Kabul edilmiş Transfer ve antijenik Challenge Deneysel Otoimmün Encephalomyelitis (EAE) Dayanıklı Fare Suşlarında yanıtsızlık Aşmak

Bu prosedürün genel amacı, EAE indüksiyonuna dirençli olduğu bilinenler de dahil olmak üzere, herhangi bir fare suşunda tutarlı ve kolay bir şekilde EAE indüklemektir. Bu işlem, öncelikle donör farelerin, komple Freund adjuvanı ile emülsifiye edilmiş miyelin spesifik proteinler veya peptid antijenlerle immünize edilmesiyle gerçekleştirilir. 10 gün sonra, donör farelerin lenf düğümleri izole edilir ve lenf düğümü hücreleri, dört ila beş gün boyunca aynı antijenle kültüre edilerek in vitro ortamda yeniden stimüle edilir.

Hücreler daha sonra naif alıcı farelere adoptif olarak transfer edilir. Duyarlı fare suşlarında, dirençli bir suşta EAE'yi tetiklemek için sekiz ila 14 gün içinde EAE gelişecektir. Adoptif transferden 14 gün sonra, alıcı fareler CFA içindeki antijen ile immünize edilmiştir.

Bu yöntem kullanılarak, dirençli fare suşlarında EAE indüklenebilir. EAE indüklemek için kullanılan adaptif transfer ve challenge protokolünün temel avantajı, hastalığın güvenilir bir şekilde indüklenmesine olanak tanımasıdır. Klinik hastalığın %100'den az görüldüğü durumlarla nadiren karşılaşılır.

Hastalık indüksiyonu protokolünü duyarlı fare suşlarına göre uyarlayabiliriz ancak daha da önemlisi, bu protokolü daha önce hastalığa dirençli olduğu düşünülen birçok fare suşunda EAE indüklemek için kullanabiliriz. Prosedürlerin gösterimi. Bugün yanımızda baş araştırmacı yardımcımız Cha Ching var.

PBS içerisinde 2 mg/mL MBP çözeltisi hazırlayarak başlayın. İmmünize edilecek fare başına 100 µL antijen çözeltisi çekmek için luer lock uçlu, rodajlı cam şırınga kullanın.

Ayrı bir şırınga kullanarak, eşit hacimde complete Freud's adjuvant H 37 ra toplayın. Ardından üç yollu bir muslukla iki şırıngayı birbirine bağlayın ve bir emülsiyon oluşana kadar antijen ve adjuvanı karıştırmak için pistonları ileri geri itin. Bunun gerçekleştiğini doğrulamak için çözeltiyi şırıngalardan birine aktarın ve boş olanı ayırın.

Boş şırıngaların pistonlarını hafifçe geri çekin, ardından kalan karışımdan bir damlayı oda sıcaklığındaki temiz su dolu bir behere boşaltın. Damla dağılıyorsa, şırıngaları tekrar bağlayın ve karıştırmaya devam edin. Damla bütün halini koruyor ve emülsiyon oluşmuşsa, emülsiyonu toplamak için testi tekrarlayın.

İmmünizasyon için; pistonu çıkarılmış olan cam şırıngaya plastik bir mililitrelik şırınga bağlayın. Çözeltiyi dikkatlice plastik şırıngaya aktararak ağzına kadar doldurun.

Ardından plastik pistonu yerleştirin ve tam olarak 1,2 milliliters kalacak şekilde bir miktar emülsiyonu dışarı itin. Şırıngada hapsolmuş hava kabarcığı olmamalıdır. Bu prosedür doğru şekilde gerçekleştirilirse.

Plastik şırıngayı ayırın. Şırıngaya 26 gauge bir iğne takın ve pistonu bir mililitre işaretine kadar iterek iğnenin boş hacmini doldurun. Fareyi sıkıca kavrayın ve göğüs ile karın bölgesine kolayca erişebilmek için kuyruğu yüzük parmağı ile serçe parmağı arasında geriye doğru tutun. Subkutan olarak.

Toraksın sağ koltuk altının hemen üzerine 50 µL emülsiyon enjekte edin. Enjeksiyon doğru şekilde gerçekleştirildiyse, enjeksiyon bölgesinde küçük beyaz bir şişlik görülecektir. İşlemi sol koltuk altı için tekrarlayın, ardından kuyruğu bırakın ve farenin sağ yan tarafını açığa çıkaracak şekilde sağ ayağını tutun.

Kaburgaların hemen altına 50 µL çözelti enjekte edin. Sağ ayağı bırakın. Fareyi diğer yöne çevirin ve enjeksiyonu sol tarafta tekrarlayın.

İmmünizasyonu takip eden 7 ila 10 gün sonra, ötanazi uygulanan hayvanlardan lenf düğümlerini toplayın. Öncelikle fareyi, uzuvları açık şekilde sırt üstü yatırın ve raptiyelerle diseksiyon tahtasına sabitleyin.

