Name: İlköğretim İnsan Fibroblastlar türetilmesi için Cilt Punch Biyopsi Eksplantın Kültür (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Öğrenin insan deri biyopsilerinden fibroblast elde etme yöntemini. Bu protokol 4-8 haftada 15-20 milyon hücre üretir ve düşük pasajda hücre bankacılığı için güvenilir bir teknik sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu protokolün geliştirilmesi Rejeneratif Tıp California Institute (CIRM, TR1-01246) ve Parkinson Alliance tarafından finanse edildi.

Punch biyopsi, Standart Prosedür 3&#39;e (örneğin 4 mm yuvarlak Visipunch cihazı ile elde edilmiş) kullanılarak elde edilen cilt buz üzerinde tam DMEM% 20 FBS ortamı içinde tutulmalıdır. Bir kez örnek laboratuarda geldi, en kısa zamanda biyopsi işlemek. 1. Cilt Punch Biyopsi hazırlanması ADIMLAR 1,1-1,3 A BİYOGÜVENLİK CABINET İÇ YAPILACAK OLAN <ol><li> Önceden hazırlayın: 6-kuyulu plakanın her kuyuya% 0.1 jelatin 1 ml ilave edilir. 30-60 dakika için bir kenara plaka ayarlayın. Jelatin çözüm aspire ve her bir kuyunun tam DMEM/20% FBS medya 800 ul ekleyin. Kuyunun tüm yüzey medya ile kaplı olduğundan emin olun. </li><li> Steril bir 10 cm doku kültürü çanak kapağı ters çevirin ve kapağı ortasına 1.5 DMEM ml / 20% FBS medya ekleyebilir ve serolojik pipet ucu ile medya damla yaymak. </li><li> Steril bir forseps kullanarak, yer to cilt çanak medyada parça biyopsi. </li></ol> 2. Cilt Punch Biyopsi diseksiyonu 9 2.1-2.2 ADIMLAR bir YATAY LAMİNER AKIŞ HOOD İÇ YAPILACAK OLAN <ol><li> Ters kapak 10 cm çanak alt kısmını yerleştirin ve cilt laminer akış kaputu mikroskop için biyopsi aktarın. </li><li> Yerinde biyopsi tutmak için bir neşter kullanılarak ve bir yönde bir dönme hareketi ile kesmek için ikinci neşter eşit devrede de gol parçaları keserek keskin kenarlı 12-15 eşit büyüklükte parçalar halinde bir 4-mm yuvarlak deri biyopsisi parçalara ayır. Düzensiz kenarlı Adet kötü eki / hücre akıbet katkıda bulunur. </li></ol> 3. Dissected Cilt Devri Doku Kültürü Tabaklar içine adet biyopsi ADIMLAR 3.1-3.6 Bir BİYOGÜVENLİK CABINET İÇ YAPILACAK OLAN <ol><li> 10 cm doku kültürü çanak alt kısmını yerleştirinters kapak, ve transfer yemeğin üstüne geri biyogüvenlik kabini içine. </li><li> Kuru kuyu 800 ul ve içermesin hazırlanan 6-plaka her kuyuya bir sivri forseps, yer 2-3 biyopsi parçaları kullanılarak. Adet kuyunun dibinde eklemek için almak için hareket dokunarak veya sürgülü kullanın. Bir neşter forseps herhangi bir biyopsi parçaları kaldırmak için yararlıdır. </li><li> 37 ° C inkübatör 6 plaka yerleştirin. Herhangi bir buharlaşan medya yerine 2 günde ~ 200 ul ekleyin; medya kaplama ilk hafta için kuyunun dibinde bir filmi olmadığından emin olmak için her gün izleyin. </li><li> Bir hafta sonra, tam DMEM/20% FBS ve değişim ortamı, her 2-3 günde 2 ml ortam miktarı artar. </li><li> Bir kez fibroblast fibroblast 2X T75 şişeler (geçit 1) içine de, Trypsinize ve geçiş 6-plaka kenarları ulaşıyor noktasına her kuyuda konfluent. Doku parçaları da aktarılabilir. Onlar o yapıştırmayın ve yıkanabilirBir sonraki medya değişikliği sırasında ut. </li><li> Bir kez fibroblast konfluent, 3X T175 şişeler (geçit 2), tam DMEM medyada dondurma artı 1x10 6 hücre / flakon başına ml% 10 DMSO aktarabilirsiniz. </li></ol> 4. Immün ile karakterizasyonu Fibroblastlar <ol><li> 8 iyi odasında slayt Kültür fibroblastlar jelatin kaplı. </li><li> Hücreleri confluency% 80 altındadır, her kuyudan orta aspire. </li><li> , Oda sıcaklığında on dakika süreyle% 4 paraformaldehid hücreleri saptamak. </li><li> 1X PBS ile kuyu 3 kere yıkayın. </li><li> % 0,3 olan 150 ul hücre geçirgenliği Triton oda sıcaklığında 5 dakika boyunca X-100 (PBS içinde). </li><li> 1X PBS ile kuyu 3 kere yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca 200 ul blokaj çözeltisi (PBS +% 5 normal keçi serumu (Vector, S-1000)) ilave edilir. </li><li> Çözümü engelleme anti-SERPHIN-1 (anti-tavşan, mAB Sigma, S5950-200 ul) bir 1:250 seyreltme hazırlayın. </li><li> BirBloke etme çözeltisi spirate ve AntiSERPINH-1 1:250 seyreltmesinin 150 ul ekleyin. Oda sıcaklığında 1-2 saat inkübe edilir, ya da 4 ° C&#39;da gece boyunca. </li><li> 1X PBS ile kuyu 3 kere yıkayın. </li><li> Çözelti bir şekilde bloke eden 1:200 keçi-anti-tavşan monoklonal antikoru (Alexa Fluor keçi anti-tavşan IgG (H + L), Invitrogen, A11008) hazırlayın. </li><li> Her kuyuya 1:200 keçi-anti-tavşan monoklonal antikor 150 ul ekle. Oda sıcaklığında, karanlıkta, 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> 1xPBS ile bir kez kuyu yıkayın. </li><li> PBS aspire ve dikkatle sadece slayt ortaya çıkarmak için odaları kaldırın. </li><li> DAPI (Vektör, H-1200) içeren montaj orta bir 2-3 damla ile slayt monte edin. </li><li> Bir floresan mikroskop altında slayt analiz edin. </li></ol>

