Name: Isolate A Genetik Ekran Toxoplasma gondii Host-hücre çıkış Mutants (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Öğrenin, Toxoplasma gondii'de ısıya duyarlı çıkış mutantlarını izole etmek için fenotipik tarama yöntemini. Kimyasal mutagenez ve hücre kültürü teknikleriyle parazit biyolojisini ve terapötik stratejileri keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği Scientist Kalkınma Hibe 0635480N ve Sağlık araştırmaları hibe AI081220 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edildi. BIC Tapınak Şövalyeleri Göz Vakfı araştırma bursu ile desteklenmektedir.

Genel bakış Protocols, ilk, parazitler% 70 (1 protokolü) öldürme mutagen dozaj tanımlamak için verilmiştir. Sonraki prosedürü bir mutagenized parazit havuzu (protokol 2, Şekil 2), indüklenen çıkış mutantlar zenginleştirmek için sağlanır. Bu, insidansı çıkış mutantların zenginleştirilmiş havuzda test etmek için, ya da, bireysel mutantlarındaki çıkış fenotip (protokol 3) doğrulamak için bir protokol ile takip edilmektedir. Sonuç olarak, bir protokol zenginleştirilen popülasyonlarının tek sınırlayıcı seyreltme (protokol 4) tarafından parazit klonlar oluşturmak üzere temin edilir. 1. Mutajen ve titrasyonu Yüksek mutajenik bileşikleri ve sıvılar ile çalışırken özel dikkat, çift eldiven gibi kullanın. Sıvı atıkların uygun şekilde bertaraf edilmesi için ayrı ayrı toplayın. <ol><li> T25 birleştirilebilmeli insan sünnet derisi fibroblast, taze eridi tachyzoites 1 ml (HFF) hücreleri doku kültürü şişeleri inoküle ve 37 saat 18-25 büyümeye °; C,% 5 CO2 altında, orta Ed1 (% 1 ısı ile inaktive edilmiş fetal bovin serumu, 0.2 mM L-glutamin, 50 U / ml penisilin, 50 ug / ml streptomisin, 0.25 ug / ml Amphotericin B, D-MEM ile desteklenmiş ). Bakınız Roos et al. HFF hücreler ve parazitler 21 genel büyüme ve medya için. </li><li> 10 dk için 10 ml% 0.1 fetal bovin serum (D-MEM içerisinde seyreltik Ed1 01:10), orta ve (burada 37 ° C inkübatöründe &quot;olarak da adlandırılır),% 5 CO2 altında nemli 37 ° C inkübatöründe bırakmak orta yerine . </li><li> (, Mutagen çalışma dilüsyonları 5 2.5 1.25, sırasıyla, 10 mM), şişeyi başına 0, 12.5, 25, 50, veya 100 ul&#39;lik ENU (DMSO içinde 1 M stok) veya EMS (DMSO içinde 1 M stok) ekleyin. Her balona 100 ul DMSO ekleyin. 4 saat için 37 ° C inkübatöründe inkübe. </li><li> 10 saniye süreyle, oda sıcaklığında 10 ml soğuk PBS (4 ° C&#39;de ön-soğutuldu) ile tek tabakalı durulama ile üç kez yıkanır. </li><li> 5 ml PBS ekleyin, gevşek kauçuk polis (hücre scr ile tek tabaka kazıyınaper), fibroblast (ağır makas, iğne maruz iğne dışında mili off klibi) parazit fiziksel kaldırmak için 26.5 G iğne ile kazınmış hücrelerin geçmek, 3.0 um polikarbonat filtre ve filtre. Birden fazla iğne pasajlar konak hücre parazit bırakmadan verimliliği artacaktır. </li><li> Parazit konsantrasyonu hemasitometre kullanarak güvenin. Parazitlerin sayma öncesi hemocytomer 5 dakika dinlendiriniz. </li><li> 3 ml başına 10,000 Ed1 parazitler (10 ml 33.333 parazitler için gerekli olan) parazitler seyreltilir. </li><li> 3 ml, seyreltilmiş parazitler (içeren 10.000 parazitler) içinde bir 6 kuyulu plakanın ile tek bir sıra inoküle. Seri HFF iyi ilk 300 ul aktararak 2.7 ml Ed1 içeren hücreleri ile 6-kuyu plaka konfluent 3 kuyu içinde 10 kat parazitler sulandırmak. 7 gün boyunca 37 ° C inkübatör rahatsız plakaları bırakın. </li><li> 15 dak 3 ml / iyi% 100 etanol düzeltmek, leke, orta aspire3 ml / kuyucuk kristal viyole çözeltisi (500 ml% 1 amonyum oksalat ile karıştırılarak 125 ml etanol içinde 12.5 g kristal menekşe) 15 dakika boyunca, 3 ml / durulama ve PBS (dakikada 1) ve hava kuru. Oda sıcaklığında. </li><li> Plaklar sayın ve mutajen konsantrasyonu maruz parazitler (% 70 öldürme dozajı: bkz. Şekil 1)% 30 sağkalım elde etmek için gerekli seçin. % 70 öldürme dozu tarihsel olarak 14 kullanılır ve daha az genom başına 100 nokta mutasyonları (Farrell, Marth, Gubbels ve ark., El yazması gönderilmektedir) ikna edildi. </li></ol> 2. Çıkış mutantlar zenginleştirilmesi (Şekil 2) <ol><li> Öldürme indüklenmesi% 70 oranında bir mutagen dozaj kullanılarak yukarıda tarif edildiği gibi mutajenez gerçekleştirir. Bir geçişi için yeni bir konakçı hücreler balonuna mutagenized nüfus Grow. </li><li> Bir mutagenized nüfusu 120.000 taze lizlendi parazitler 10 ml Ed1, T25, HFF konfluent doku kültürü şişesi bulaştırmak. % 5 CO altında 2 saat süreyle 35 ° C inkübatöründe inkübe2 ve nemlenince (buradan sonra &quot;35 ° C inkübatöründe&quot; olarak adlandırılır). </li><li> , Orta ve 10 saniye daha sonra, 10 ml soğuk PBS ile durulama ve 10 ml Ed1, orta 25 mg / ml dekstran sülfat (DS), 13 ile takviye eklemek aspire edin. % 5 CO2 ve nemlenince (buradan sonra 40 ° C inkübatöründe &quot;adı verilen) altında 26 saat süreyle 40 ° C inkübatöründe inkübe. </li><li> Çıkış zenginleştiricilerin çalışma çözeltisi hazırlayın. 25 mg / ml DS ile desteklenmiş 10 ml HBSSc içeren 15 ml Falcon tüp çalışma konsantrasyonu az tercih çıkış indükleyici sulandırınız. Pre-dilüsyonları sıcak 30 dakika süreyle 37 ° C&#39;de su banyosunda. Çalışma konsantrasyonları için Tablo 1&#39;e bakınız. </li><li> Aspire parazit enfeksiyonlu şişeler orta ve önceden ısıtılmış bir çıkış indükleyicisidir çözümü ekleyin. Tablo 1 &#39;de gösterilen kez, 37 ° C inkübatöründe inkübe. </li><li> Orta aspire edin ve 10 ml soğuk PBS ile 10 saniye yıkayın ve daha sonra 10 ml Ed1 25 mg / ml DS ve 50 mM pirolidin ditiyokarbamatın ile desteklenmiş (PDTC ekleyin: reklam100 mM PDTC PBS içinde Stok d 5 ul) 13. 