Eşzamanlı Gerilim-kelepçe ve Amperometri ile Dopamin Film Tek Hücre Ölçümü
21 Kasım 2012
Amperometrik tekniği spontan dopamin oksitlenmeye tarafından üretilen oksidatif akımı algılayarak tek bir hücreden dopamin salınımını ölçer. Eşzamanlı gerilim kelepçe ve amperometri metodolojisi dopamin taşıyıcısı ve dopamin ters taşıma Bu faaliyetin düzenleyici rolünün genel "faaliyet" arasındaki mekanistik ilişki bulunmaktadır.
Bu prosedürün amacı, DAT aracılı D salınımını ölçmek için eşzamanlı yama kelepçesi ve pirometri kullanılarak voltajla kenetlenmiş bir nöronda dopaminin ters taşınmasını ölçmektir. Bu, önce pirometrik elektrotun dopamin ile bütünlüğünün test edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, pirometrik elektrodu hücrenin yakınına yerleştirmek ve bir yama pipeti ile nöronun tam hücre yamasını elde etmektir.
Daha sonra, hücrenin voltajı yama pipeti ile kontrol edilir ve hücre tarafından salınan DAT aracılı dopamin, eş zamanlı olarak bir pirometrik elektrot ile kaydedilir. Son adım, DAT blokerini eklemek ve dopamin taşıyıcısının özel olarak aracılık ettiği akımın çıkarılmasına izin vermek için tüm hücre ve pirometri akımlarını tekrar kaydetmektir. Bu tekniğin önemi, dopaminerjik nöronun voltajını kontrol ederken aynı anda dopamin taşıyıcı yoluyla dopaminin ters taşınmasını ölçme yeteneğidir.
Eşzamanlı yama kelepçesi ve barometri kayıt sistemi, sistem için bir DC ışık kaynağı oluşturmak için mükemmel DIC optiklerine sahip ters çevrilmiş bir mikroskop ve uzun çalışma mesafeli bir lens gerektirir. Düşük elektrik gürültüsü ile mikroskop deniz fenerini bir araba aküsüne bağlayın. Hidrolik mikro manipülatörler, konfigürasyonumuzdaki gürültü seviyelerine önemli ölçüde katkıda bulunmadıkları için kullanılmaktadır.
Gerilim kelepçesi, tüm hücre kaydı için sağ elini kullanan bir manipülatör ve pirometri için sol elini kullanan bir manipülatör kullanılır. Elektrodu toptan kayda hazırlamak için P 2000 çektirme ile bir kuvars pipet çekin. Tipik olarak, üç ila dört mega ohm dirençli bir pipet kullanırız.
Daha sonra, elektrodu bir milimolar dopamin içeren pipet çözeltisiyle doldurun. Ardından sağ manipülatördeki pipet tutucusuna monte edin. Dopamin içeren pipet solüsyonunun bulunduğu kabı mutlaka alüminyum folyo ile sarın ve kullanılmadığı zamanlarda buz üzerinde tutun
.Dopamin oksitlenebilir olduğu için solüsyonun buz üzerinde tutulması ve ışıktan korunması oksidasyon hızını azaltacaktır. Gümüş teli elektrot tutucusuna geçirin, ardından parametrik adaptörü elektrot tutucusuna geçirin. Ardından, trik elektrodu gümüş tele temas edecek kadar cıva ile doldurun.
Elektrot adaptöre monte edildiğinde, ucun temiz ve sağlam olduğundan emin olmak için pro CFE düşük gürültülü karbon fiber ve parametrik elektrodu mikroskop altında incelediğinizden emin olun. Karbon fiberin ucunu hasardan korumak için karbon fiberin uzak ucunu tuttuğunuzdan emin olun. Ardından pro CFE Tric elektrodu monte edin.
Ardından, trik elektrotun bütünlüğünü incelemek için monte edilmiş elektrodu sol hidrolik manipülatöre monte edin. Harici çözeltiyi içeren cam tabanlı bir Petri kabına indirin. Dopamin yokluğunda temel akımı kaydedin.
