40 mililitrelik cam tüplere aktarın ve tüp ağızlarını parafilm ile kapatıp süpernatanları dondurun, ardından parafilmin üzerine delikler açın. Tüm sıvıyı uzaklaştırmak için dondurulmuş süpernatanları liyofilize edin. Süpernatanlar kurutulduğunda, kalıntıyı üç mililitre kuru metanol ile çözün.Tüpler iyice vortekslendikten sonra kapakları kapatılır ve ardından 2000 ×g hızında 10 dakika boyunca santrifüj edilir. Tuzların çöktürülmesi için süpernatantlar 3 mL'lik konik reaksiyon viyallerine aktarılır ve 45 °C'de hızlı bir vakumlu evaporatör veya hafif bir kuru nitrojen gazı akımı altında kurutuluncaya kadar buharlaştırılır. Buharlaştırma işlemi tamamlandığında, her bir viyale 100 µL geri kazanım standardı ve metil glutamin ile 1 mL su eklenir.Ardından, türevlendirme işlemine başlamadan önce örnekleri dondurun. Standartları yazılı protokolde açıklandığı şekilde hazırlayın ve ardından hem örnekleri hem de standartları liyofilize edin. 32 mg/mL hidroksilamin hidroklorür ve 40 mg/mL içeren türevlendirme reaktifini hazırlayın.Purin metanol içindeki dört dimetil aminopürin. Reaktif tüplerin her birine 300 µL türevlendirme reaktifi ekleyin, kapaklarını sıkıca kapatın ve iyice vorteksleyin. Kapalı tüpleri 35 dakika boyunca 75 ila 80 °C sıcaklıktaki bir su banyosuna yerleştirin.Flakonları su banyosundan çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğutun. Ardından, üç mililitrelik reaktif flakonların her birine bir mililitre asetik anhidrit ekleyin, kapaklarını sıkıca kapatın ve vortekslenerek iyice karıştırın. Ardından, 75 ila 80 °C sıcaklıktaki su banyosunda 25 dakika boyunca ikinci bir inkübasyon gerçekleştirin.Viyalleri su banyosundan çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğutun. Ayırma ve ölçüm işlemlerine başlamak için her tüpe 1,5 milliliters diklorometan ekleyin ve ardından vorteksleyin. Her viyale bir mililitre bir molar hidroklorik asit ekleyip iyice vorteksledikten sonra, iki faz ayrılana kadar çözeltilerin rahatsız edilmeden bekletilmesine izin verin.Üstteki sulu fazı aspire ederek atın. Aynı yöntemle 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak organik fazı üç kez ekstrakte edin, ancak son yıkama adımında bir mililitre su kullanın. Üstteki sulu fazın tamamının uzaklaştırıldığından emin olmak için özel özen gösterin.Final çözeltiyi 45 °C'de hızlı bir VAP kullanarak veya bir nitrojen gazı akımıyla kurutun, her örneği 300 µL etil asetat heksan içinde çözün ve küçük hacimli insert içeren iki mililitrelik kehribar rengi vidalı kapaklı viallere aktarıp sıkıca kapatın; ardından yazılı protokolde belirtildiği üzere DB five gibi ergimiş silika non-polar kapiler kolon kullanılan, alev iyonizasyon dedektörlü gaz kromatografisi ile kantifikasyon analizi yapın. Standart çalıştırma ve analiz sonrası, asetol glukozamin ve mu amik asit türevlerinin 250 °C'de, end metil glutaminin ise 270 °C'de elüe olması için taşıyıcı gaz akış hızını ayarlayın.Gaz kromatografisi çalışmasının ardından, GC giriş sıcaklığı 250 °C'ye ayarlanmış bir otomatik örnekleyici kullanarak bir mikrolitrelik 30'a bir split enjeksiyon gerçekleştirin. Bu prosedürün son adımı olarak, yazılı protokolde tartışılan kromatografi ve spektrometri yöntemlerini kullanarak türev doğrulamasını yapın. Standart stoklardan ve bir toprak örneğinden elde edilen glukozamin ve üremik asit analizlerine ilişkin örnekler burada gösterilmiştir; glukozamin ve müik asidin yanı sıra, glukozaminin iki izomeri olan osamin ve galaktozamin de, uygulanan standartlerin kesin miktarlarına ve her iki iç standardın yanıt faktörlerine dayalı olarak bu yöntemle eş zamanlı olarak belirlenebilir.Toprak örneklerindeki bu biyobelirteçlerin miktarı belirlenebilir. Türevlendirme sürecini kalitatif olarak izlemek için geri kazanım standardı da kullanılmıştır. Aldon nitril asetat, türevlenmiş glukozamin ve mūkik asit oluşum şemaları burada gösterilmiştir.Bir numara nitril reaksiyonunu, iki numara ise asetilasyonu temsil etmektedir. Elektron iyonizasyonu sonucunda oluşan iyon fragmanlarının önerilen yapıları, çeşitli izotop eklemeleriyle hazırlanan numunelerin iyon spektrumları karşılaştırılarak incelenmiştir. Burada, glukozamin aldon nitril asetat türevinin baskın iyonunun farklı senaryolardaki kütle kayması gösterilmektedir.Bu örnekte, işaretlenmemiş ajanların yanı sıra izotopik olarak işaretlenmiş asetik anhidrit ve izotopik olarak işaretlenmiş glukozamin kullanılarak hazırlık yapılmıştır. Kimyasal yapı üzerindeki yıldız, ağır izotop atomunu veya izotop grubunu temsil eder. Bu prosedür uygulanırken, türevlendirme sırasında kesinlikle susuz koşulların korunması gerektiğini unutmamak önemlidir.Bu aşamada kullanılan organik çözücüler ile cam malzemelerin her ikisinin de kuru olması gerekir. Birçok tedarikçi susuz çözücüler satsa da, eldeki çözücüler magnezyum sülfat gibi kurutucu reaktifler içeren kolonlardan geçirilerek kurutulabilir. Bu prosedürü takiben, makro beauty'nin nasıl tepki verdiği, karbon veya azotun topraklarda nasıl döndüğü ve biriktiği gibi ek soruları, gelişim sonrası canlı ve ölü makro s'leri ayırt ederek yanıtlamak amacıyla oran kütle spektrometrisi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Bu teknik, makro ekoloji, toprak biyolojisi ve kimyası alanındaki araştırmacıların, doğal veya yönetilen karasal sistemlerdeki toprak organik maddesine makro katkıyı ve karbon tutulumunu keşfetmelerinin yolunu açmıştır.

