Durduruldu-Akış Spektrofotometri kullanarak Flavin-Bağımlı monooksijenaz ve indirgeyici ve Oksidatif Yarı-Tepkime İzlenmesi

Bu prosedür, SID A'nın farklı spektral formlarını saptamak ve hızları ölçmek için bir durdurulmuş akış (stopped flow) cihazı kullanır. SID A tarafından katalize edilen reaksiyon, FAD'nin redüktif ve oksidatif yarı reaksiyonlarına ayrılabilir. Okside flavin N-A-D-P-H'ye bağlanır ve indirgenmiş flavin ile NADP'yi oluşturacak şekilde reaksiyona girer; moleküler oksijenin reaksiyonu ve ornitinin bağlanması ise C four oluşumuyla sonuçlanır.

Ornitinin hidroksilasyonundan sonra oluşan bir hidroksi flavin, oksitlenmiş enzimi oluşturmak için su kaybederek (dehidrasyona uğrayarak) ayrışır. NADP⁺ katalitik döngü boyunca bağlı kalmaya devam eder ve serbest kalan son substrattır. Durdurulmuş akış (stopped flow) cihazı, küçük hacimli reaktiflerin hızlıca karıştırılmasını sağlar ve kayıt yapar.

Spektral zamanla değişimler, bir enzim katalizli reaksiyonda, özellikle geçici ara ürünlerin oluşum ve kaybolma hızının ölçülmesine olanak tanır. Laboratuvarımdaki iki üye, Rita Robinson ve Enviro Romero, model sistem olarak flavor mono oksijenaz kullanarak A setindeki bu deneyleri gösterecekler. Karıştırma çubuğu içeren 500 mililitrelik bir Büchner erlenine 250 mililitre 100 milimolar potasyum fosfat tamponu dökün.

Balonu bir kauçuk tıpa ile kapatın, ardından bir manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin ve balonun kısa tüpünü bir Schlenk hattına bağlayın. Tamponu, oda sıcaklığında karıştırma eşliğinde vakum altında bir saat boyunca gazdan arındırın ve ardından argon ile yıkayın. Bu işlemi beş kez tekrarlayın.

Son olarak, balonu 10 saniye boyunca Argon ile yıkayın. Balonu vakum manifoldundan ayırın ve eldiven kutusunun içine yerleştirin. Balon açıkken kuvvetli bir şekilde karıştırmaya devam edin.

Rezervuar şırıngalarını mililitrede 18,13 ünite glikoz oksidaz ve 100 milimolar glikoz çözeltileri ile doldurun. Şimdi sürüş valflerini yükleme konumuna getirin. Sürüş şırıngalarını doldurun.

Ardından, F valfini sürüş konumuna getirin. Pro data kontrol yazılımını kullanarak stop şırıngasını boşalt seçeneğine tıklayın ve ardından ilgili sürüş pistonunu manuel olarak kaldırarak tampon çözeltiyi sürüş şırıngası F'den akış devresine doğru itin. Diğer üç sürüş şırıngası için de aynı işlemi tekrarlayın ve bir saat boyunca dengelemeye bırakın.

Şimdi rezervuar şırıngalarını yeniden doldurun ve durdurulmuş akış sisteminin yıkanmasını tekrarlayın. Oksijenle doyurulmuş tampon hazırlamak için, çözeltiyi karıştırarak bir saat boyunca %100 oksijen ile havalandırın.

Ardından kısa iğneyi flakondan çıkarın ve 10 saniye bekleyin. Uzun iğneyi çıkarıp kapatılmış flakonu glove box'a yerleştirin. N-A-D-P-H çözeltisi için.

Bir miligram N-A-D-P-H içeren 1.5 mililitrelik bir einor tüpü glove box içine yerleştirin. 300 mikrolitre anaerobik, 100 milimolar potasyum fosfat tamponu (pH 7.5) içinde çözün.

N-A-D-P-H konsantrasyonunu belirlemek için 30 µL alın. Enzim stokundan oksijeni uzaklaştırmak için, çözeltiyi manyetik karıştırıcı çubuğu, tıpa ve alüminyum mühür içeren 25 mL'lik bir flakona aktarın. Buz üzerine yerleştirin.

Bir Schlenk hattına bağlayın, ardından 20 dakika boyunca vakumla gaz giderme işlemini gerçekleştirin ve ardından argon ile süpürün. Son olarak, şişeyi 10 saniye boyunca argon ile süpürün ve vakum manifoldundan ayırın. Şişeyi eldiven kutusu içerisinde buz üzerine yerleştirin.

Pro data kontrol yazılımının kontrol paneli penceresinde; fotodiyot dizisi, harici tetikleyici ve logaritmik ölçek seçeneklerini belirleyin. Ayrıca pro data görüntüleyici yazılımı başlatın ve veri dosyalarının depolanacağı dizini tanımlayın.

Şimdi C ve F rezervuar şırıngalarındaki çözeltiyi, anaerobik 100 millimolar potasyum fosfat tamponu pH 7.5 ile değiştirin. C ve F valflerini sürüş konumuna getirin. Pro data kontrol yazılımında stop şırıngasını boşalt seçeneğine tıklayın.