Fareyi etanol ile spreyleyin. Ardından steril aletler kullanarak, farenin derisinde alt karından çeneye kadar boyuna bir insizyon yapın.

Karından başlayarak bir bacağa doğru başka bir kesi yapın. Ardından diğer bacağı kesin. Deriyi fareden soyun ve diseksiyon tahtasına iğneleyin.

Dört uzuv boyunca deriyi de kesin. Ardından deri kapakçıklarının üst kısmını soyun ve her iki yanına raptiyelerle sabitleyin; normalde kasık veya koltuk altlarına yakın olan inguinal ve aksiller lenf düğümleri, derinin hemen altında küçük opak kütleler şeklinde görünmelidir. İlk lenf düğümünün üzerindeki bağ dokusunu nazikçe kaldırmak için iki adet ince pens kullanın.

Bu işlem sırasında kan damarlarını zedelememeye dikkat edin. Bağ doku temizlendikten sonra, bir çift pensi lenf düğümünün altına yerleştirin ve düğümü vücuttan ayırın. Lenf düğümünü steril PBS içeren 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarın ve diğer üç lenf düğümünü de aynı yöntemle toplayın.

Tüm lenf düğümleri toplandıktan sonra, Petri kabını biyogüvenlik kabinine taşıyın. Steril bir şırınga pistonunun arkasını kullanarak lenf düğümlerini hücreleri serbest bırakmak için homogenize edin; kalıntıları uzaklaştırmak için süspansiyonu naylon bir süzgeç aracılığıyla konik tüpe filtreleyin.

Ardından hacmi steril PBS ile 50 mililitreye tamamlayın ve hücreleri 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından, hücreleri önceden ısıtılmış az miktarda hücre kültürü ortamında yeniden süspande edin ve canlı hücreleri sayın. Konsantrasyonu mililitre başına 4 × 10⁶ hücre olacak şekilde ayarlayın.

Ardından hücreleri, 24 kuyucuklu bir plakada kuyucuk başına iki mililitre olacak şekilde ekleyin. Her kuyucuğa, nihai konsantrasyonu 100 mikrogram/mililitre olacak şekilde MVP antijeni ekleyin. Antijen eklendikten sonra.

Hücreleri 37 °C'de beş gün boyunca inkübe edin. Hücreler yeniden stimüle edildikten sonra, nazikçe pipetleme yaparak onları toplayın ve 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 1000 RPM'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve peleti küçük bir hacim steril PBS içerisinde yeniden süspande edin.

Ardından hücreleri sayın ve canlı hücre konsantrasyonunu PBS ile 2,5 x 10⁸ hücre/mL olacak şekilde ayarlayın. Adoptif transferi gerçekleştirmek için hücreleri bir şırıngaya çekin ve şırıngaya 26 gauge iğne takın. Dirençli fareleri, adoptif transferden iki hafta sonra challenge etmek için her bir farenin kuyruğundan intravenöz olarak 0,2 mL hücre enjekte edin.

Donör farelerin immünizasyonunda uygulandığı şekilde, hayvanlara 200 µL emülsiyon hacminde 200 µg antijen enjekte edin. Challenge işleminden yedi ila 10 gün sonra paralitik hastalık gelişecek ve hastalığın ilerleyişi izlenebilecektir. Hastalık, kuyrukta güçsüzlük ile başlar.

Kuyruk gevşek olduğunda hastalık birinci derece olarak sınıflandırılır. Farenin bir arka ekstremitesinde paralizi gelişirse ikinci derece, her iki arka ekstremite paralize olursa üçüncü derece olarak sınıflandırılır. Her iki ön ekstremite paralize olduğunda ise dördüncü derece olarak sınıflandırılır.

Beşinci dereceye gelindiğinde, farede hastalık daha belirgindir. Altıncı derecede ise fare ölmüştür. Burada gösterildiği gibi, challenge işleminden 7 ila 14 gün sonra farelerde, klasik EAE kriterleri kullanılarak derecelendirilebilen monofazik paralitik hastalık gelişecektir.

Fareler iyileşebilse de, kendiliğinden nüks göstermezler. Hastalığın indüksiyonu için antijene özgü bir challenge gereklidir. Yalnızca CFA ile veya ilgisiz bir antijenle yapılan challenge, hastalığı ortaya çıkarmada yetersiz kalır.

Bu videoyu izledikten sonra, EAE indüklemek için kullanılan adoptif transfer ve challenge yöntemini iyi bir şekilde kavramış olmalısınız. Antijene özgü lenf düğümü hücrelerinin adaptif transferi ile destekleyici bir antijenik challenge birleştirilerek, herhangi bir fare suşunda kolaylıkla EAE indüklenebilir. Bu yöntem, bazı fare suşlarında bulunan doğal direnç mekanizmalarının aşılmasını sağlar ve böylece hastalık direncinin çalışılmasına olanak tanır. Ayrıca.

Bu teknik, herhangi bir otoimmün hastalık sürecini incelemek için kolayca uyarlanabilir.