5 saat 35 ° C&#39;de inkübatöründe inkübe. </li><li> , Orta aspire edin ve 10 ml PBS (oda sıcaklığı) ile bir kez, 10 saniye daha sonra durulama ile 10 ml Ed1, orta eklemek. Günlük erlenlere: Çok parazitleri, monolayer yok kadar 35 ° C inkübatör geri mataralar koyun. Bu kurtarma 7 gün sürer. </li></ol> 3. Çıkış analizleri ile mutant fenotipleri Geçerliliği , Zenginleştirme ekran ve HFF hücrelerinde bir geçiş için zenginleştirilmiş nüfus büyüyor sonra, fenotipleri bir çıkış testi 11,13 teyit etmeniz gerekecek. Bu testte de protokolü 4 sonra tek klonları doğrulamak için kullanılmalıdır. <ol><li> Lamelleri (ortalama 1 ml Ed1 orta) yetiştirilen konfluent HFF hücreleri içeren bir 24 plaka başına 20.000 parazitler içine inoküle. Aktarmak için bir 40 ° C inkübatöründe 24 saat ve sonra 8 saat 35 ° C&#39;de inkübatöründe inkübe. </li><li> 1 ml / PBS (1 ile yıkayıpOda sıcaklığında, 0 saniye). 1 ml çıkış indükleyicilerin (sadece negatif kontrol içerir DMSO), pre-ılıtıldı ve HBSSc içinde seyreltilmiş ve Tablo 1 &#39;de tarif edilen kez için inkübe. </li><li> , Orta aspire edin ve 1 ml / 15 dk için oda sıcaklığında% 100 metanol ile düzeltmek. </li><li> Mutajenez bir autofluorescent protein ifade ebeveyn parazitler için kullanılmış olsaydı, # 3.5 13 adıma geçin. Olmayan floresan proteini ifade parazitler ebeveyn hattı olarak kullanılmış olsaydı, Diff-Quick az 1 oda sıcaklığında 11 dakika boyunca leke ile sabit lamelleri leke. </li><li> , Oda sıcaklığında 24-kuyulu plakanın 5 dakika içerisinde, 1 ml / kuyucuk PBS ile yıkanır. </li><li> Floresan proteini ifade parazitler için: hızlı durulama lamel, GKD 2 O (daldırma) ve floresan sinyal korumak için gelmount altında kızaklar üzerinde monte. Diff-Quick lekeli parazitler için,% 100 etanol içinde 10 saniye yıkayın ve slayt üzerinde monte etmeden önce hava kurumasını bekleyin. </li><li> (Floresan) mikroskop kullanma40-60x objektif vakuoller yüzdesi, vakuol karşı (bkz. Şekil 4) intrasellüler kaldı egressed saymak. </li></ol> 4. Seyreltme sınırlayıcı çıkış mutantlar Clone Fenotip 3 protokol kullanılarak zenginleştirilmiş çıkış mutant nüfus doğrulama sonra, poliklonal nüfus klonlanmış tek parazittir klonlar elde etmek için gereken. <ol><li> , Bir hemositometre parazit nüfus sayımı ve orta Ed1 mililitrede 500 parazitlerin konsantrasyonu ye tamamlanır. </li><li> Konfluent monolayer HFF hücreleri içeren bir 384-plaka, 40 ul / iyi Ed1 çok kanallı pipetlemeyin kullanarak orta orta değiştirin. Pipetlemeyin 40 ul / kuyucuk kuyulara C3-C12, mutant 2 C13-C22 kuyulara, H3-H12 kuyulara içine mutant 3, mutant içine seyreltilmiş mutant 1, Şekil 5 &#39;de gösterildiği gibi, dört poliklonal popülasyonlarının aşağıdaki gibi plaka başına klonlanmış edilebilir: H13-H22 kuyu içine 4 (kuyularda sonu hacmi 80 ul). Sol bir multi-kanal pipeti, pipet kullanarakution yukarı ve aşağı 5 kere, daha sonra başlayan satırı aşağıdaki satır (sıra C, D veya satır H I) 40 ul aktarmak. Bu, 2-kat seri seyreltiler, satır G (1 ve 2 mutantlarının) veya N satır (mutantlarının 3 ve 4) aracılığıyla devam edin. Son satır fazladan 40 ul atın. Plaka bozmadan 7-10 gün boyunca 35 ° C inkübatör inkübe edin. </li><li> Görünür, monolayer &#39;delik&#39; olarak tek bir plak varlığı için bir 10-20x objektif, ters bir mikroskop kuyu kontrol edin. </li><li> Tek bir plak, mutant başına 4 kuyu Pick ve HFF hücreleri ile doku kültürü şişesi konfluent parazitleri aktarmak ve Ed1 orta dolu. 35 ° C inkübatör parazitler büyüyünce;, ekstrasellüler parazit dağıtmak için günlük şişeler salla. Bu genellikle 7 gün sürer. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Mutajenler TRK ve EMS uzun süreler boyunca depolanan sabit değil. Bu nedenle,, mutajenik güç testhisse senetleri tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kritik önem taşımaktadır. Tipik titrasyon TRK ve hem de EMS eğrileri öldürme sonuçlarını ve Şekil 1 &#39;de gösterilmektedir. Ancak, bu, mutagenez deney için uygun dozu kullanılmış olduğunu tespit etmek için her türlü plak testleri gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Mutagenized parazit nüfus çeşitliliği korumak için, mümkün olduğunca çabuk çıkış mutant ekran ile devam etmek önemlidir. Tipik olarak, yeni bir balona parazitlerin bir geçit kalan parazitler ekran ile ileri gitmeden önce kurtarmak için yapılır. Bunu yaparken, mutantlar bölümü neden olacağını akılda tutulmalıdır. Bu nedenle tüm prosedürü tamamladıktan sonra izole edilen birden fazla klonal mutantların aynı genotip içerdiğini göz ardı edilemez. Fenotipleri (örneğin diferansiyel çıkış indükleyici hassasiyetleri) olmadıkça, onu, mutagenez başına tek bir çıkış mutant izole edilmesi tavsiye edilir aynı mutant birden çok kez izole önlemek içinbirbirlerine çok farklı olabilir. Diğer taraftan,, fenotip arzu edilen mutantların izolasyonu içinde, her bir ekranın sonuçlanır. Özelde, Ca-2 + iyonofor A23187 dirençli fenotip, nadir ve tek bir çıkış mutant izole etmek için çoklu mutajenez deneyler ve ekranlarını gerektirir. Bu nedenle paralel olarak 5-10 mutagenez ve ekran deneyleri gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Zenginleştirme güç ekranın farklı oranlarda yaban-tip parazitler karıştırma ile, bilinen bir çıkış mutant ile test edilmiştir. Bu karışımları ekranında tabi tutuldu ve, zenginleştirilmiş popülasyonda mutant fenotip sıklığı ölçüldü. Sitoplazmik YFP ifade wild-tip, sitoplazmik RFP ifade parazitler ve bir mutant hattı kullanarak insidansı 13 flow sitometri (Şekil 3) tarafından hızlı bir şekilde kurulabilir. Sonuçları mutant fenotipleri rutin 10.000 wild-tip p başına 1 mutant parazit çıkış ile başlayan 80% saflıkta zenginleştirilmiş olabilirarasites 13. Ancak, ne zaman çıkış mutant: wild-tip