<ol><li>Nguyen, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+mutant+iPSC-derived+DA+neurons+demonstrate+increased+susceptibility+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress.</a> Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).</li>
<li>Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+skin+fibroblasts+from+a+Parkinson%27s+disease+patient+with+an+alpha-synuclein+triplication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication.</a> Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).</li>
<li>Punch Zuber, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((biopsy+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Fam.+Physician%22%5BJournal%5D)">biopsy of the skin.</a> Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).</li>
<li>Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of fibroblast cultures.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1(2001).</li>
<li>Kuroda, K., Tajima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP47+is+a+useful+marker+for+skin+fibroblasts+in+formalin-fixed%2C+paraffin+embedded+tissue+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cutan.+Pathol%22%5BJournal%5D)">HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens.</a> J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol ile, deri fibroblast nispeten saf kültürleri elde edilebilir. Fibroblastlar oval hücre çekirdekleri yuvarlak uzun, iğ gibi hücre gövdeleri, karakteristik morfolojik özelliklere sahip, ve ne zaman birleşik fibroblast uyumlu ve demetleri büyür. Medya fibroblast büyüme örneğin keratinositler ilaveler ve büyüme faktörleri gerekir, ya da mitotik daha az aktif olan diğer hücre popülasyonlarının ise, bu nispeten saf fibroblast kültürleri sağlar destekler. Fibroblastlar daha son...

