Kabul edilmiş Transfer ve antijenik Challenge Deneysel Otoimmün Encephalomyelitis (EAE) Dayanıklı Fare Suşlarında yanıtsızlık Aşmak

Bu prosedürün genel amacı, EAE indüksiyonuna dirençli olduğu kabul edilenler de dahil olmak üzere, herhangi bir fare soyunda tutarlı ve kolay bir şekilde EAE indüklemektir. Bu işlem, öncelikle donör farelerin, komple Freud adjuvanı ile emülsifiye edilmiş miyelin spesifik proteinler veya peptid antijenlerle immunize edilmesiyle gerçekleştirilir. 10 gün sonra, donör farelerin lenf düğümleri izole edilir ve lenf düğümü hücreleri, dört ila beş gün boyunca aynı antijenle kültürlenerek in vitro ortamda yeniden stimüle edilir.

Hücreler daha sonra naif alıcı farelere adoptif olarak transfer edilir. Duyarlı fare suşları, dirençli bir suşta EAE'yi tetiklemek için sekiz ila 14 gün içinde EAE geliştirecektir. Adoptif transferden 14 gün sonra, alıcı fareler CFA içindeki antijen ile immunize edilmiştir.

Bu yöntem kullanılarak, dirençli fare suşlarında EAE indüklenebilir. EAE'yi indüklemek için adaptif transfer ve challenge protokolünün temel avantajı, hastalığın güvenilir bir şekilde indüklenmesine olanak sağlamasıdır. Klinik hastalığın %100'den daha düşük seyrettiği durumlarla nadiren karşılaşılır.

Hastalığı indüklemek için protokolü duyarlı fare suşlarına göre uyarlayabiliriz; ancak daha da önemlisi, bu protokolü daha önce hastalığa dirençli olduğu düşünülen birçok fare suşunda EAE indüklemek için kullanabiliriz. Prosedürleri gösteren kişi, baş araştırma görevlimiz Cha Ching.

PBS içinde 2 mg/mL'lik bir MBP çözeltisi hazırlayarak başlayın. İmmünize edilecek her fare için 100 µL antijen çözeltisini çekmek için luer lock uçlu, buzlu cam bir şırınga kullanın.

Ayrı bir şırınga kullanarak, eşit hacimde komple Freud adjuvanı H 37 ra toplayın. Ardından, üç yollu bir musluk yardımıyla iki şırıngayı birbirine bağlayın ve bir emülsiyon oluşana kadar antijen ve adjuvanı karıştırmak için pistonları ileri geri itin. Bunun gerçekleştiğini doğrulamak için çözeltiyi şırıngalardan birine aktarın ve boş olan şırıngayı ayırın.

Boş şırıngaların pistonlarını hafifçe geri çekin, ardından kalan karışımın bir damlasını oda sıcaklığındaki temiz su içeren bir behere boşaltın. Damla dağılırsa, şırıngaları tekrar bağlayın ve karıştırmaya devam edin. Damla bütün halini koruyorsa ve emülsiyon oluşmuşsa, emülsiyonu toplamak için testi tekrarlayın.

İmmünizasyon için. Pistonu çıkarılmış olan cam şırıngaya plastik bir mililitrelik şırınga bağlayın. Çözeltiyi dikkatlice plastik şırıngaya aktarın ve kenarına kadar doldurun.

Ardından plastik pistonu yerleştirin ve tam olarak 1,2 milliliters kalacak şekilde bir miktar emülsiyonu dışarı atın. Şırıngada hapsolmuş hava kabarcığı bulunmamalıdır. Bu işlem doğru şekilde gerçekleştirildiğinde.

Plastik şırıngayı ayırın. Şırıngaya 26 gauge iğne takın ve pistonu bir mililitre işaretine kadar iterek iğnenin boş hacmini doldurun. Fareyi sıkıca kavrayın ve göğüs ile karın bölgesine kolayca erişebilmek için kuyruğu yüzük parmağı ile serçe parmağı arasında geriye doğru tutun. Subkütan olarak.

Toraksın sağ koltuk altına hemen üst kısmından 50 µL emülsiyon enjekte edin. Enjeksiyon doğru şekilde gerçekleştirildiyse, enjeksiyon bölgesinde küçük beyaz bir şişlik görülecektir. Aynı işlemi sol koltuk altı için tekrarlayın, ardından kuyruğu bırakıp farenin sağ yanını açığa çıkaracak şekilde sağ ayağını tutun.

Kaburga kafesinin hemen altına 50 µL çözelti enjekte edin. Sağ ayağı bırakın. Fareyi diğer yöne çevirin ve enjeksiyonu sol tarafta tekrarlayın.

İmmünizasyonu takip eden 7 ila 10 gün sonra. Ötanazi uygulanmış hayvanlardan lenf düğümlerini toplayın. Öncelikle fareyi sırt üstü gelecek şekilde yerleştirin, ekstremitelerini açarak diseksiyon tahtasına pinlerle sabitleyin.