gc-based-detection-aldononitrile-acetate-derivatized-glucosamine

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

13 C-izotop etiketleme çeşitli türleri için mikroorganizmaların hücre merkezi metabolizma belirlenmesi için yararlı bir tekniktir. Hücreleri belirli bir substrat ile etiketli kültüre edildikten sonra, GC-MS ölçüm aminoasittir benzersiz etiketleme desen dayalı işlevsel metabolik yollar ortaya çıkarabilir.

Sayesinde Metabolik Pathway Onay ve Keşif 13</supAminoasittir> C-etiketleme

Burkholderia sartisoli RP037-mChe ile bir bütün hücre bioreporter deney, bir su doymamış model sisteminde hava dolu gözenekler köprü misel aktif taşıma sonra bakteriyel indirgenmesi için uygun bir organik kirlilik (örneğin, floren) fraksiyonları tespit etmek için geliştirilmiştir.

A Whole Hücre Bioreporter Yaklaşımı Su Doymamış Sistemleri Organik Kontaminantların Taşıma ve Biyoyararlanımını Değerlendirmek için

Burada, bakteri sporu çimlenmesi sırasında indirgeyici şekerlerin varlığını tespit etmek için kolorimetrik bir testi açıklıyoruz.

Bakteriyel Spor Filizlenmesinin sırasında Cortex Fragments algılama

Bu iletişim kuralı metabolizma birden çok besin kaynaklarının nicelik ve kapsamlı bir şekilde araştırmak için deneysel bir işlem açıklanır. İzotopik izleyici deneyleri ve analitik bir yordam, bir kombinasyonuna göre bu iş akışı, tüketilen besin kaderi ve molekülleri synthetized metabolik kökenli mikroorganizmalar tarafından belirlenecek sağlar.