<table><tbody><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Leica</td><td>S6E</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Doku Kültürü Petri kabı</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyucuklu doku kültürü plağı </td><td>VWR</td><td>73520-906</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz çelik tek kullanımlık steril bistüriler (2), bıçak No#15, Miltex</td><td>VWR</td><td>21909-660</td><td></td></tr><tr><td>Steril uçlu penset</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik tüpler</td><td>VWR</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Serolojik Pipetler</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Serolojik Pipetler</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Serolojik Pipetler</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipetleri</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Lütfen çevirisini yapmamı istediğiniz metni sağlayın. Metni gönderdiğinizde, belirtilen tüm akademik standartlara, terminoloji kurallarına ve bilimsel kayıt diline sadık kalarak çeviriyi gerçekleştireceğim.&quot;&gt;&lt;güçlü&gt;Tablo A. Spesifik reaktifler ve ekipmanlar tablosu.&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>1X DMEM: Yüksek Glukoz</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>11960-069</td><td></td></tr><tr><td>%20 Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>1X L-Glutamin</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>1X MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler </td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>1X Penisilin/Streptomisin</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_adım&quot;&gt;&lt;güçlü&gt;Tablo B. Reaktifler.&lt;/strong&gt; &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

İlköğretim İnsan fibroblastlar türetilmesi için cilt punch biyopsi eksplantın kültür

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Hastalığı olan bir bireyden elde edilen dokular ve hücre çizgileri, hastalıkla ilişkili hücre fenotipleri çalışma yapmak için ideal kaynaklarıdır. Bu protokolde Hasta elde edilen fibroblast başarılı modeli hastalığı 1 ile uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetme kullanılmaktadır. Bu fibroblastlar erken geçişleri de belirli bir hastalık yolları mekanizmaları 2 ve daha sonraki ilaç tarama yaklaşımı incelemek için hücre bazlı fonksiyonel deneyleri için de kullanılabilir. Enzimatik prosedürler üzerinde Sunulan protokol avantajı 1) enzimatik tedaviler kullanarak yaşlı hastalar, Parkinson hastalığı, 2 ile etkilenen hastalarda) daha zor metodolojileri fazla teknik olarak basit bir yaklaşım türetilen doku küçük miktarlarda tekniğinin yeniden üretimde kıtlık ve 3 vardır ) zaman göz: Bu protokol 15-20 dakika sürer ve biyopsi geldikten sonra hemen yapılabilir. Enzimatik tedaviler 4 saat kadar sürebilir ve sorunları olabilirhücre canlılığı ve doğru kullanılmadığında hücrelerin sonraki ekin Overdigestion, azaltılması. Bu protokol, 4 mm insan derisi bir fibroblast kültür türetme için biyopsi diseksiyon ve hazırlık açıklar ve hasta kaynaklı doku örnekleri ile uğraşırken önemli olan çok yüksek başarı oranına sahiptir. Bu kültürde, keratinositler hazırlandıktan sonra ilk hafta içinde biyopsi doku dışına göç. Fibroblast keratinositlerin ilk akıbet sonra 7-10 gün görünür. % 20 FBS ile takviye DMEM yüksek glukoz medya keratinositlerin ve fibroblastların üzerinde fibroblast büyüme keratinositleri büyümek olacak yanadır. 2 pasajlar sonra keratinositler fibroblast işaretleyici SERPINH1 (HSP-47) ifade nispeten homojen fibroblast kültürlerinde neden dışarı seyreltilmiş edilmiştir. Bu yaklaşımı kullanarak, da 15-20 milyon fibroblast hücre bankacılığı için 4-8 hafta içinde elde edilebilir. Cilt diseksiyonu 15-20 dakika sürer, hücreler daha sonra günde bir kez izlenirmikroskop altında, ve medya 2-3 günde bağlanma ve hücre akıbet sonra değiştirilir.

Keratinositler diseksiyonu sonra 48 saat gibi kısa sürede biyopsi parçaları dışında büyüyen. İlk fibroblast akıbet yaklaşık bir hafta işleme sonra görülebilir. Kuyu konfluense ulaştığında, fibroblastlar üç 150 cm şişeleri (T150) ulaşmak için iki veya daha fazla geçit olarak tatbik edilir ve hücreler dondurulup saklanır. Bu yöntem 15-20.000.000 hücreleri ile üretir. Fibroblastlar, endoplazmik retikulum lokalize bir kollajen spesifik moleküler şaperon anti-SERPINH1 (ayrıca HSP-47 olarak da bilinir) (Şekil 1),</str...

