Için basit Mikroakışkan Cihazlar

Merhaba, ben Hindistan'daki Ulusal Biyolojik Bilimler Merkezi'nde TUR Kika ile çalışan doktora sonrası araştırmacı Shamal. Bu videoda, standart bir laboratuvar ortamında yumuşak litografi tekniklerini kullanarak bir biyochip mikro cihazın nasıl üretileceğini göstereceğim. Bu cihazları, genetik model organizmaların yüksek çözünürlüklü hücresel ve hücre altı görüntülemesi için kullanacağım.

Bu protokol, araştırmacıların anestezi uygulanmamış bütün organizmalarda bu zaman serili görüntülemeyi gerçekleştirmelerine olanak sağlayacaktır. Öyleyse başlayalım. C. elegans, bütün Drosophila ve zebra balığı larvaları gibi genetik model organizmaların anestezi uygulanmamış in vivo görüntülemesini gerçekleştirmek için basit bir mikrofonik cihaz geliştirdik.

Bu çalışmada, PDMS'in yumuşak kalıplanması kullanılarak üretilen membran tabanlı şeffaf bir sabitleme cihazı sunuyoruz. Tek bir organizmayı sabitlemek için, stereo mikroskop altında bireysel hayvanı konumlandırıyor ve bir mikropipet yardımıyla küçük bir tampon çözelti damlası kullanarak hayvanı seçiyoruz; ardından tekil hayvanı akış kanalına yerleştirip PDMS membranı altında sabitliyoruz. Üç yollu bir küresel vana üzerinden basınçlı azot gazı bağlantısı kullanıyoruz.

Temizlik yazılımını kullanarak mikro fredit yapılarını tasarlayın. İki santimetreye iki santimetre boyutlarındaki silikon gofretleri %20 KOH içinde bir dakika boyunca temizleyin ve di su ile durulayın. Parçaları azot gazı ile kurutun ve 120 Celsius sıcaklıkta dört saat boyuncaydehidre edin.

Silikon parçalar üzerine 500 RPM'de beş saniye ve 3000 RPM'de 30 saniye boyunca Spinco hexa metal kaplayın. Silikon goferler üzerine 500 RPM'de beş saniye ve 2000 RPM'de 30 saniye boyunca Spinco SU 8 2 0 2 5 kaplayın. Kaplanmış silikon parçaları 65 °C'de bir dakika ve 95 °C'de 10 dakika boyunca yumuşak pişirmeye (soft bake) tabi tutun.

Fırınlanmış SU-8 kaplı gofretleri, sırasıyla akış katmanı ve kontrol katmanı için tasarım bir ve tasarım iki foto-maskesi aracılığıyla 200 watt'lık UV lambasına maruz bırakın. Gofretleri 65 °C'de bir dakika ve 95 °C'de 10 dakika boyunca pişirme sonrası işleme (post-bake) tabi tutun. Parçaları 20 dakika boyunca SU-A geliştirici solüsyonu kullanarak geliştirin.

Parçaları bir desikatör içerisinde iki saat boyunca tri kloro per fluoro CET seline buharı ile kodlayın. Poly dyl xox bazını ve kürleme ajanını ağırlıkça 10'a bir oranında karıştırın. Karıştırma sırasında oluşan tüm hava kabarcıklarını gidermek için karışımı vakumlayın.

Beş milimetre kalınlığındaki PDMS karışımını, tasarımın SC ağırlık desenine sahip silikon gofretlerin üzerine dökün. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için iki kez nazikçe uygulayın. Akış katmanı için tasarımı olan silikon gofretler üzerine PDMS'nin homojen bir tabaka halinde kaplanması için 5 saniye boyunca 500 RPM ve ardından 30 saniye boyunca 1500 RPM hızında spin kaplama işlemi gerçekleştirin.

PDMS içeren tasarım bir ve tasarım iki parçalarının her ikisini 50 °C'de altı saat boyunca pişirin. SCH desen iki içeren bir alt bıçak kullanarak PDMS parçasını silikon alt tabakadan kesin. PDMS kalıptaki ana tuzağı bağlayan rezervuarın üzerine küçük bir delik açın.

