Kemirgen Medial entorinal Korteksin dorsal-ventral Örgütü Soruşturma parasagital Dilimleri hazırlanması

Biz medial entorinal korteks (MEC) dorsal-ventral eksen korumak beyin dilimleri ile hazırlanması ve elektrofizyolojik kayıt için prosedürler açıklanmaktadır. Konumu nöral kodlama MEC içinde dorsal-ventral organizasyonu aşağıdaki Çünkü, bu işlemler navigasyon ve bellek için önemli hücresel mekanizmaların incelenmesi kolaylaştırmak.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, medial giriş RH korteksindeki nöronların sinaptik ve bütünleştirici özelliklerinin topografik organizasyonunu incelemektir. Bu, dorsal ventral düzlemde yönlendirilmiş medial enter RH korteks dilimlerinin hazırlanmasıyla elde edilir. İkinci adım olarak, sinaptik ve bütünleştirici özelliklerini araştırmak için mento RH korteks nöronlarına yama klemp kayıtları yapılır.

Daha sonra, elektrofizyolojik ölçülen özelliklerin dorsal ventral organizasyonunu değerlendirmek için kaydedilen nöronun yeri belirlenir. Giriş direnci, membran zaman sabiti ve aksiyon potansiyeli eşiği ölçümlerine dayalı olarak ikinci katmandaki yıldız hücrelerinin içsel özelliklerinin topografik organizasyonunu gösteren sonuçlar elde edilir, Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Hugh Pastel olacaktır. Bu tekniğin yatay olarak yönlendirilmiş beyin dilimleri gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, kaydedilen nöronun interal korteksin dorsal ventral ekseni boyunca konumunun doğru bir şekilde kaydedilebilmesidir.

Bu işleme başlamak için, beyni fareden çıkarın ve hemen soğuk kesime yerleştirin. Yapay beyin omurilik sıvısı, karbojen ile köpürtülmüş. Üç dakika sonra, beyni bir spatula kullanarak kesme A CSF'den dikkatlice çıkarın.

Kesme A CSF ile nemlendirilmiş filtre kağıdının üzerine nazikçe dik konumda yerleştirin. Ardından, beynin kordal ucunda bulunan medial enteral korteksi etkilemeden beyinciğin mümkün olduğunca çoğunu çıkarmak için bir jilet veya neşter kullanın. Koronal düzlemde bölümlere ayırarak serebrumun rostral kısmını çıkarın.

Sonraki hemis saniye, orta hattın dikey düzlemindeki beyin. Bundan sonra, yarım küreleri monte etmeden önce bir buçuk dakika boyunca bir BOS'u keserek kabarcıklı hale getirin. Vibrato bıçağının kesici kenarının yataydan 20 derece açılı olduğundan emin olun Montaj yüzeyinde, vibrato bıçağına paralel, yaklaşık bir yarım küre genişliğinde ve iki yarım küreyi uç uca barındıracak kadar uzun sığ bir süper yapıştırıcı şeridi yapın.

Ardından, yarım küreyi medial yüzeyi spatula üzerinde duracak ve sırt kısmı titreşimli ton bıçağına bakacak şekilde konumlandırarak her bir yarım küreyi bir BOS kesiminden montaj yüzeyine aktarın. Yarım küreyi yavaşça süper yapıştırıcı şeridinin üzerine kaydırın ve her yarım kürenin medial yüzeyinin vibrato tabanına paralel olduğundan emin olun. Bundan sonra, yarım küreleri hemen soğuk kesime batırın.

Bir CSF. Dilimleme prosedürü boyunca sıcaklığı, arabayı ve doygunluğu koruyun. Vibram ile, her yarım küredeki medial enteral korteksin en yan kısmı yan yüzeyden en az 600 mikrometre uzakta tanımlanana kadar sagital düzlemdeki her iki yarım küreden korteksleri çıkarın.

Medial enteral korteksin lateral kapsamı, hipokampusun ventral kordal eğrisi etrafındaki kalın beyaz bandın olmaması ile tanımlanır. Rostral sınırının dışbükey olmayan şekli ve açısal dorsal kordal köşe, medial enteral korteksin medial boyutuna ulaşılana kadar her iki hemisferden 400 mikron para sagital kesitler keser. Her kesimden sonra, dilimleri hemen 35 santigrat derecede bir su banyosunda tutulan karbojen doymuş standart A BOS'a yerleştirin ve yaklaşık 15 dakika inkübe edin.

