Kabul edilmiş Transfer ve antijenik Challenge Deneysel Otoimmün Encephalomyelitis (EAE) Dayanıklı Fare Suşlarında yanıtsızlık Aşmak

Bazı fare suşlar miyelin temel protein olan deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE) indüksiyon karşı edebiliyoruz. Burada anlatılan yanıtsızlık tersine çevirir ve birkaç tipik EAE dirençli fare lekeler paralitik hastalığın neden basit bir bağışıklama protokoldür.

Bu prosedürün genel amacı, EAE indüksiyonuna dirençli olduğu bilinenler de dahil olmak üzere herhangi bir fare suşunda EAE'yi tutarlı ve kolay bir şekilde indüklemektir. Bu, ilk olarak donör farelerin tam fres adjuvanında emülsifiye edilmiş miyelin spesifik proteinler veya peptit antijenleri ile aşılanmasıyla gerçekleştirilir. 10 gün sonra, donör farelerden alınan lenf düğümleri izole edilir ve lenf bezi hücreleri, dört ila beş gün boyunca aynı antijenle kültürlenerek in vitro olarak yeniden uyarılır.

Hücreler daha sonra evlat edinilmiş olarak saf alıcı farelere aktarılır. Duyarlı fare suşları, dirençli bir suşta EAE'yi tetiklemek için sekiz ila 14 gün içinde EAE geliştirecektir. Evlat edinen transferden 14 gün sonra, alıcı fareler daha sonra CFA'da antijen ile aşılandı.

Bu yöntem kullanılarak, dirençli fare suşlarında EAE indüklenebilir. EAE'yi indüklemek için adaptif transfer ve meydan okuma protokolünün ana avantajı, güvenilir hastalık indüksiyonuna izin vermesidir. Nadiren %100'den daha az klinik hastalık görüyoruz.

Protokolü hastalığı ve duyarlı fare suşlarını indüklemek için uyarlayabiliriz, ancak daha da önemlisi, bu protokolü daha önce hastalığa dirençli olduğu düşünülen birçok fare suşunda EAE'yi indüklemek için kullanabiliriz. Prosedürlerin gösterilmesi. Bugün baş araştırma ortağımız Cha Ching.

Mililitre MBP çözeltisi başına iki miligram hazırlayarak başlayın. PBS'de. Aşılanacak fare başına 100 mikrolitre antijen çözeltisi hazırlamak için yem kilidi ile donatılmış bir buzlu cam şırınga kullanın.

Ayrı bir şırınga kullanarak, eşit miktarda tam Freud'un adjuvanı H 37 ra'yı toplayın. Daha sonra üç bir musluk ile iki şırıngayı bağlayın ve bir emülsiyon oluşana kadar antijen ve adjuvanı karıştırmak için pistonları ileri geri itin. Durumun böyle olduğunu doğrulamak için, çözeltiyi şırıngalardan birine aktarın ve boş olanın bağlantısını kesin.

Boş şırıngaları geri çekin, hafifçe geri daldırın, ardından kalan karışımın bir damlasını oda sıcaklığında temiz su dolu bir behere boşaltın. Damla dağılırsa, şırıngaları tekrar bağlayın ve karıştırmaya devam edin. Damla sağlam kalırsa ve emülsiyonu toplamak için emülsiyon oluşmuşsa testi tekrarlayın.

Aşı için. Pistonu çıkarılmış cam şırıngaya bir mililitrelik plastik bir şırınga bağlayın. Solüsyonu dikkatlice plastik şırıngaya aktarın ve kenara kadar doldurun.

Ardından plastik pistonu yerleştirin ve tam olarak 1,2 mililitre kalacak şekilde bir miktar emülsiyonu dışarı atın. Şırıngada sıkışmış hava kabarcıkları olmamalıdır. Bu prosedür doğru şekilde gerçekleştirilirse.

Plastik şırıngayı ayırın. 26 gauge bir iğne ile takın ve pistonu bir mililitre işaretine iterek iğne boşluk hacmini doldurun. Fareyi sıkıca kaydırın ve kuyruğu yüzük parmağı ile serçe parmağı arasında tutun, böylece göğüs kafesi ve karın bölgesine kolayca erişilebilir. Deri altında.

Sağ koltuk altının hemen üstündeki göğüs kafesine 50 mikrolitre emülsiyon enjekte edin. Enjeksiyon doğru bir şekilde yapılırsa, enjeksiyon bölgesinde küçük beyaz bir şişkinlik görülecektir. Prosedürü sol koltuk altının üzerinde tekrarlayın, ardından kuyruğu serbest bırakın ve farenin sağ kanadını açığa çıkararak sağ ayağınızı tutun.

Göğüs kafesinin hemen altına 50 mikrolitre solüsyon enjekte edin. Sağ ayağı bırak. Fareyi diğer tarafa çevirin ve sol taraftaki enjeksiyonu tekrarlayın.