Insan derisi punch biyopsi gelen fibroblast eksplant kültür protokolü düşük bir geçit numaradan milyon 15-20 hücre bankacılığı için 4-8 hafta içinde cilt hücrelerini elde etmek teknik olarak sağlam ve basit bir yoludur.

İlköğretim İnsan Fibroblastlar türetilmesi için Cilt Punch Biyopsi Eksplantın Kültür

Hastalığa sahip bir bireyden türetilen dokular ve hücre hatları, hastalıkla ilişkili hücresel fenotipleri incelemek için ideal kaynaklardır. Hasta kaynaklı fibroblastlar...

Merhaba. Deri Biyopsi İşleme video eğitimine hoş geldiniz. Gerekli materyalleri doku kültürü kabinine yerleştirerek başlayın. Kabine giren tüm nesneler %70 etanol ile püskürtülmeli ve silinmelidir; bir plağı PI numarası, tarih, baş harfler ve besiyeri türü ile etiketleyin, her bir duvara 0,1% jelatin'den bir mililitre ekleyin, tabanın jelatinle kaplandığından emin olmak için plağı dairesel hareketlerle sallayın.Plakayı kullanmadan önce bir saat bekletin. İlk adım, biyopsiyi tüpten kesim kabına aktarmaktır. Kesim kabı, biyopsinin diseke edileceği 10 santimetrelik bir Petri plağı kapağıdır.Kesme kabının merkezine 1,5 mililitre %20FBS'li DMEM ekleyin. Besiyerini merkezden dışarıya doğru yayın. Burada cilt biyopsisini görebilirsiniz.Bir sonraki adım, biyopsiyi tüpten kesim kabının merkezine aktarmaktır. Steril pensler kullanarak cilt biyopsi parçasını merkeze yerleştirin. Bunu yaparken dikkatli olun, steriliteyi korumak esastır.Kesim kabını kapatın ve laminar akışlı kabin içindeki diseksiyon mikroskobuna aktarın. Bir sonraki adım, biyopsiyi 12 ila 18 adet eşit büyüklükte parçaya ayırmaktır. Neşterleri dikkatli kullanın.Hazır olduğunuzda, biyopsiyi açın. Biyopsiyi sabitlemek için bir bi

skin-punch-biopsy-explant-culture-for-derivation-primary-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Parkinson hastalığı yol açan genlerde mutasyon taşıyan hastaların Fibroblastlar kolay erişilebilir bir...

Parkinson Hastalığı Alanında Mitokondriyal Fenotiplerinin İzleme İlköğretim İnsan Fibroblast Kullanımı

Birincil insan fibroblast ikinci naif multipotent ten türetilmiş öncü (SKP) hücreleri izole etmek için bir yöntem sunulmaktadır. Biz fibroblast kültürleri elde edilen bu SKPS insan deri biyopsisi doğrudan elde benzeyen kök hücre özelliklerini paylaşmak olduğunu göstermektedir. Bu hücreler, örneğin Oct4 ve Nanog olarak multipotent işaretleri ek olarak nöral tepe işaretleyici, Nestin, ifade eder.

İlköğretim İnsan fibroblast Kültürler gelen naif Erişkin Kök Hücre İzolasyon

Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi otolog nakli türetilmesi için ilginç umutları sağlar. Ancak, pluripotent devlet ve zahmetli yeniden farklılaşma yoluyla ilerleme hala klinik çeviri engellemektedir. Burada erişkin insan fibroblast türetme ve uyarılmış nöral progenitör hücrelerin içine doğrudan dönüşüm ve nöral soy içine sonradan farklılaşmayı açıklar.