Fareye etanol püskürtün. Ardından steril aletler kullanarak, farenin derisine alt karından çeneye kadar boylamsal bir kesi yapın.

Karından bir bacağa doğru başka bir kesi yapın. Ardından diğer bacağa doğru kesin. Fareyle deriyi soyun ve diseksiyon tahtasına iğneleyin.

Ayrıca dört uzuv boyunca deriyi kesin. Ardından deri fleplerinin üst kısmını soyun ve her iki yanda iğnelerle sabitleyin; normalde kasık veya koltuk altlarına yakın olan inguinal ve aksiller lenf düğümleri, derinin hemen altında küçük opak kütleler şeklinde görülmelidir. İlk lenf düğümünün üzerindeki bağ dokusunu nazikçe uzaklaştırmak için iki adet ince pens kullanın.

Bu işlem sırasında kan damarlarına zarar vermemeye dikkat edin. Bağ dokusu temizlendikten sonra, bir penset çiftini lenf düğümünün altına yerleştirin ve onu vücuttan ayırın. Lenf düğümünü steril PBS içeren 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarın ve diğer üç lenf düğümünü aynı yöntemle toplayın.

Tüm lenf düğümleri toplandıktan sonra, Petri kabını bir biyogüvenlik kabinine aktarın. Steril bir şırınga pistonunun arkasını kullanarak lenf düğümlerini hücreleri serbest bırakmak için homojenize edin; kalıntıları uzaklaştırmak için süspansiyonu bir konik tüp içerisine naylon bir süzgeçten geçirerek filtreleyin.

Ardından hacmi steril PBS ile 50 mililitreye tamamlayın ve hücreleri 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından, hücreleri önceden ısıtılmış hücre kültür ortamının küçük bir hacminde yeniden süspande edin ve canlı hücreleri sayın. Konsantrasyonu mililitre başına dört kez 10⁶ hücre olacak şekilde ayarlayın.

Ardından, hücreleri 24 kuyucuklu bir plakada her kuyucuğa iki mililitre gelecek şekilde ekleleyin. Her kuyucuğa, final konsantrasyonu 100 mikrogram/mililitre olacak şekilde MVP antijeni ekleyin. Antijen eklendikten sonra.

Hücreleri 37 °C'de beş gün boyunca inkübe edin. Hücreler yeniden stimüle edildikten sonra, nazikçe pipetaj yaparak onları toplayın ve 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 1000 RPM'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve pellet'i küçük bir hacim steril PBS içinde yeniden süspande edin.

Ardından hücreleri sayın ve canlı hücre konsantrasyonunu PBS ile 2,5 x 10⁸ hücre/mL olacak şekilde ayarlayın. Hücreleri bir şırıngaya çekin ve adoptif transferi gerçekleştirmek için şırıngaya 26 gauge bir iğne takın. Adoptif transferden iki hafta sonra dirençli fareleri challenge etmek için her bir farenin kuyruğundan intravenle olarak 0,2 mL hücre enjekte edin.

Donör farelerin immünizasyonunda uygulandığı yöntemle aynı şekilde, hayvanlara 200 mikrolitre emülsiyon hacminde 200 mikrogram antijen enjekte edin. Challengeden yedi ila 10 gün sonra paralitik hastalık gelişecek ve ilerleyişi izlenebilecektir. Hastalık, kuyrukta güç kaybı ile başlar.

Kuyruk gevşek olduğunda hastalık birinci derece olarak sınıflandırılır. Eğer fare bir arka ekstremitede felç geliştirirse ikinci derece, her iki arka ekstremite de felç olursa üçüncü derece olarak sınıflandırılır. Her iki ön ekstremitenin felç olduğu durum ise dördüncü derecedir.

Beşinci dereceye gelindiğinde, farede belirtiler daha belirgindir. Altıncı derecede ise fare ölmüştür. Burada gösterildiği üzere, challenge uygulamasından 7 ila 14 gün sonra farelerde, klasik EAE kriterleri kullanılarak derecelendirilebilen monofazik paralitik hastalık gelişecektir.

Fareler iyileşebilse de, kendiliğinden nüksetmezler. Hastalığın indüklenmesi için antijene özgü bir tetikleme gereklidir. Yalnızca CFA ile veya ilgisiz bir antijenle yapılan tetikleme, hastalığı ortaya çıkarmada yetersiz kalır.

Bu videoyu izledikten sonra, EAE'yi indüklemek için kullanılan adaptif transfer ve challenge yöntemini iyi bir şekilde kavramış olmalısınız. Antijene özgü lenf nodu hücrelerinin adaptif transferini, destekleyici bir antijenik challenge ile birleştirerek, herhangi bir fare suşunda kolayca EAE indüklemek mümkündür. Bu yöntem, bazı fare suşlarında doğal olarak bulunan direnç mekanizmalarının aşılmasını sağlar ve böylece hastalık direncinin incelenmesine olanak tanır. Ayrıca.

Bu teknik, herhangi bir otoimmün hastalık sürecini incelemek için kolaylıkla uyarlanabilir.