parazit başlama oranı, 1:100,000 parazitler ise, izole nüfusun sadece% 1-2 (1:100) çıkış mutantlar. Bu nedenle ekranın zenginleştirme gücü 1.000 kat. Ekranı tipik olarak% 70 geçerli olan 120.000 parazitler, aşılama ile başlayan bu yana, biz genellikle iki tur zenginleştirme gerçekleştirmek. Izole parazit zenginleştirme tur arasında büyüdü. Bu prosedür, yaban-tip parazitler 1:1,000,000 çıkış mutant ile başlayarak zaman dahi% 100 mutant nüfusu yol açar. , Fenotipleri doğrulamak ve karakterize etmek için çıkış testi bireysel vakuol farklılaşmasını sağlayan konak hücre enfeksiyon çokluğu gerektirir. Bireysel parazitlerin etrafa dağılmış olarak yüksek oranda çıkış koşulları analiz ederken bu özellikle önemlidir. Şekil 4 &#39;de gösterildiği gibi, egressed popülasyonlarının ayrılmış değilse yüzdesi düşük kolaydırbir vakuol olarak iki egressed vakuol sayma tarafından çıkış. Çıkış ve işgali ile ilgili süreçleri ve bazı ısıya duyarlı fenotipleri düşük sıcaklıkta hafif bir fenotip gösterilecek yana değil, tüm mutantlar benzer işgali verimliliği olacaktır. Böyle mutantlar nedenle kendi çıkış fenotip doğru bir değerlendirme için yeterince yüksek bir bir vakuol yoğunluğu elde etmek için birkaç kat daha yüksek dozlarda inoküle gerekir. Ayrıca, bazı çıkış indükleyicileri verimli dört veya daha az parazit içeren vakuoller çıkış teşvik etmemektedir. Bunun gibi, zaman çıkış assay başlangıç ​​Vakuollerin sekiz ya da daha fazla parazitler içeren çok önemlidir. Laboratuarımızda biz ekran mutantlar, diğer çıkış arttırıcılar karşı belirli bir çıkış zenginleştirici ile izole. Kendi çapraz reaktivite profilleme mutantların farklı sınıflarda toplanabilir. Son olarak, tüm çıkış mutantlar ısıya duyarlı olacaktır. , Çıkış indükleyicileri intracellula yayımlanmasından önce adımları tetikleme ile izole özellikle mutantlarr Ca 2 + olmayan ısıya duyarlı fenotipleri yatkındır. Bu sinyal, hücre içi Ca 2 + sürümü yakınsar önce çıkış yol açabilir paralel yollara kaynaklanmaktadır. <img alt="Şekil 1." src="/files/ftp_upload/3807/3807fig1.jpg" /> Şekil 1. Kimyasal mutajen doz titrasyonu. A. Plak Testler çeşitli EMS konsantrasyonları ve çeşitli sayıda da belirtilmektedir başına parazit kullanarak 6-kuyu plaka yapılan. Beyaz noktalar parazit plaklar içinde HFF mono tabakasında oluşturulmuş B, Çeşitli dozajlar için EMS (B) ve TRK (C) maruz bağlı parazitlerin C. sağkalım eğrileri. Survival plak analizleri ile değerlendirildi. % 70 öldürme uyararak doz mutagenez deneyleri için seçilir. , Üç bağımsız deneyin ortalamasını + / - standart sapma gösterilmiştir. <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3807/3807fig2.jpg" /> <strong&gt; Şekil 2. Zaman ilerlemesi x-ekseni tarafından temsil edilir ise çıkış mutant zenginleştirme ekranın şematik gösterimi. Sıcaklık, y ekseni üzerinde gösterilir. Yeşil parazitler kırmızı parazit wild-tip parazitler yansıtmaktadır çıkış mutant parazitler, yansıtmaktadır. Zamanlama çıkış indükleyici koşulları ve stimülasyon değişiklikleri üst kısmında gösterilir ve, sıcaklık profili yansıtan mavi çizgi üzerinde oklarla işaretlenmiştir. Benimsenen Eidell ve ark. 13 <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/3807/3807fig3.jpg" /> Şekil 3. Tipik çıkış mutant fenotipleri zenginleştirme çeşitli oranlarda (x-ekseni) wild-tip parazitler karıştırılarak bir çıkış mutant zenginleştirilmesi sonuçları. Ekrandan sonra büyümüş nüfus çıkış mutant fenotipleri yüzdesi y ekseni çizilir ve akım sitometri (çıkış mutant parazitlerin sitoplazmik YFP ifade ile değerlendirildi, wild-tip parazitler cy ifade) RFP toplasmic. Üç bağımsız deney sonuçları, kırmızı, mavi ve yeşil veri noktaları ile temsil edilmektedir. Benimsenen Eidell ve ark. 13 <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/3807/3807fig4.jpg" /> Şekil 4. Tipik bir çıkış testinin sonuçları. . Oklar 4-8 parazit içeren dört farklı bozulmamış vakuol işaretleyin. B. Oklar dört bağımsız egressed vakuol yansıtan dağınık parazitlerin dört gruba işaretleyin. A23187 (B) veya DMSO ile çıkış (A) bir negatif kontrol olarak indüklenen. Parazitler sitoplazmik YFP 22 ifade. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3807/3807fig5.jpg" /> Şekil 5, , Klonal parazit çizgiler. Dört poliklonal popülasyonları (kırmızı, mavi, sarı, yeşil) için seri seyreltme, seri HFF hücreleri ile tek bir 384-plaka confluent seyreltilir. Satır C ve başına 10 parazitleri almak veseyreltilmiş (40 ul + 40 ul) sırasıyla H ve N, satırlar kadar 2-kat. Gri tonunu iyi başına parazitlerin azalan sayısını gösterir. Tipik olarak, tek bir klonlar, DF ve JL satırlar bulunmuştur. <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşik </td><td> Hisse senedi </td><td> Çalışma konsantrasyonu </td><td> T25 (10 ml) için ihtiyaç duyulan ul </td><td> İnkübasyon süresi (dk) </td></tr><tr><td> DTT </td><td> DMSO içinde 1 M </td><td> 5 mM </td><td> 50 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> etanol </td><td> 190 Proof </td><td> % 5 </td><td> 500 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> A23187 </td><td> DMSO içinde 2 mM </td><td> 1 uM </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> nigericin * </td><td> DMSO içinde 2 mM </td><td> 10 uM </td><td> 50 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> * Nigericin zenginleştirmek kullanılamazparazitler olarak Ment ekran nigericin stimülasyon hayatta değil; sadece çıkış mutantların doğrulama nigericin kullanın. Tablo 1 işlemlerde kullanılan çıkış indükleyicileri. 25 mg / ml ekran veya mutant doğrulama (çıkış testi) için hiçbir DS DS içeren 10 ml HBBSc sulandırınız. Tüm bileşikler, Sigma-Aldrich.

