Durduruldu-Akış Spektrofotometri kullanarak Flavin-Bağımlı monooksijenaz ve indirgeyici ve Oksidatif Yarı-Tepkime İzlenmesi

Bu prosedür, SID A'nın farklı spektral formlarını tespit etmek ve oranları ölçmek için durdurulmuş bir akış cihazı kullanır. SID A tarafından katalize edilen reaksiyon, FAD'ın indirgeyici ve oksidatif yarı reaksiyonlarına ayrılabilir. Oksitlenmiş flavin, N-A-D-P-H'ye bağlanır ve indirgenmiş flavin ve NADP oluşturmak üzere reaksiyona girer, ayrıca moleküler oksijenin reaksiyonu ve ornitinin bağlanması C4 oluşumuna neden olur.

Ornitinin hidroksilasyonundan sonra bir hidroksi flavin olan hidroksi flavin, oksitlenmiş enzimi oluşturmak üzere dehidre olur. NA DP plus, katalitik döngü boyunca bağlı kalır ve salınan son substrattır. Durdurulmuş akış cihazı, küçük hacimli reaktanların ve kayıtların hızlı bir şekilde karıştırılmasını kolaylaştırır.

Spektral değişiklikler zamanla Madde kaybı spektrofotometresi, özellikle geçici ara ürünlerin oluşum hızını ve bir enzim katalizli reaksiyonun oranını ölçmeye izin verir. Laboratuvarımın iki üyesi, Rita Robinson ve Enviro Romero, bu deneyleri bir model sistem olarak lezzet mono oksijenazda A setini kullanarak gösterecekler. 250 mililitre 100 milimolar potasyum fosfat tamponunu, bir karıştırma çubuğu içeren 500 mililitrelik bir buchner şişesine dökün.

Şişeyi lastik bir tıpa ile kapatın, ardından bir karıştırma plakasına yerleştirin ve şişenin kısa tüpünü bir sch yan hattına bağlayın. Tamponu oda sıcaklığında bir saat boyunca vakum altında çalkalayarak gazdan arındırın, ardından argon ile yıkayın. Beş kez tekrarlayın.

Son olarak, şişeyi Argonne ile 10 saniye yıkayın. Şişeyi vakum manifoldundan ayırın ve torpido gözünün içine yerleştirin. Şişe açıkken kuvvetlice karıştırmaya devam edin.

Rezervuar şırıngalarını mililitre başına 18.13 birim glikoz oksidaz ve 100 milimolar glikoz çözeltisi ile doldurun. Şimdi tahrik valflerini yük konumuna getirin. Sürücü şırıngalarını doldurun.

Ardından, F valfini sürücü konumuna çevirin. Pro veri kontrol yazılımını kullanarak, durdurma şırıngasını boşaltın, ardından ilgili sürücü ram'ini manuel olarak kaldırarak arabelleği sürücü şırıngasından F akış devresinden itin. Diğer üç sürücü şırıngası ile devam edin, bir saat boyunca dengede kalın.

Şimdi rezervuar şırıngalarını yeniden doldurun ve durdurulan akış sisteminin yıkanmasını tekrarlayın. Oksijene doymuş tampon hazırlamak için. Çözeltiyi çalkalayarak bir saat boyunca% 100 oksijen ile köpürtün.

Ardından kısa iğneyi flakondan çıkarın ve 10 saniye bekleyin. Uzun iğneyi çıkarmaya devam edin ve yakın şişeyi torpido gözüne yerleştirin. N-A-D-P-H çözümü için.

Torpido gözüne bir miligram N-A-D-P-H içeren 1,5 mililitrelik bir einor tüpü yerleştirin. 300 mikrolitre anaerobik, 100 milimolar potasyum fosfat tamponunda çözülür. pH 7.5'tir.

N-A-D-P-H konsantrasyonunu belirlemek için 30 mikrolitre çıkarın. Şimdi enzim stoğundan oksijeni çıkarmak için, çözeltiyi bir buğday ve tıpa ve alüminyum conta ile bir karıştırma çubuğu kapağı içeren 25 mililitrelik bir şişeye aktarın. Buzun üzerine yerleştirin.

Bir schlink hattına bağlayın, ardından 20 dakika vakumla gazdan arındırın, ardından argon ile yıkayın. Son olarak, şişeyi Argonne ile 10 saniye yıkayın ve vakum manifoldundan ayırın. Şişeyi torpido gözünün içindeki buzun üzerine yerleştirin.

Pro veri kontrol yazılımının kontrol paneli penceresinde. Foto diyot dizisini, harici tetikleyiciyi ve logaritmik ölçeği seçin. Ayrıca pro veri görüntüleyici yazılımını başlatın ve veri dosyası depolaması için dizini tanımlayın.

Şimdi rezervuar şırıngaları C ve F'deki çözeltiyi anaerobik 100 milimolar potasyum fosfat tamponu pH 7.5 ile değiştirin. C ve F valflerini sürücü konumuna çevirin. Pro veri kontrol yazılımında durdurma şırıngasını boşaltın.