Aşılamayı takiben yedi ila 10 gün. Ötenazi yapılmış hayvanlardan lenf düğümlerini toplayın. İlk olarak, fareyi uzuvları gerilmiş ve pimlerle diseksiyon tahtasına sabitlenmiş olarak sırt üstü yatırın.

Fareye etanol püskürtün. Sonra steril aletler kullanarak. Farenin derisinde alt karın bölgesinden çeneye kadar uzunlamasına bir kesi kesin.

Karından bir bacağınıza doğru başka bir kesi yapın. Sonra diğerinden aşağı. Farenin derisini soyun ve diseksiyon tahtasına sabitleyin.

Ayrıca cildi dört uzuv boyunca kesin. Daha sonra cilt fleplerinin üst kısmını soyun ve her iki taraftaki pimlerle sabitleyin, normalde kasıklara veya koltuk altlarına yakın olan kasık ve koltuk altı lenf düğümleri, doğrudan cilt altında küçük opak kitleler olarak görünmelidir. İlk lenf düğümünün üzerindeki bağ dokusunu nazikçe çıkarmak için iki ince forseps kullanın.

İşlem sırasında kan damarlarını bozmamaya özen göstermek. Bağ dokusu temizlendikten sonra, lenf düğümünün altına bir çift forseps yerleştirin ve vücuttan uzaklaştırın. Lenf düğümünü steril PBS içeren 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarın ve diğer üç lenf düğümünü de aynı şekilde toplayın.

Tüm lenf düğümleri toplandıktan sonra, Petri kabını bir biyogüvenlik başlığına aktarın. Steril bir şırınga pistonunun arkasını kullanarak. Kalıntıları gidermek için hücreleri serbest bırakmak için lenf düğümlerini homojenize edin, süspansiyonu naylon bir ağdan konik bir tüpe süzün.

Daha sonra steril PBS ile hacmi 50 mililitreye ayarlayın ve hücreleri 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, hücreleri küçük bir hacimde ön ısıtma hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin ve canlı hücreleri sayın. Konsantrasyonu mililitrede altı hücreye dört kez 10 kez ayarlayın.

Daha sonra hücreleri 24 oyuklu bir plakada oyuk başına iki mililitre olarak kaplayın. Mililitre başına 100 mikrogramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için her bir oyuğa MVP antijeni ekleyin. Antijen eklendikten sonra.

Hücreleri beş gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreler yeniden uyarıldıktan sonra, hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek hasat edin ve 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 1000 RPM'de 10 dakika santrifüjleyin ve peleti küçük bir steril PBS hacmine yeniden süspanse edin.

Daha sonra hücreleri sayın ve canlı hücre konsantrasyonunu PBS ile mililitrede 2.5 kez 10 ila sekizinci hücrelere ayarlayın. Hücreleri bir şırıngaya çekin ve evlat edinme transferini gerçekleştirmek için 26 gauge bir iğne ile yerleştirin. Dirençli fareleri evlat edinme transferinden haftalar sonra zorlamak için her farenin kuyruğuna intravenöz olarak 0.2 mililitre hücre enjekte edin.

Hayvanlara 200 mikrolitre emülsiyon hacminde 200 mikrogram antijen enjekte edin, aynı şekilde donör farelerin aşılanması ile aynı şekilde yapılır. Meydan okumadan yedi ila 10 gün sonra felçli hastalık gelişir ve ilerlemesi izlenebilir. Hastalık kuyrukta zayıflık ile başlar.

Kuyruk sarkık olduğunda, hastalık derecelendirilir, bir hastalık derecelendirilir. İki, fare bir arka bacakta felç geliştirirse ve üç, her iki arka bacak da felç olursa. Dördüncü derece, her iki ön uzuvun felç olduğu zamandır.

Beşinci sınıf, fare daha bol miktarda bulunur. Ve altıncı sınıf, fare öldü. Burada gösterildiği gibi, meydan okumadan yedi ila 14 gün sonra, farelerde klasik EAE kriterleri kullanılarak derecelendirilebilen monofazik paralitik hastalık gelişecektir.

Fareler iyileşebilirken, kendiliğinden nüksetmezler. Hastalığın indüksiyonu, antijene özgü bir zorluk gerektirir. Tek başına CFA veya ilgisiz bir antijen ile yapılan itiraz hastalığı ortaya çıkarmaz.

Bu videoyu izledikten sonra, EAE'yi indüklemek için evlat edinen transfer ve meydan okuma yöntemini iyi anlamış olmalısınız. Antijene özgü lenf nodu hücrelerinin adaptif transferini güçlendirici bir antijenik meydan okuma ile birleştirerek, herhangi bir fare suşunda EAE'yi kolayca indükleyebiliriz. Bu yöntem, bazı fare suşlarında bulunan direnç mekanizmalarının üstesinden gelmemizi sağlar ve bu nedenle hastalık direncinin incelenmesine izin verir. De.

Bu teknik, herhangi bir otoimmün hastalık sürecini incelemek için kolayca uyarlanmalıdır.