<ol><li>Carruthers, V. B., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+and+acetaldehyde+elevate+intracellular+%5BCa2%2B%5D+and+stimulate+microneme+discharge+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Ethanol and acetaldehyde elevate intracellular [Ca2+] and stimulate microneme discharge in Toxoplasma gondii.</a> Biochem. J. 342 (Pt 2), 379-386 (1999).</li>
<li>Moudy, R., Manning, T. J., Beckers, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loss+of+cytoplasmic+potassium+upon+host+cell+breakdown+triggers+egress+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The loss of cytoplasmic potassium upon host cell breakdown triggers egress of Toxoplasma gondii.</a> J. Biol. Chem. 276 (44), 41492-41501 (2001).</li>
<li>Silverman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+activation+of+the+Toxoplasma+gondii+nucleoside+triphosphate+hydrolase+leads+to+depletion+of+host+cell+ATP+levels+and+rapid+exit+of+intracellular+parasites+from+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Induced activation of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase leads to depletion of host cell ATP levels and rapid exit of intracellular parasites from infected cells.</a> J. Biol. Chem. 273 (20), 12352-12359 (1998).</li>
<li>Stommel, E. W., Ely, K. H., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+dithiol-induced+Ca2%2B+flux+causes+egress+of+parasites+from+the+parasitophorous+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: dithiol-induced Ca2+ flux causes egress of parasites from the parasitophorous vacuole.</a> Exp. Parasitol. 87 (2), 88-97 (1997).</li>
<li>Fruth, I. A., Arrizabalaga, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+induction+of+egress+by+the+potassium+ionophore+nigericin%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: induction of egress by the potassium ionophore nigericin.</a> Int. J. Parasitol. 37 (14), 1559-1567 (2007).</li>
<li>Endo, T., Sethi, K. K., Piekarski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+calcium+ionophore+A23187-mediated+exit+of+trophozoites+from+infected+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: calcium ionophore A23187-mediated exit of trophozoites from infected murine macrophages.</a> Exp. Parasitol. 53 (2), 179-188 (1982).</li>
<li>Hoff, E. F., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+Toxoplasma+egress+the+first+step+in+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Is Toxoplasma egress the first step in invasion.</a> Trends Parasitol. 18 (6), 251-255 (2002).</li>
<li>Wetzel, D. M., Chen, L. A., Ruiz, F. A., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-mediated+protein+secretion+potentiates+motility+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium-mediated protein secretion potentiates motility in Toxoplasma gondii.</a> J. Cell. Sci. 117 (Pt 24), 5739-5748 (2004).</li>
<li>Lourido, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+protein+kinase+1+is+an+essential+regulator+of+exocytosis+in+Toxoplasma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma.</a> Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).</li>
<li>Arrizabalaga, G., Ruiz, F., Moreno, S., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionophore-resistant+mutant+of+Toxoplasma+gondii+reveals+involvement+of+a+sodium%2Fhydrogen+exchanger+in+calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ionophore-resistant mutant of Toxoplasma gondii reveals involvement of a sodium/hydrogen exchanger in calcium regulation.</a> J. Cell. Biol. 165 (5), 653-662 (2004).</li>
<li>Black, M. W., Arrizabalaga, G., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionophore-resistant+mutants+of+Toxoplasma+gondii+reveal+host+cell+permeabilization+as+an+early+event+in+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ionophore-resistant mutants of Toxoplasma gondii reveal host cell permeabilization as an early event in egress.</a> Mol. Cell. Biol. 20 (24), 9399-9408 (2000).</li>
<li>Chandramohanadas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apicomplexan+Parasites+Co-Opt+Host+Calpains+to+Facilitate+Their+Escape+from+Infected+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Apicomplexan Parasites Co-Opt Host Calpains to Facilitate Their Escape from Infected Cells.</a> Science. , (2009).</li>
<li>Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+screen+to+dissect+Toxoplasma+gondii+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Pfefferkorn, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+isolation+and+preliminary+characterization+of+temperature-sensitive+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: isolation and preliminary characterization of temperature-sensitive mutants.</a> Exp. Parasitol. 39 (3), 365-376 (1976).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+use+of+mutants+to+study+the+host-parasite+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Ciba.+Found.+Symp%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: use of mutants to study the host-parasite relationship.</a> Ciba. Found. Symp. 99, 74-91 (1983).</li>
<li>Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+complementation+in+apicomplexan+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genetic complementation in apicomplexan parasites.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (9), 6304-6309 (2002).</li>
<li>White, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+rescue+of+a+Toxoplasma+gondii+conditional+cell+cycle+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic rescue of a Toxoplasma gondii conditional cell cycle mutant.</a> Mol. Microbiol. 55 (4), 1060-1071 (2005).</li>
<li>Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+Genetic+Analysis+of+the+Apicomplexan+Cell+Division+Cycle+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Forward Genetic Analysis of the Apicomplexan Cell Division Cycle in Toxoplasma gondii.</a> PLoS Pathog. 4 (2), e36-e36 (2008).</li>
<li>Carruthers, V. B., Hakansson, S., Giddings, O. K., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+uses+sulfated+proteoglycans+for+substrate+and+host+cell+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii uses sulfated proteoglycans for substrate and host cell attachment.</a> Infect. Immun. 68 (7), 4005-4011 (2000).</li>
<li>Camps, M., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+selective+killing+of+extracellular+parasites+by+oxidation+using+pyrrolidine+dithiocarbamate%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: selective killing of extracellular parasites by oxidation using pyrrolidine dithiocarbamate.</a> Exp. Parasitol. 98 (4), 206-214 (2001).</li>
<li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods Cell Biol. 45, 27-63 (1994).</li>
<li>Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+growth+assay+for+Toxoplasma+gondii+using+yellow+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput growth assay for Toxoplasma gondii using yellow fluorescent protein.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 309-316 (2003).</li>
<li>Carey, K. L., Westwood, N. J., Mitchison, T. J., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+approach+to+studying+invasive+mechanisms+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A small-molecule approach to studying invasive mechanisms of Toxoplasma gondii.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (19), 7433-7438 (2004).</li>
<li>Kafsack, B. F., Carruthers, V. B., Pineda, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+modeling+of+Toxoplasma+gondii+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetic modeling of Toxoplasma gondii invasion.</a> J. Theor. Biol. 249 (4), 817-825 (2007).</li>
<li>Hanash, S. M., Boehnke, M., Chu, E. H., Neel, J. V., Kuick, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonrandom+distribution+of+structural+mutants+in+ethylnitrosourea-treated+cultured+human+lymphoblastoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Nonrandom distribution of structural mutants in ethylnitrosourea-treated cultured human lymphoblastoid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 (1), 165-169 (1988).</li>
<li>Kafsack, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+membrane+disruption+by+a+perforin-like+protein+facilitates+parasite+exit+from+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rapid membrane disruption by a perforin-like protein facilitates parasite exit from host cells.</a> Science. 323 (5913), 530-533 (2009).</li>
<li>Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+microneme+secretion+involves+intracellular+Ca%282%2B%29+release+from+inositol+1%2C4%2C5-triphosphate+%28IP%283%29%29%2Fryanodine-sensitive+stores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores.</a> J. Biol. Chem. 277 (29), 25870-25876 (2002).</li>
<li>Nagamune, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abscisic+acid+controls+calcium-dependent+egress+and+development+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii.</a> Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).</li>
<li>Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Externally+triggered+egress+is+the+major+fate+of+Toxoplasma+gondii+during+acute+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection.</a> J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).</li>
<li>Persson, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+receptor+ligation+or+exposure+to+perforin+trigger+rapid+egress+of+the+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Death receptor ligation or exposure to perforin trigger rapid egress of the intracellular parasite Toxoplasma gondii.</a> J. Immunol. 179 (12), 8357-8365 (2007).</li>
</ol>