Yetişkin İnsan Fibroblastları türetilmesi ve Genişletilebilir Sinir Progenitör Hücreler içine Doğrudan Dönüşüm

İnsan kaynaklı pluripotent stem (hiPS) hücrelerinin sağlam türetilmesi, entegre edilmeyen Sendai virüsü (SeV) vektörü aracılığıyla dermal fibroblastların yeniden programlanması kullanılarak gerçekleştirilmiştir. HiPS hücre bakımı ve klonal genişleme, rekombinant insan lamınin 521 (LN-521) matrisi ve Esansiyel E8 (E8) Ortamı ile kseno içermeyen ve kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak gerçekleştirildi.

Laminin 521 Matrisini Kullanarak İnsan Tarafından Oluşturulan Pluripotent Kök Hücrelerin Entegrasyon Serbest Türevi

Hücre yeniden programlama, pluripotent hücre durumunu düzenleyen ve koruyan anahtar genlerin tanıtılmasını gerektirir. Açıklanan protokol, insan dermal fibroblastlarından viral/entegre yöntemler olmadan ancak modifiye edilmeyen RNA'lar (NM-RNA) kullanarak hücresel savunma mekanizmalarını azaltan immün kaçırma faktörleri ile birlikte indüklenen pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) kolonilerinin oluşmasını sağlar.

Erişkin İnsan Dermal Fibroblastlarının Abdominal Deriden İzolasyon ve İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerin Indüklenen Alacalı Kök Hücrelerin Indükleyici Olmayan Yöntemle Üretilmesi

Bu protokol, cilt fibroblastlarının miyoblastlara dönüşümünü ve farklılaşmalarını miyotüplere açıklar. Hücre hatları nöromüsküler bozukluğu olan hastalardan türetilmiştir ve patolojik mekanizmaları araştırmak ve terapötik stratejileri test etmek için kullanılabilir.

Nöromüsküler Bozukluklar için Tedavileri Araştırmak için İnsan Fibroblastlarının Myoblastlara Doğrudan Yeniden Programlanması

Bu yazıda birincil, hastaya özgü insan aort düz kas hücrelerinin ve dermal fibroblastların izolasyonu ve kültürlenmesi için eksplant kültürüne dayalı bir yöntem anlatılmaktadır. Ayrıca, hücre kasılmasını ölçmek ve daha sonra bu hücrelerdeki hastaya özgü farklılıkları incelemek için kullanılabilecek yeni bir yöntem sunulmaktadır.

Primer Hastaya Özgü Aort Düz Kas Hücrelerinin İzolasyonu ve Yarı Kantitatif Gerçek Zamanlı Kasılma Ölçümleri In Vitro

Kas-iskelet sistemi yaralanması ile ilişkili yara iyileşmesinin incelenmesi genellikle Schwann hücreleri (SC'ler), keratinositler ve fibroblastlar arasındaki in vitro etkileşimlerin değerlendirilmesini gerektirir. Bu protokol, bu birincil hücrelerin insan sünnet derisinden izole edilmesini, kültürlenmesini ve karakterizasyonunu açıklar.

İnsan Sünnet Derisinden Primer Schwann Hücrelerinin, Keratinositlerin ve Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

Bu çalışma, etkili ve istikrarlı bir şekilde saf ve canlı fibroblastlar sağlayabilen keloid dokulardan primer fibroblastlar oluşturmak için optimize edilmiş bir protokolü açıklamaktadır.

İnsan Keloid Dokusundan Primer Dermal Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

Bu makalede, dermal fibroblastlardan hastaya özgü podositlerin epizomal yeniden programlanması yoluyla insan kaynaklı pluripotent kök hücrelere (hiPSC'ler) ve ardından podositlere farklılaşması için iki aşamalı bir protokol açıklanmaktadır.

Cilt Biyopsilerinden Hasta Kaynaklı Podositlerin Üretimi

Öğrenin insan deri biyopsilerinden fibroblast elde etme yöntemini. Bu protokol 4-8 haftada 15-20 milyon hücre üretir ve düşük pasajda hücre bankacılığı için güvenilir bir teknik sunar.

İlköğretim İnsan Fibroblastlar türetilmesi için Cilt Punch Biyopsi Eksplantın Kültür

Daha fazla video keşfet