Daha sonra yemeğe 10 mikrolitre bir milimolar dopamin çözeltisi ekleyin. İyi bir emper metrik elektrot, oksidatif akımda bir artış kaydetmelidir. Deneylerden önce ve sonra emper metrik elektrodunun bütünlüğünü kontrol ettiğinizden emin olun.
Bu prosedürde, cam tabanlı Petri kabına yerleştirilen dopamin taşıyıcısını eksprese etmek için tasarlanmış dopamin nöronlarını veya hücrelerini inkübatörden alın. Hücreleri veya dopamin nöronlarını ılık dış solüsyonla üç kez nazikçe yıkayın. Hücreleri görselleştirmek ve deneyi gerçekleştirmek için cam tabanlı Petri kabını mikroskop tablasına monte edin ve hücreleri net bir şekilde görselleştirmek için doğru odak noktasını bulun.
Ardından, yama elektroduna pozitif basınç uygulayın. Bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, her iki elektrotu da nazikçe çözeltiye indirin ve hücreyi mikro manipülatörlerle yaklaştırın. Ardından emper metrik elektrodunu hücrenin sol tarafına ve yama elektrodunu sağ tarafına yerleştirin.
Yama elektrodu hücreye temas ettiğinde. Hücre üzerinde bir giga conta oluşturmak için ağızdan veya şırıngadan hafif emme uygulayın. Bundan sonra, tüm hücre konfigürasyonunu elde etmek için contayı emme ile yırtın ve dopamin içeren iç çözeltinin hücreye diyalizi için beş ila sekiz dakika bekleyin.
Ardından, hücre zarı voltajını pipet boyunca eksi 60 milivoltluk bir tutma potansiyelinden eksi 100 ila artı 40 milivolt arasında kademelendirerek DAT aracılı akımları kaydedin. Spesifik DAT aracılı dopamin flx'i belirlemek için, bir DAT antagonistinin yokluğunda ve varlığında emper metrik akımlarını kaydedin. Spesifik DAT aracılı trik akım daha sonra DAT antagonisti varlığında kaydedilen izlerin, antagonist olmadan kaydedilen emper izlerinden çıkarılmasıyla belirlenir.
Trik akımlardaki yukarı doğru bir sapma, burada gösterilen dışa doğru bir dopamin akışına karşılık gelir. Tüm hücre yama modunda iki milimolar dopamin içeren pipet ile zar voltajının eksi dört C milivoltluk bir tutma potansiyelinden eksi 60 ile artı 100 milivolt arasında 20 milivolt kademelendirilmesiyle kaydedilen bir DAT aracılı akımlar. İşte tüm hücre akımı ile aynı anda elde edilen Emper metrik akımı.
Bu videoyu izledikten sonra, voltajla kenetlenmiş bir nöronda dopamin taşıyıcı aracılığıyla dopaminin ters taşınmasını nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Deneylerden önce ve sonra parametrik elektrotun bütünlüğünü kontrol etmeyi unutmayın ve o antagonistin varlığında kaydedilen izleri, antagonist olmadan kaydedilen trik izlerden çıkarmayı unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, eşzamanlı patch clamp ve pirometre kullanımıyla nöronlarda dopaminin ters taşınmasını ölçme tekniğini açıklamaktadır. Bu yöntem, nöronun voltajını kontrol ederken dopamin taşıyıcısının (DAT) aracılık ettiği salınımın değerlendirilmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Elektrofizyoloji
- Nörotransmitter dinamiği
Arka Plan
- Dopamin, çeşitli beyin fonksiyonlarında yer alan kritik bir nörotransmitterdir.
- Dopamin taşıyıcısı, dopamin seviyelerinin düzenlenmesinde kilit rol oynar.
- Ters taşınma mekanizmalarını anlamak, dopaminerjik sinyalleşme hakkında bilgiler sağlamak için gereklidir.