Biz ifşa şey var.

<html> Açıklanan protokol bir çıkış defekt ile Toxoplasma mutantlar izole etmek için etkili bir yöntem sağlar. Biz çıkış yolu, bir çift işgali fenotip 13 bazıları çeşitli adımlar boyunca başarıyla mutantlar izole. Işgali üzerine potansiyel etkileri diferansiyel antikor boyama 23,24 ile parazit olmayan işgal istila birbirinden ayırmış sözde kırmızı-yeşil testi kullanılarak tespit edilebilir. Hem işgali ve çıkış testleri için bu, parazitler 13,22 sitoplazmada bir autofluorescent pr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> TRK </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N3385 </td><td> -20 ° C&#39;de deposunda DMSO, 1 M Stok </td></tr><tr><td> EMS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0880 </td><td> -20 ° C&#39;de deposunda DMSO, 1 M Stok </td></tr><tr><td> Dekstran Sülfat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4911 </td><td></td></tr><tr><td> PDTC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8765 </td><td> PBS içinde 100 mM Stok </td></tr><tr><td> Ocak Şubat Mart Nisan Mayıs Haziran Temmuz Ağustos Eylül Ekim Kasım Aralık Hızlı </td><td> Merck Kimyasallar </td><td> 65044-93 </td><td></td></tr><tr><td> Filtre tutucu </td><td> Cole-Parmer </td><td> 540100 </td><td></td></tr><tr><td> 3 mikron polikarbonat filtre </td><td> WhatmanSchleicher &amp; Schuell </td><td> 110612 </td><td></td></tr><tr><td> Hemositometre </td><td> Hausser Bilimsel </td><td> 1475 </td><td></td></tr><tr><td> 2 inkübatör CO </td><td> Çeşitli üreticiler, </td><td></td><td> Nemlendirilmiş, 35, 37 ve 40% 5 CO2 ° C </td></tr><tr><td> Flöresanlı mikroskop </td><td> Çeşitli üreticiler, </td><td></td><td> İdeal 63x veya 100x petrol hedefi ile ters, geniş alan </td></tr></tbody></table> HBSSc (Black ve ark 11&#39;e göre): <ul><li> 98.0 ml Hanks Balanced Salt Solüsyonu (Hyclone katalog numarası SH30588) </li><li> 100 ul 1M MgCl2 (100 mM sonu) </li><li> 100 ml 1 M CaCI2 (100 mM sonu) </li><li> 2.0 mL 1M Hepes, pH 7.3 (20 mM sonu) </li><li> 84 mg NaHCO 3 (10 mM sonu) </li></ul>

isolate a genetik ekran toxoplasma gondii host-hücre çıkış mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Yaygın, zorunlu hücre içi protozoon parazit Toxoplasma gondii immün yetmezlikli hastalarda fırsatçı hastalığa yol açan ve konjenital enfeksiyon üzerine doğum kusurlarına neden olur. 1: litik replikasyon siklusu üç aşama ile karakterize edilir. çekirdekli bir konak hücre aktif invazyonu; 2. konak hücre içine replikasyon; 3. konakçı hücreye aktif çıkış. Acil tahliye mekanizma hala tam olarak moleküler düzeyde anlaşılır bir benzersiz, son derece düzenlenir süreci, giderek takdir ediliyor. Çıkış yatan sinyal yollarının yolları farklı yönlerini 1-5 üzerinde etkili farmakolojik ajanların kullanımı ile karakterize edilmiştir. Gibi çıkış birkaç bağımsız tetikler hücre içi Ca 2 sürümü üzerinde birleşmemiz tespit edilmiştir +, konak hücre işgali 6-8 için de kritik olan bir sinyal. Bu anlayış tanımladı yol açan bir aday gen yaklaşımı bilgilendirdification bitki, çıkış 9 içerisinde yer alan, kalsiyum bağımlı protein kinaz (CDPK) gibi. Buna ek olarak,, anlayış çıkış birkaç son buluşların (kimyasal) genetik yaklaşımlar kullanılarak 10-12 yapılmıştır. Toxoplasma artan genetik erişilebilirlik ile farmakolojik bilgi zenginliği birleştirmek için biz son konak hücrenin çıkış 13 bir kusur ile parazit mutantlar için zenginleşmesine izin veren bir ekran kuruldu. Rutin fenotipleri 16 haline 11,14,15 Toxoplasma biyolojisi çalışmada, yıllar boyunca kullanılan N-etil-N-nitrozoüre (TRK) veya etil metansülfonat (EMS) kullanılarak kimyasal mutajenez olmakla birlikte, sadece son yatan mutasyonlar genetik mapping of -18. Ayrıca, ısıya duyarlı mutantlar, gerekli süreçler disseke edilebilir ve altta yatan genleri doğrudan tespit. Bu mutantlar müsamahakar sıcaklığı (35 ° C) altında vahşi türü olarak davranır, ancak p başarısızbir sonucu olarak, söz konusu mutasyonu, kısıtlayıcı sıcaklığında (40 ° C) roliferate. Burada mutantlarının ısıya duyarlı bir çıkış fenotip 13 ile izole etmek için yeni bir fenotipik bir tarama yöntemi göstermektedir. Meydan çıkış ekranlar için yeniden işgali ve parazitlerin konak hücreleri için genel yapışkanlık hızlı karmaşık,-egressed olmayan parazitler, egressed ayrılması için. Daha önce kurulmuş bir çıkış ekran, ekstrasellüler parazitler 11 intrasellüler ayırmak için adımları biyotinilasyon hantal bir serisi dayanmaktadır. Bu yöntem aynı zamanda zayıf fenotipleri sonuçlanan koşullu mutantlar oluşturmak vermedi. Burada açıklanan yöntem,, parazitleri 19 konak hücre yapışmasını engelleyen glukanıdır bir rakip, dekstran sülfat (DS) de dahil olmak üzere parazitler egressing güçlü bağlılıklarının üstesinden gelir. Ayrıca, ekstraselüler parazitleri özellikle hücre içi parazit bırakır, pirolidin ditiyokarbamatın (PDTC), tarafından öldürüldü20 sağ salim. Bu nedenle, özellikle, indüklenen çıkış hatalarına parazit mutantlar izole etmek için yeni bir fenotipik ekran, genetik güç artık tamamen konak hücre çıkış yatan moleküler mekanizmalar çözülmeye dağıtmış olabilir.