Ardından, ilgili tahrik pistonlarını manuel olarak kaldırarak tamponu her iki tahrik şırıngasından akış devresine doğru itin. C ve F rezervuar şırıngalarıyla yıkama işlemini üç kez daha tekrarlayın. Glukoz oksidazın akış devresinden tamamen uzaklaştırıldığından emin olmak için pro veri kontrol yazılımındaki baseline seçeneğine tıklayın.

Rezervuar şırınga F'deki çözeltiyi enzim çözeltisi ile değiştirin. F valfini sürüş konumuna getirin. Pro data kontrol yazılımındaki stop şırıngasını boşalt seçeneğine tıklayın.

Karşılık gelen itici pistonu manuel olarak yukarı kaldırarak, enzim solüsyonunu F itici şırıngasından akış devresine doğru itin. Kazanım süresini 60 saniye olarak ayarlamak için pro veri kontrol yazılımına geri dönün. Her iki itici şırınganın da ilgili solüsyonlarla dolu olduğunu ve itici pistonların itici şırınga pistonları ile temas halinde olduğunu doğrulayın.

Her iki vanayı da sürüş konumuna getirin ve sürüşü gerçekleştirmek için pro data kontrol yazılımındaki acquire (verileri al) düğmesine tıklayın. Sürüşlerden elde edilen A 452 nanometre değerini kullanarak enzimin okside formunun spektral verilerini üç paralel örnekle toplayın. Karıştırma öncesi enzim konsantrasyonunu belirleyin ve dört mililitre N-A-D-P-H çözeltisi hazırlayın.

1.5 kat daha konsantre olan N-A-D-P-H çözeltisi ile C rezervuar şırıngasını doldurun ve daha önce gösterildiği gibi durdurma şırıngasını üç kez boşaltıp yeniden doldurun. Şimdi, enzimin indirgenmesi sırasında spektrumları elde edin ve akış devresindeki içeriği anaerobik 100 millimolar potasyum fosfat tamponu pH 7.5 ile yıkayarak temizleyin. Şimdi pro veri kontrol yazılımındaki baseline düğmesine tıklayın.

Ardından, 200 µL enzim stok çözeltisini 1000 µL anaerobik, 100 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.5) ile karıştırın. Rezervuar şırınga A'daki çözeltiyi enzim çözeltisi ile değiştirin.

Pro veri kontrol yazılımında A valfini sürüş konumuna getirin. Şırınga boşaltma durdurma düğmesine tıklayın. İlgili sürüş ramini manuel olarak yukarı kaldırarak, enzim çözeltisini A sürüş şırıngasından akış devresine doğru itin.

Gecikme süresini 0,5 saniye ve veri toplama süresini 60 saniye olarak ayarlayın. Tüm itici şırıngaların ilgili çözeltilerle dolu olduğunu ve itici pistonların şırınga pistonlarıyla temas ettiğini doğrulayın. Ardından tüm itici vanaları itme konumuna getirin ve pro veri kontrol yazılımındaki acquire butonuna tıklayın.

Enzimin oksitlenmiş formunun spektral verilerini üç tekrarlı olarak elde edin. Ardından, rezervuar şırınga B'deki çözeltiyi, şırınga A'daki enzim çözeltisinden 1,5 kat daha konsantre bir N-A-D-P-H çözeltisi ile değiştirin. B valfini sürüş konumuna getirin ve kontrol paneli penceresinde daha önce gösterildiği gibi durdurma şırıngasını üç kez boşaltıp yeniden doldurun.

Gecikme süresini 0,5 saniye olarak ayarlayın. 20. saniyedeki bir ölçümde, rezervuar şırıngasındaki çözeltiyi oksijenli tampon ile değiştirin. C valfini sürüş konumuna getirin.

Pro data kontrol yazılımında üç kez yıkama (flush) işlemi gerçekleştirin. Gecikme süresini 15 saniye ve veri toplama süresini 900 saniye olarak ayarlayın. Stopped flow cihazında tamamen indirgenmiş enzimin yeniden yükseltgenmesi sırasında spektral veri toplamaya devam edin.

SID A'nın N-A-D-P-H ile anaerobik indirgenmesi, 452 nm'deki absorbans kullanılarak flavinin redoks durumundaki değişiklikler ölçülerek izlenebilir. Spektral değişiklikler, oksitlenmiş SID A'dan tamamen indirgenmiş SID A'nın son spektrumuna kadar zaman içinde kaydedilir. Bu enzimatik adımın hızı, verilerin uygun denklemle uydurulmasıyla belirlenebilir. Oksidasyon hızı ve reaksiyon ara ürünleri, bu reaksiyonda AF Sid A kullanılarak stopped flow cihazının çift karıştırma moduyla da belirlenebilir. C dört A Hidroksi flavin ara ürünü 380 nm'lik bir lambda maks ile net bir şekilde tespit edilirken, oksitlenmiş enzimin lambda maks değeri 450 nm'dir.

Bu teknik uzmanlaşıldığında, düzgün şekilde uygulandığı takdirde dört ila altı saat içinde tamamlanabilir. Çözeltilerin anaerobik olduğundan emin olmayı unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, hızlı kimyasal gibi daha ileri aşama deneylerden bağımsız olarak, FLA'nın hem relatif hem de ülseratif iyonunun nasıl araştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Quentin, ara ürünlerin sad doğasını aydınlatmaya yardımcı olabilir.