- Bu teknik, daha fazla doğruluk için voltaj kısma ile amperometrik ölçümleri birleştirir.
Çalışmanın Amacı
- Voltaj kısma uygulanan nöronlarda dopaminin ters taşınmasını ölçmek.
- DAT aktivitesi ile dopamin salınımı arasındaki ilişkiyi araştırmak.
- Dopaminerjik nöron fonksiyonunu gerçek zamanlı olarak incelemek için bir yöntem sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Pirometre elektrotunun dopamin ile bütünlüğünü test etmek.
- Patch pipet kullanarak nöronun tam hücreli patchını sağlamak.
- Patch pipet ile hücre voltajını kontrol etmek.
- Pirometre elektrot kullanarak DAT aracılı dopamin salınımını kaydetmek.
Ana Sonuçlar
- Voltaj kısma sırasında dopamin salınımının başarılı şekilde ölçülmesi.
- DAT engelleyicilerinin dopamin taşınması üzerindeki etkisinin gösterilmesi.
- Dopamin taşınmasının düzenleyici mekanizmaları hakkında bilgiler sağlanması.
- Nöronal dopamin dinamiğini incelemek için yöntemin doğrulanması.
Sonuçlar
- Teknik, dopaminin ters taşınmasını etkili bir şekilde ölçer.
- Eşzamanlı voltaj kontrolü, DAT fonksiyonunun anlaşılmasına yardımcı olur.
- Bu yöntem, dopaminerjik sinyalleşme üzerine daha fazla çalışma için uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables direct measurement of dopamine efflux via the dopamine transporter under voltage control, providing mechanistic insight into transporter function relevant to neuropsychiatric drug discovery. By isolating DAT-mediated release in real time, it supports target validation and de-risks hypotheses about dopaminergic signaling in disease models. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking transporter activity to neurotransmitter dynamics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the dopamine transporter's efflux mechanism to validate functional target engagement in live neurons.
- Operational Value: Enables simultaneous electrophysiological and amperometric recording to correlate membrane potential with transporter-mediated dopamine flux.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, time-resolved oxidative current readouts that reflect DAT-dependent dopamine release under controlled voltage steps.
- Operational Value: Establishes a reproducible assay format for measuring transporter-mediated efflux, supporting compound screening for DAT modulators.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links DAT efflux activity to extracellular dopamine homeostasis, informing disease models where transporter dysfunction is implicated.
- Operational Value: Provides a disease-relevant system to assess genetic or pharmacological perturbations of dopamine transporter function.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows by enabling mechanistic de-risking of dopamine transporter targets prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of transporter reversal mechanisms and pathway clarification in dopaminergic neurons.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs for evaluating compound effects on DAT-mediated efflux.
- Analytics: Provides simultaneous whole-cell current and amperometric measurements to isolate DAT-specific signals via pharmacological subtraction.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling dopamine dysregulation in voltage-controlled neuronal systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing transporter function across multiple neuronal models or disease contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence by directly measuring efflux-mediated dopamine release under physiological voltage control.
- Operational Value: Promotes assay standardization through synchronized patch clamp and amperometry, reducing variability in neurotransmitter flux measurements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by clarifying transporter mechanism of action, reducing late-stage attrition due to mechanistic misunderstanding.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of DAT-targeting compounds based on functional efflux modulation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, amperometry, and neuronal culture to maintain electrode integrity and signal fidelity.
- Depends on low-noise instrumentation including hydraulic manipulators, dual Axopatch 200B amplifiers, and carbon fiber electrodes for simultaneous recording.
- Necessitates cross-team standardization of voltage protocols and antagonist subtraction methods to ensure comparability across experiments.
- Involves adaptation considerations for different neuronal models, particularly regarding dopamine transporter expression levels and membrane health.
- Includes practical limitations such as dopamine solution oxidation, requiring protective handling and baseline validation before and after experiments.