İleri genetik, moleküler düzeyde nasıl aydınlatmak için güçlü bir yöntemdir<em&gt; Toxoplasma</em&gt; Onun konakçı hücre gelen egresses. Protokoller, kimyasal parazitler mutagenize için sağlanan indüklenen çıkış defekti olan mutantlar için zenginleştirmek, ve klonlanmış mutantlar fenotip doğrulamak.

Isolate A Genetik Ekran Toxoplasma gondii Host-hücre çıkış Mutants

Yaygın olarak görülen, zorunlu intrasellüler bir protozoon parazit olan Toxoplasma gondii, immün yetmezliği olan hastalarda oportünistik hastalıklara yol açar ve doğum...

Bu video, sıcaklığa duyarlı çıkış fenotipine sahip mutantları izole etmek için kullanılan yeni bir fenotipik tarama yöntemini göstermektedir. Mutajen ve parazitler, Toxoplasma ile enfekte edilmiş insan sünnet derisi fibroblast kültürlerine uygulanır. İki saat boyunca, istila etmeyen parazitler uzaklaştırılır ve fenotip gelişimini tetiklemek için erlenmayer 40 °C'ye aktarılır.26 saat sonra, vakuoller sekiz ila 16 parazit içerir. Ardından hücreler, çıkışı tetikleyen bileşiklerle uyarılır. Çıkış mekanizmasında defekt bulunan mutant parazitler hücre içinde kalırken, yaban tipi parazitler besiyerine çıkış yapacaktır.Yabani tip parazitler yıkama ile uzaklaştırılır ve mutant popülasyonunu zenginleştirmek için geri kalan hücreler tekrar 35 °C'de inkübe edilir. Son olarak, mutant fenotip doğrulanır ve zenginleştirilmiş popülasyondan sınırlayıcı dilüsyon yoluyla tekil parazit klonları izole edilir. Bu tekniğin, biyo-inhalasyon yöntemi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çıkış (egress) mutantlarının spesifik zenginleştirilmesinin çok daha verimli olmasıdır.Bu yöntemin fikrini ilk olarak, büyüme kusurları olan bir mutant panelinden bir çıkış (egress) mutantı tanımladığımızda edindik. Bu mutantı kullanarak, vahşi tip parazitlerle çeşitli oranlarda karıştırarak tarama prosedürünü optimize ettik. Prosedürü uygulamalı olarak gösterecek olan kişi, laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan Bradley Coleman'dır.Bu prosedür, enfeksiyöz parazitin yanı sıra yüksek derecede mutajenik bileşikler ve sıvılar kullanmaktadır. Toxoplasma Gandhi çalışırken laboratuvar önlüğü, çift eldiven ve biyolojik güvenlik kabini dahil olmak üzere uygun koruyucu ekipmanların kullanılması esastır. Oluşan tüm sıvı atıklar, uygun şekilde imha edilmek üzere ayrı olarak toplanmalıdır.İşleme, konfluen insan sünnet derisi fibroblastı veya HFF hücrelerini, bir mililitre taze lize edilmiş tachy Lloyds in ed one ortamı ile inoküle ederek başlayın. Ardından flaskı, %5 CO2 içeren, nemlendirilmiş 37 °C'lik bir inkübatöre 18 ila 25 saat boyunca yerleştirin. Ertesi gün, ortamı 10 mililitre %0,1 fetal bovin serum içeren ortamla değiştirin ve 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından her bir flaska sırasıyla 0, 12.5, 25, 50 veya 100 mikrolitre ENU mutajeni ekleyin. Çalışma dilüsyonları sırasıyla 1.25, 2.55 ve 10 milimolar olacaktır. Her bir flaska 100 mikrolitreye kadar DMSO ekleyin.37 °C'lik bir inkübatörde dört saat boyunca inkübe edin. Monotabakayı 10 mL soğuk PBS ile 10 saniye boyunca 3 kez durulayın. Beş mL PBS ekleyin ve monotabakayı serbest bırakmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.Ardından, ağır hizmet tipi bir makas kullanarak, iğne açıkta kalmayacak şekilde iğne kapağının ucunu kesin. Sonra, hücreleri bir şırıngaya aktarın ve 26.5 gauge bir iğneden geçirin. Parazitleri fibroblastlardan fiziksel olarak uzaklaştırmak için, iğneden birden fazla kez geçirmek parazitlerin konak hücreden salınma verimliliğini artıracaktır.Bir şırıngaya 3.0 mikrometre polikarbonat filtre takın. Hücrelerin ötesindeki iğneyi şırıngaya yerleştirin ve onları filtreden geçirerek bir tüpe itin; ardından parazitleri sayım için bir hemositometreye aktarın. Bu prosedürün en zor yönü, parazitleri kalıntılardan ayırt etmektir.Başarıyı garanti altına almak için, sayım yapmadan önce parazitlerin çökmesine izin vermeniz önemlidir. Parazitlerin beş dakika boyunca çökmesini bekledikten sonra onları sayın. Toxoplasma konsantrasyonu belirlendikten sonra, bunları 10 mL ED one içerisinde mililitre başına 3.333 parazit olacak şekilde dilüe edin.33,333 parazit gereklidir. HFF hücrelerinin bulunduğu altı kuyucuklu bir plakadaki ilk kuyucuğa, hücreleri 10,000 parazit ile inoküle etmek için üç mililitre ekleyin. Ardından, bir kuyucuktan bir sonrakine 300 mikrolitre transfer ederek parazitleri sonraki üç kuyucuk boyunca on kat seri dilüe edin.Plakaları 37 derece Celsius'lik inkübatörde yedi gün boyunca rahatsız etmeden bırakın. Bir hafta geçtikten sonra, besiyerini aspire edin ve her kuyucuğa 15 dakika boyunca üç mililitre %100 etanol ekleyerek hücreleri fikse edin. Etanolü uzaklaştırdıktan sonra, her kuyucuğa 15 dakika boyunca üç mililitre kristal viyole çözeltisi ekleyerek hücreleri boyayın.Son olarak, her kuyucuğu üç mililitre PBS ile bir dakika boyunca durulayın. Plaka kuruduğunda plakları sayın ve maruz kalan parazitlerin %30 oranında sağ kalmasını sağlamak için gereken mutajen konsantrasyonunu belirleyin. Tarihsel olarak %70 öldürme dozu kullanılmıştır ve bu doz genom başına 100'den az nokta mutasyonuna neden olur.Prosedürün bir sonraki adımı, popülasyondaki çıkış mutantlarını zenginleştirmektir. Popülasyon genişletildikten sonra, 10 mililitredeki konfluent HFF hücrelerine 120.000 taze lize edilmiş parazit ekleyin. Ardından 35 °C'de iki saat boyunca inkübe edin.Bu işlem, invazyon süresini sınırlayarak popülasyonu senkronize edecektir. İnkübasyonun ardından, medyumu aspire edin ve hücreleri 10 ml soğuk PBS ile 10 saniye boyunca durulayın. Ardından, 25 mg/mL dekstran sülfat ile desteklenmiş 10 ml DMEM ekleyin.Bu işlem, parazitlerdeki glikan bağlayıcı yüzey proteinlerini doyurarak konak hücreye yeniden tutunmalarını ve hücreyi yeniden istila etmelerini önleyecektir. Balonu, %5 CO2 içeren, nemlendirilmiş bir inkübatörde 40 °C'de 26 saat boyunca inkübe edin. Bu süre zarfında, normal katlanmış proteinlerin yerini yanlış katlanmış sıcaklığa duyarlı proteinler alacaktır.Ertesi gün, seçilen egress indükleyicisini, 