En yüksek delme kapasitesine sahip veya 18 gauge bir iğne kullanarak; kontrol tabakasının alt yüzeyini ve akış tabakasının üst yüzeyini iki dakika boyunca 18 wat hava plazmasına maruz bırakın. Plazma işleminden geçmiş iki yüzeyi hafifçe bastırarak birleştirin ve 50 °C'de iki saat boyunca pişirin.

Bondlanmış cihazları SUH tasarım birini kullanarak silikon substrattan kesin ve akış kanalının giriş ve çıkış rezervuarlarına erişim delikleri açın. Cihazın alt PD kısmını ve temiz bir cam kapağı açığa çıkarın. İki dakika boyunca 18 volt hava plazmasına maruz bırakın.

Plazma işlemine tabi tutulmuş iki yüzeyi hafif bir baskı uygulayarak yerleştirin ve 50 °C yüzey sıcaklığında iki saat boyunca pişirin. Cihazı, gelecekteki kullanımlar için temiz bir ortamda saklayın. Cihazların fabrikasyonundan sonra, c. elegans'ı cihaz içine immobilize etmek için PDMS membranının nasıl kullanılacağını göstereceğim. Bir mikroflex tüpün bir ucunu basınçlı azot gazı besleme regülatörüne, diğer ucunu ise 18 gauge bir iğne aracılığıyla ana tuzak rezervuarına bağlayın.

Tüp bağlantısının ortasında kullanılan üç yollu bir musluk, membran üzerindeki basıncın uygulanmasına veya serbest bırakılmasına olanak tanır. Ana tuzağın rezervuarına bağlamadan önce, tüpü ve PDMS cihaza bağlantıyı 10 santimetrelik bir distile su kolonu ile doldurun. Protein PSI'ı okumak için nitrojen kaynağının vanasını açın ve ana tuzağın membranının, ters bir mikroskobun düşük büyütme ayarında akış kanalına doğru sapmasını izleyin.

Üç yollu musluğu serbest bırakın ve membranı dinlenme konumuna getirin. Akış kanalını 10 dakika boyunca tampon çözelti ile doldurun. Bir deneyden önce, düşük büyütmeli bir stereo mikroskop kullanarak tek bir sea elegance konumunu belirleyin.

Mikro uç yardımıyla az miktarda tampon çözelti kullanarak tek bir hayvan seçin. Tekil hayvanı akış kanalı girişinden içeri itin. Tekil hayvanı ana tuzak altına konumlandırmak için pipetleme basıncını ayarlayın.

Hayvanı kanal sınırına yerleştirmek için PDMS membran basıncını yavaşça artırın ve 7 ila 14 PSI basınçla sabitleyin. Yüksek çözünürlüklü parlak alan veya floresan görüntüleme için ters mikroskobu istenen ayara getirin. Önceden tanımlanmış kare hızında tekil veya zaman ayarlı floresan görüntüler elde edin.

Tuzak basıncını serbest bırakın ve hayvanın lokomotor davranışını izleyin. Düşük büyütmede beş dakika boyunca hayvanı yıkayın ve taze bir hayvan yerleştirin. DevOp adımlarını tekrarlamak için, tek bir oph larvasını seçmek amacıyla kesilmiş mikropipet ucunu kullanın ve larvayı daha büyük boyutlu mikro ferrik cihaza yerleştirin.

Tek bir larvayı akış kanalı girişinden itin. PDMS membran basıncını yavaşça artırın ve yedi ESI basıncı ile sabitleyin. Düşük büyütmede floresan görüntüleme yapmak için ters mikroskop kullanın, taşıma görüntülemesi için zaman serili floresan görüntüler elde edin.

Tuzak basıncını serbest bırakın ve larvanın lokomotif davranışını düşük büyütmede izleyin. Aynı cihaz prensibini, döllenmişten 30 saat sonraki zebrafish larvalarını immobilize etmek ve zaman ayarlı görüntüler elde etmek için kullanın. Val heart.

Bu videoyu izledikten sonra, kendi laboratuvarınızda benzer mikro cihazlar üretebilmeli ve bunları yüksek çözünürlüklü, etkileyici deneyler için organizmaları immobilize etmek amacıyla başarıyla kullanabilmelisiniz. Videoyu izlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.