Name: Büyüme Mycobacterium tuberculosis Biyofilmler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Keşfedin, Mycobacterium tuberculosis biyofilmlerini hava-besin ortamı arayüzünde yetiştirme ve ilaç toleranslı kalıcı bakterilerin sıklığını belirleme yöntemini. Bu teknik, tüberküloz tedavi stratejilerini geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

İş Sağlığı ve Amerikan Akciğer Derneği Ulusal Enstitüsü&#39;nün mali desteği ile gerçekleştirilmiştir.

1. M. yetiştirilmesi biyofilm Bir 250ml vida kapaklı şişe içinde tüberküloz <ol><li> Ortam hazırlanması: su içinde 900 ml gliserol 60mL, ferrik amonyum sitrat ve 0.05g MgSO 4 KH 2 PO 4, 0.5g, L-asparagin 4g, sitrik asit 2g, 0.5g eritilir. NaOH ile pH 7.0 &#39;a ayarlanır. Otoklav, serin ve hemen önce deney başlamadan,% 0.1 w bir son konsantrasyon steril ZnSO 4 / ekleme v Mc 2 7000 pantothenat auxotroph olduğundan bu gerginlik de son konsantrasyon 10μg/mL az pantotenik asit gerektirir. </li></ol> Not: Bu M. tüberküloz için kullanılan Sauton medya standart bir bileşimidir. Gerekirse Bununla birlikte, diğer özel ortam, aynı zamanda, diğer mikobakteriyel türler için de kullanılabilir. <ol start="2"><li> Mikroorganizma hazırlık: M. Grow 0.05% 0.7 ila 1.0 arası bir hafta boyunca Tween-80, veya OD 600 ile 7H9OADC tüberküloz. Culture doğrudan bir 1:100 azından aşı malzemesi olarak kullanılabilir. </li><li> Bir 250ml vida kapaklı polistiren şişe (Corning) için Sauton medyasının 25mL dağıtın. Çok sıkı, orta kap şişe inokulum 250μl ekleyin ve 3 hafta boyunca nemli 37 ° C inkübatör içinde bozulmamış yerleştirin. Hiçbir kirlenme var olmasını sağlamak için her gün bir kez şişe gözlemleyin. </li><li> Üçüncü haftanın sonunda, M. ve daha da büyüme izin vermek için şişe kap gevşetmek arayüzü de tüberküloz. Kap bu aşamada gevşek değilse o kapta yetersiz oksijen konsantrasyonu bakteri daha fazla büyümesini frenleyeceğini. </li></ol> 2. M. Büyüme 12-iyi plakaları tüberküloz biyofilm <ol><li> Kesitler A1 ve A2 açıklandığı gibi mc 2 7000, medya ve inokulum hazırlayın. </li><li> Inokulum 600μl ile medya 60mL karıştırın. 4.5m DağıtmaPlakanın her oyuğuna karışımının L. Kapaklı Kapak plakası. Parafilm ile plakası birkaç kez kaydırmak. 5 hafta boyunca 37 ° C&#39;de nemli inkübatörde rahatsız plaka inkübe edin. </li></ol> 3. M. ilaç tolerans persisters sıklığını belirlenmesi tüberküloz biyofilmler <ol><li> M. Grow B. Bu bölümde tarif edildiği gibi, bir 12-gözlü formata tüberküloz biyofilmler yaklaşık 5-hafta toplam alacaktır. </li><li> Biyofilmler olgunlaştı edildikten sonra (kuluçka 5 hafta sonra), pipetle bir mikrotip kullanarak biyofilm altındaki medya içine istenen konsantrasyonda antibiyotik tercih enjekte. </li></ol> Not: pellicles altındaki medya hacmi yaklaşık 3.0mL azaltır. Bu yüzden araştırmacılar buna göre ilaç miktarı hesaplamak gerekir. <ol start="3"><li> Girdap antibiyotik iyice ortamda yayılır yavaşça böylece plaka. Istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar için, antibiyotik enjektedört kuyu otik. Buna paralel olarak, antibiyotik diğer dört kuyu içinde eritildi içinde çözücünün aynı hacimde enjekte ve dokunulmamış plakasının son dört kuyu bırakın. Kapaklı Kapak plakası ve plaka etrafında parafilm taze katmanları koymak. Istenilen süre inkübatöre geri yerleştirin. </li><li> İnkübasyon sonunda, plaka açmak ve kuyu her birinde% 0.1 nihai konsantrasyonu (hacim / hacim) ile Tween-80 ekleyebilir. Girdap deterjan üniform dağıtılması için hafifçe tüm plaka. 