10 mL %25 mg/mL dekstran sülfat takviyeli HBSS içeren 15 mililitrelik bir tüp içerisinde çalışma konsantrasyonuna seyreltin. Çözeltiyi ön ısıtma için 30 dakika boyunca bir benmariye yerleştirin.Parazit enfekte flasklardaki besiyerini aspire edin ve önceden ısıtılmış çıkış indükleyici solüsyonu ekleyin. Eşlik eden belgede belirtildiği üzere 37 °C'de inkübe edin. Ardından, besiyerini aspire edin ve 10 saniye boyunca durulayın.10 mililitre soğuk PBS ile beraber, 25 miligram/mililitre dekstran sülfat ve 50 mikromolar piridin DIO karbamat ile desteklenmiş 10 mililitre ED ekleyin ve ardından 35 °C'de beş saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, besiyerini aspire edin ve PBS ile 10 saniye boyunca bir kez durulayın.Ardından 10 milliliters ekleyin. Bir adet medium EED ekleyip erleni 35 degree Celsius inkübatöre geri yerleştirin. Çıkan parazitleri dağıtmak için günlük olarak çalkalayın.Parazitler monotabakayı yok edene kadar inkübasyona devam edin. Zenginleştirme taramasını takiben yaklaşık yedi gün sonra, popülasyon bir pasaj boyunca çoğaltılır. Ardından, fenotipler bir çıkış deneyi ile doğrulanır.Lamlar üzerinde büyütülmüş konfluen HFF hücreleri içeren 24 kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa 20.000 parazit inoküle edin; ortamdaki tüm parazitlerin uygun sıcaklıkta invazyon sağlaması için 35 °C'lik bir inkübatörde sekiz saat inkübe edin. Ardından, fenotipi indüklemek ve sekiz ila 24 parazit içeren olesleri büyütmek için, her kuyucuğu bir mililitre PBS ile 10 saniye boyunca yıkadıktan sonra plakayı 24 saat süreyle 40 °C'lik bir inkübatöre aktarın. Oda sıcaklığında, önceden ısıtılmış ve H-B-S-S-C içinde seyreltilmiş bir mililitre egress indükleyici ekleyin ve beraberindeki yazılı protokolde belirtilen süreler boyunca inkübe edin.Besiyerini aspire edin ve her kuyucuğa bir mililitre %100 metanol ekleyerek tespit işlemini gerçekleştirin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Ardından oda sıcaklığındaki bir mililitre PBS ile yıkayın. Yıkama ve lamların montajından sonra, hücre dışına çıkan S yüzdesini hücre içi vakuollere kıyasla saymak için 40 ila 60 x objektifli bir mikroskop kullanın. Zenginleştirilmiş egress mutant popülasyonunun fenotipi doğrulandıktan sonra, tek parazit klonları elde etmek için poliklonal popülasyon klonlanır.Parazit konsantrasyonu belirlendikten sonra, konfluent bir HFF hücresi tek tabakası içeren 3 84 kuyucuklu plakada, mililitrede 500 parazit olacak şekilde ED one ortamında seyreltilir. Ortam, çok kanallı bir pipet kullanılarak kuyucuk başına 40 µL ed, one ortamı ile değiştirilir. Kırmızı, mavi, sarı ve yeşil olarak temsil edilen dört poliklonal popülasyon.Bu gösterimde, bu pipeti kullanarak bir plakaya klonlama yapılabilir. Seyreltilmiş mutant bir'den her kuyucuğa 40 µL C3 ile C12 arasındaki kuyucuklara, mutant iki'den C13 ile C22 arasındaki kuyucuklara, mutant üç'ten H3 ile H12 arasındaki kuyucuklara ve mutant dört'ten H13 ile H22 arasındaki kuyucuklara ekleyin. Her kuyucuktaki toplam hacim şu anda 80 µL olmalıdır.Ardından çok kanallı bir pipet kullanarak solüsyonu beş kez yukarı ve aşağı pipetleyin, 40 µL'yi başlangıç satırının altındaki satıra aktarın. Bu iki katlı seri dilüsyonlara satır H mutant bir ve iki veya satır N mutant üç ve dörde kadar devam edin. Son satırdaki fazla 40 µL'yi atın.Plakayı sarsmadan 35 °C'lik bir inkübatörde yedi ila 10 gün boyunca inkübe edin. Bir sonraki hafta, kuyucukları ters mikroskop altında 10 ila 20 x objektif kullanarak, monokatman üzerinde delikler şeklinde görünen tekil plakların varlığı açısından kontrol edin. Her mutant için tek bir plağın bulunduğu dört kuyucuğu seçin ve parazitleri, HFF hücreleri ile konfluen hale getirilmiş ve beş mL ile doldurulmuş bir T 12.5 doku kültürü flaskına aktarın.Parazitleri 35 °C'lik bir inkübatörde ED one besiyerinde büyütün. Hücre dışı parazitleri dağıtmak için flaskları günlük olarak çalkalayın. Bu işlem tipik olarak yedi gün sürer.Plak deneyleri, çeşitli EMS mutajen konsantrasyonları ve kuyuk başına farklı sayıda parazit kullanılarak altı kuyucuklu bir plaka içerisinde gerçekleştirilmiştir. Bu videoda gösterildiği üzere, burada görülen kuyucuklardaki beyaz lekeler, EMS ile işlem görmüş plakalardaki HFF monolayer tabakasında oluşan parazit plaklarıdır. Bu plak deneylerinden elde edilen sonuçlar, artan dozlarda EMS ve ENU'ya maruz kalan parazitlerin sağkalım eğrilerini oluşturmak için kullanılmıştır.%70 öldürme sağlayan doz, ardından mutajenez deneyleri için seçilmiştir. Farklı bir deneyde, zenginleştirme sonrası popülasyondaki çıkış mutant fenotipine ait yüzde, burada gösterildiği gibi akış sitometrisi ile değerlendirilmiştir. Çıkış mutantının yabanıl tip parazitlere başlangıç oranı 10.000'de bir olduğunda, zenginleştirme yoluyla %80 saflık elde edilmiştir.Ancak, başlangıç oranı 100.000 parazitte bir olduğunda, izole edilen popülasyon yalnızca %1 ila 2'sini oluşturmuştur. Bu veriler, taramanın zenginleştirme gücünün 1000 kat olduğunu göstermektedir. Üçüncü bir deneyde, çıkış kalsiyum iyonu for A 2 3 1 8 7 ile indüklenmiştir. Bu görüntülerde oklar, kontrollerde YFP eksprese eden dört ila sekiz parazit içeren dört farklı VAE'yi işaret etmektedir.Ancak oklar, dört bağımsız çıkış VA'sını yansıtan dört grup dağılmış paraziti işaret etmektedir. Bu nedenle, mutant ile yabanıl tip fenotiplerin oranı, bu prosedür takip edilerek sayım yapılmasıyla kolayca belirlenebilir. Neden olan mutasyonu ve dolayısıyla ilgilenilen geni tanımlamak için kozmik komplementasyon veya tüm genom dizileme gibi ek yöntemler uygulanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, ilgilenilen bir mutajenin nasıl titre edileceğini, Toxoplasma parazit popülasyonunun nasıl mutajene edileceğini ve bu mutajen popülasyonundan tekil sıcaklığa duyarlı çıkış mutantlarının nasıl izole edileceğini iyi bir şekilde kavramış olmalısınız. Parametyum metiminle dirençli Toxoplasma parazitleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken emniyet gözlüğü gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