Birden çok besin kaynaklarının mikrobiyal metabolizma araştırmaya izotopik izleyici deneyler kombinasyonuna göre iş akışı

Biyosürfaktan üreten mikropların taranması ve tanımlanmasında yer alan yöntemleri gösteriyoruz. Biyosürfaktan maddelerin kromatografik karakterizasyonu ve kimyasal olarak tanımlanması, biyosürfaktan kalıntı yağ geri kazanımının arttırılmasında endüstriyel uygulanabilirliğinin belirlenmesi için yöntemler de sunulmaktadır.

Biyosürfaktanların Kombinasyonu Kullanılarak Geliştirilmiş Yağ Geri Kazanımı

Açık arama, daha önce bilinmeyen glikan bileşimleriyle süslenmiş glikopeptidlerin tanımlanmasını sağlar. Bu makalede, Acinetobacter baumannii'yi model olarak kullanan bakteriyel örnekler için açık arama ve müteakip glikan odaklı glikopeptid aramaları yapmak için kolaylaştırılmış bir yaklaşım sunulmuştur.

Acinetobacter baumannii O-bağlantılı Glikopeptitlerlerin Tanımlanması için Açık Arama Tabanlı Yaklaşımların Uygulanması

Bu protokol, sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometrisi kullanılarak analiz edilmeden önce trikloroasetik asit (TCA) protein çökeltmesi ve asit hidrolizi yoluyla biyolojik matrislerden protein olmayan amino asitlerin ekstraksiyonunu açıklamaktadır.

Sıvı Kromatografisi-Tandem Kütle Spektrometrisi Analizi için Siyanobakterilerden Protein Dışı Amino Asitlerin Ekstraksiyonu

Burada, hayvansal kaynaklı ilaçlarda trimetilamin (TMA) tayini için uygun bir headspace gaz kromatografisi-tandem dört kutuplu kütle spektrometrisi (HS-GC-MS/MS) yöntemi açıklanmaktadır. Protokol, numune ön işlemini, üst boşluk tedavisini, analiz koşullarını, metodolojik doğrulamayı ve hayvansal kaynaklı ilaçlarda TMA'nın belirlenmesini içerir.

Headspace Gaz Kromatografisi-Tandem Dört Kutuplu Kütle Spektrometrisi ile Hayvan Kaynaklı Tıpta Trimetilamin Tayini için Geliştirilmiş Bir Teknik

Bu protokol, su ve lipit açısından zengin balık dokularından geosmin ve 2-metilizoborneolün ekstraksiyonu için tam otomatik bir iş akışı sunar. Yöntem, bu moleküllerin koku eşiklerine ulaşmadan önce erken tespit edilmesini sağlar. Bir su ürünleri yetiştiriciliği ortamından temsili veriler sağlanır.

Yüksek Kapasiteli Sorptif Ekstraksiyon Probları ve GC-MS Kullanılarak Su ve Balıklarda Geosmin ve 2-Metilizoborneolün Ekstraksiyonu ve Tespiti

Mikroglial hücrelerden saflaştırılmış mitokondrinin hazırlanması, N-glikan salınımı için mitokondriyal proteinlerin izolasyonu ve yüksek çözünürlüklü doğru kütle analizörü kütle spektrometresine bağlı kızılötesi matris destekli lazer desorpsiyon elektrosprey iyonizasyonu kullanılarak hücre altı, mitokondriyal glikanların hızlı tespiti için bir protokol geliştirilmiştir.

Glikan Analizi için Microglia'dan Mitokondriyal Hazırlık

Öğrenin toprak mikrobiyal kalıntı tayini için aldononitril asetat türevlendirilmiş glukozamin ve muramik asit GC analizi. Bu yöntem, amino şekerlerin asit hidrolizi, izolasyonu ve türevlendirilmesi adımlarını içerir.

Toprak Mikrobiyal Kalıntı Tayini için Aldononitrile Asetat türevlendirilmiş Glukozamin ve Muramic Asit GC tabanlı Algılama

Daha fazla video keşfet