Ardından, ilgili sürücü ram'ini manuel olarak kaldırarak arabelleği her iki sürücü şırıngasından akış devresi boyunca itin. Rezervuar şırıngaları C ve F ile yıkamayı üç kez daha tekrarlayın. Glikoz oksidazın akış devresinden tamamen çıkarılmasını sağlamak için, pro veri kontrol yazılımında taban çizgisine tıklamaya devam edin.

Rezervuar şırıngasının F çözeltisini enzim çözeltisi ile değiştirin. F valfini sürücü konumuna çevirin. Pro veri kontrol yazılımında durdurma şırıngasını boşaltın.

İlgili sürücü ramını manuel olarak kaldırarak enzim çözeltisini sürücü şırıngasından F akış devresinden itin. Alım süresini 60 saniye olarak ayarlamak için profesyonel veri kontrol yazılımına dönün. Her iki sürücü şırıngasının da karşılık gelen çözeltilerle dolu olduğunu ve sürücü şırıngalarının sürücü şırıngası ile temas halinde olduğunu doğrulayın. Piston.

Her iki valfi de sürücü konumuna çevirin ve sürücüyü gerçekleştirmek için pro veri kontrol yazılımında edin'e tıklayın. Sürücülerden elde edilen A 4 52 nanometre değerini kullanarak enzimin oksitlenmiş formunun spektral verilerini üç kopya halinde elde edin. Karıştırmadan önce enzim konsantrasyonunu belirleyin ve dört mililitre N-A-D-P-H çözeltisi hazırlayın.

1.5 kat daha konsantre rezervuar şırıngasını C N-A-D-P-H çözeltisi ile doldurun ve durdurma şırıngasını daha önce gösterildiği gibi üç kez boşaltın ve yeniden doldurun. Şimdi, anaerobik 100 milimolar potasyum fosfat tamponu pH 7.5 ile akış devresinden enzim yıkama içeriğinin indirgenmesi sırasında spektrumlar elde edin. Şimdi pro veri kontrol yazılımında taban çizgisine tıklayın.

Daha sonra 200 mikrolitre enzim stok çözeltisini 1000 mikrolitre anaerobik, 100 milimolar potasyum fosfat tamponu ile karıştırın. pH 7.5. Rezervuar şırınga A'nın çözeltisini enzim çözeltisi ile değiştirin.

A valfini pro veri kontrol yazılımındaki sürücü konumuna çevirin. Durdurma şırıngasını boş tıklayın. İlgili sürücü ramını manuel olarak kaldırarak enzim çözeltisini sürücü şırıngası A'dan akış devresinden itin.

Gecikme süresini 0,5 saniyeye ve alım süresini 60 saniyeye ayarlayın. Tüm sürücü şırıngalarının karşılık gelen çözeltilerle doldurulduğunu ve sürücü şırıngalarının sürücü şırınga pistonlarıyla temas halinde olduğunu doğrulayın. Ardından tüm tahrik valflerini tahrik konumuna getirin ve pro veri kontrol yazılımında edin'e tıklayın.

Enzimin oksitlenmiş formunun spektral verilerini üç kopya halinde elde edin. Daha sonra, rezervuar şırıngası B'nin çözeltisini bir N-A-D-P-H çözeltisi ile değiştirin. Şırıngadaki enzim çözeltisinden 1,5 kat daha konsantre A. B valfini sürücü konumuna çevirin ve durdurma şırıngasını kontrol paneli penceresinde daha önce gösterildiği gibi üç kez boşaltın ve yeniden doldurun.

Gecikme süresini 0,5 saniye olarak ayarlayın. 20 saniyede bir edinim, rezervuar şırınga denizi çözeltisini oksijenli tamponla değiştirin. C valfini sürücü konumuna çevirin.

Pro veri kontrol yazılımında üç kez yıkayın. Gecikme süresini 15 saniyeye ve alım süresini 900 saniyeye ayarlayın. Durdurulmuş akış cihazında tamamen indirgenmiş enzimin yeniden oksidasyonu sırasında spektrum elde etmeye devam edin.

SID A'nın N-A-D-P-H ile anaerobik indirgenmesi, burada 452'de emici kullanılarak flavin'in redoks durumundaki değişikliklerin ölçülmesiyle izlenebilir. Spektral değişiklikler, oksitlenmiş SID A'dan tamamen indirgenmiş SID A'nın son spektrumuna kadar zaman içinde kaydedilir. Bu enzimatik adımın hızı, verilerin uygun denkleme uydurulmasıyla belirlenebilir. Oksidasyon hızı ve reaksiyon ara ürünleri, AF Sid A ile bu reaksiyonda durdurulan akışın çift karıştırma modu kullanılarak da belirlenebilir.C dört A Hydroxi flavin ara ürünü, maksimum üç 80 nanometrelik bir lambda ile açıkça tespit edilir ve oksitlenmiş enzim, maksimum 450 nanometrelik bir lambdaya sahiptir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa dört ila altı saat içinde tamamlanabilir. Çözeltilerin anaerobik olduğundan emin olmayı unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, hızlı kimyasal gibi FLA bağımsız mono daha sonraki aşağı akış deneyinin hem göreceli hem de ülseratif iyonunu nasıl araştıracağınızı iyi anlamış olmalısınız.

Quentin, ara ürünlerin üzücü doğasını aydınlatmaya yardımcı olabilir.