a-genetic-screen-to-isolate-toxoplasma-gondii-host-cell-egress-mutants

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Somatik Hücre Nükleer Transferi (SCNT) üzerinden epigenetik yeniden programlama önceden tanımlanmış T hücre reseptör (TCR) özgüllükleri fare modelleri oluşturmak için bir araç olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Bu transnuclear fareler, endojen endojen organizatörü kontrol altında lokus karşılık gelen TCR ifade eder.

Karşı Önceden tanımlanmış T Hücre Reseptör özgüllükleri Transnuclear Fare Toxoplasma gondii SCNT ile Elde Edilen

Burada, tip I ve tip II olarak kullanmak için bir yöntem...

Genetik Manipülasyon<em&gt; Δku80</emFonksiyonel Genomik Analiz&gt; Suşlarının<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Biz kimyasal mutagenez ve tüm genom dizileme dayalı Chlamydia genetik analiz gerçekleştirmek için bir metodoloji tarif. Buna ek olarak, enfekte olmuş hücrelerde DNA'nın değişimi için bir sistem genetik haritalama için kullanılabilir olduğu tarif edilmektedir. Bu yöntem dönüşüm sistemleri ve moleküler genetik araçları eksik mikrobiyal sistemlerine geniş uygulanabilir.

Ileri Genetik Yaklaşımlar<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

İleri genetik, hücre otonom bağışıklığına direnç için önemli olan hücre içi patojenlerdeki genleri tanımlamak için güçlü bir yaklaşımdır. Mevcut yaklaşım, bağışıklık kaçışı için önemli olan yeni Toxoplasma gondii genlerini tanımlamak için doğuştan gelen bağışıklık hücrelerini, özellikle makrofajları kullanır.

İleri Genetik tanımak makrofajlar kullanılarak Ekranlar<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Genler önemli direnç için IFN-γ-bağımlı hücre otonom bağışıklık

Coxiella burnetii zoonotik hastalık Q ateşi sorumlu zorunlu hücre içi Gram-negatif bir bakteridir. Burada Coxiella flüoresan transpozon mutantlarının üretimi yanı sıra otomatik tanımlama ve elde edilen içselleştirme, çoğaltma ve sitotoksik fenotipleri analizi için yöntemleri tarif eder.

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Detaylar, Toxoplasma gondii'de bir ilaca direnç genini tanımlamak için bütün genom dizisi tabanlı bir genetik harita ile QTL haritalamasının nasıl kullanılacağı ve bunun, bir genomik hedefi verimli bir şekilde düzenleyen CRISPR / Cas9 sistemi ile nasıl doğrulanabileceği üzerine sunulmaktadır; bu durumda Ilaç direnci geni.

QTL Haritalama ve CRISPR / Cas9 Düzenlemesi, bir İlaç Direnç Geninin Belirlenmesi için<emToksoplasma gondii</em

Burada sunulan bir luciferase tabanlı büyüme tsay kullanarak Toxoplasma gondii in vitro hücre içi büyümeye karşı kimyasal bileşiklerin inhibisyon etkinliğini değerlendirmek için bir protokoldür. Bu teknik, ilgili hedef genin genetik olarak silinmesi ile inhibisyon özgüllüğünü doğrulamak için kullanılır. LHVS'nin TgCPL proteaza karşı inhibisyonu örnek olarak değerlendirilmektedir.

Luciferase Tabanlı Büyüme Testini Kullanarak Hücre İçi Toksoplazma Gondii Büyümesine Karşı Kimyasal Inhibitör Verimliliğin Belirlenmesi

Bu protokol, Klamidya trachomatisgelişimsel mutantları tanımlamak ve izole etmek için yönlendirilmiş ileri genetik yaklaşımda floresan organizatör-muhabirler, canlı hücre mikroskobu ve bireysel dahil çıkarma kullanır.

Klamidya Trachomatis'te Gelişimsel Mutantları Tanımlamak ve Izole Etmek Için Canlı Hücre İleri Genetik Yaklaşım

Bu çalışma, Schizosaccharomyces pombe'de çok kopyalı baskılayıcı genetik ekran için bir protokolü açıklamaktadır. Bu ekran, bir sorgu mutant suşu ile ilişkili bir fonksiyon kaybı fenotipinin baskılayıcı klonlarını tanımlamak için genom çapında bir plazmid kütüphanesi kullanır. Bu ekran kullanılarak ell1 null mutantının yeni genetik baskılayıcıları tanımlandı.

Şizosakkaromices pombe'de Multicopy Suppressorların Tanımlanması için Genetik Ekran

Burada, seçilmiş genetik belirteçlerin taşınabilir nanopore dizileme kullanılarak Toxoplasma gondii suşlarını hızlı tanımlama ve genotipleme protokolü sunuyoruz; bu protokol, laboratuvarda bakımı yapılan izolasyonlarda ölçeklenebilir, hedeflenmiş suş tanımlamasını mümkün kılacak ve gelecekte gözetim ortamlarında uygulanabilecek bir yöntemdir.

Toxoplasma gondii için Sürün Tipi için Çok Lokus Dizileme

Öğrenin, Toxoplasma gondii'de ısıya duyarlı çıkış mutantlarını izole etmek için fenotipik tarama yöntemini. Kimyasal mutagenez ve hücre kültürü teknikleriyle parazit biyolojisini ve terapötik stratejileri keşfedin.

Isolate A Genetik Ekran Toxoplasma gondii Host-hücre çıkış Mutants

Daha fazla video keşfet