15 dakika sonra dilim tutucuyu su banyosundan çıkarın ve en az 45 dakika oda sıcaklığında karbojen ile köpürmeye devam edin. Karbojen doymuş standart ACSFA 35 santigrat derece ile sürekli olarak köpürtülen kayıt odasına bir dilim aktarın. Ardından, medial enter RH korteksi içinde yaklaşık bir kayıt bölgesi belirleyin.

Ardından yüksek büyütme objektifine geçin. Bu bölgedeki canlı hücreleri tanımlayın. Bu noktada, tanımlanan nöronlardan zar potansiyelini veya zar akımını kaydetmek için geleneksel tam hücre yama kelepçesi kullanılarak deneyler yapılabilir.

Nöron kimliği, kaydedilen nöronun elektrofizyolojik özelliklerinden ve hücre içi çözelti içine floresan etiketlerin dahil edilmesiyle doğrulanabilir. Deneyden sonra, dorsal ventral eksen boyunca kaydedilmiş bir nöronun konumunu belirlemek için, düşük bir büyütme hedefine geçin. Kayıt elektrodunu bir görüntüye dahil ederek veya alan iris diyaframını aşağı indirerek ilgilenilen yeri işaretleyin.

Yinelenen bir görüntü görüntüsünde, medial ve RH korteks bölgesinde ve dilimin çevresindeki alanlarda ilgilenilen konumun etrafında parlak bir daire bırakmak ve görüntüdeki kayıt konumunu tam olarak belirlemek için, kopya daha sonra kayıt konumunun ve çevresinin ilk görüntüsünün üzerine bindirilebilir. Bir ventral kayıt konumundan medial interal korteksin dorsal sınırına kadar olan alanı kaplamak için üç ayrı düşük büyütmeli görüntü gerekebilir. Bu görüntüler daha sonra görüntü işleme yazılımı kullanılarak birleştirilebilir.

Medial enteral korteksin dorsal sınırı, dorsal ventral pozisyonu ölçmek için uygun bir dönüm noktası sağlar, ancak medial enteral korteksin ventral sınırı o kadar iyi tanımlanmamıştır. Burada. DIC ve NIAL para sagital kesitler, sırasıyla dairesel hipokampusu ve lateral enteral korteksin birinci tabakasına paras orbiküler çıkıntının olmadığını gösterir. Bunlar, medial enteral korteksi içeren tipik dilimlerin görüntüleridir.

Paras alanı füze boyama ile açıkça ortaya çıkar. İlgili görüntülerde, siyah okla gösterilen medial enteral korteksin dorsal sınırı, kırmızı okla gösterildiği gibi birinci katmana kadar çıkıntı yapan paras orbiküler hücreler grubuna ventraldir. İşte bir para sagital dilimin dört kat büyütmeli bileşik görüntüsüne bir örnek.

Bir dorsal hücrenin ve bir ventral hücrenin pozisyonları sırasıyla mavi ve yeşil dolgulu dairelerle gösterilir. Siyah ok, medial interal korteksin tahmini dorsal sınırını işaretler ve beyaz noktalı çizgi ile derin katmanlara uzatılır. Düz beyaz çizgi, medial interal korteksin dorsal sınırından işaretli dorsal ve ventral yıldız hücrelerinden ventral olarak yerleştirilmiş hücre kayıtlarına olan mesafenin piksel ölçümünün burada gösterildiği kontur yolunu gösteren bir kılavuzdur.

Bu kayıtlar, hücrelerin kimliğini belirlemeye yardımcı olur ve medialin elektriksel özelliklerinin r kortekse nasıl girdiğini gösterir. İkinci katman yıldız hücreleri, bu prosedürü denerken dorsal ve ventral konumlarda farklılık gösterir. Verimli elektrofizyolojik kayıtlar için yüksek kaliteli dilimler gerekli olduğundan, dilimlerin hazırlanması sırasında son derece dikkatli olmayı unutmamak önemlidir.