15 dakika oda sıcaklığında inkübe plakası. Ki tüm içerik üniform bir 15 mL konik tüpe aktarılır, böylece pipetle birkaç defa, her sıra içeriği karıştırılır. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4000rpm tüpün içeriği aşağı doğru dönmeye başlayacaktır. Taze yıkama tamponu (% 10 gliserol ve% 0.05 Tween-80 ile birlikte PBS) ile 5ml pelletini. Yıkama üç kez tekrarlayın. 5 ml&#39;lik yıkama tamponu içinde pelletini. O için rocker üzerinde tutun4 azından vernight ° C. </li></ol> Not: düşük sıcaklıkta başlangıçta M. smegmatis (dispersiyon sırasında büyümesini en aza indirmek üzere) için geliştirilen ve aynı zamanda M. Tuberculosis için kullanılabilir olmasına rağmen, yavaş büyüyen türler, büyük olasılıkla sonucu üzerinde bir etkisi olmaksızın, oda sıcaklığında sallandı edilebilir. BSL-3 tesisi çalışma durumunda, oda sıcaklığında sallanan gerekli olabilir. <ol start="6"><li> , Uygun boyuta geniş sonunda kesme şırıngaya oturtmadan ve parafilm ile sararak mikrotip (2-200μl) ile donatılmış steril bir şırınga hazırlayın. Ucuna takılmış şırınga yoluyla tüpün tüm içerik geçmesi ve yeni bir 15 mL tüpler birikir. Eğer oldukça homojen bir süspansiyon gözlemlemek kadar bu adımı 5 ila 6 kez tekrarlayın. </li><li> Her iyi canlı koloni sayısını belirlemek için 7H11OADC plaka üzerine süspansiyon ve plaka dilüsyonları seri dilüe. 37 ° C inkübatör üç hafta süreyle inkübe edin. Frekanslar belirleyinÇözücü muamele plakalar üzerinde elde edilenler ile muamele antibiyotik olarak elde koloni sayısı oranı hesaplayarak biyofilm popülasyonda persisters arasında cy. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar M. bir şişe kültüre, büyüme tüberküloz ilk hafta sonuna Şişenin taban görülebilir. Hava-medya arayüzü de büyüme üçüncü haftasında (Şekil 1A) sonunda sürekli görünür olmasına rağmen ikinci haftanın sonunda, hava-medya arayüzü üzerinde bakteri yamalı büyüme görülebilir. Bu zamanda, kabın duvarına bakteri eki de gözlemlenmiştir. Bu noktadan itibaren kültür büyüme esas olarak hava arayüzü ortam üzerinde oluşur. Yüzey büyüme altında sıvı açıktır. Tipik olarak, yapının beşinci hafta (Şekil 1B) sonuna kadar olgunlaşır. İnkübasyon uzamış ise, yapılar kabın dibine çöker başlayacaktır. Şaşırtıcı,Üçüncü haftanın sonuna kadar kapak sıkma sürecinde önemli bir adım olduğunu ve bilinmeyen nedenlerle gevşek kapaklı şişe önemli arayüz 9 büyüme başlatılması geciktirir. 12-gözlü formata olarak, hava-ortam ara yüzeyde sağlam bir biyofilm beş haftalık (Şekil 2A) sonunda her bir kuyu görülür. Plakalar tamamen sarılmış değilse o diferansiyel biyofilm büyüme gözlenmektedir. En kötü durumda, önemli medya buharlaşma bakterilerin büyümesini (Şekil 2B) aksaklık olabilir. Böylece, her iki plakanın sarma buharlaşmasını önlemek için de biyofilm (önceki paragrafta bakınız) için bir ortam sağlamak için gereklidir. Bu teknik ile belirlenen Biyofilmlererde canlı basil sayısı oldukça tekrarlanabilir olması. M. Tepki tüberküloz biyofilmlerin antibiyotiklerin doğa ile değişir. Örneğin, rifampisin gibi bakterisidal antibiyotik için, canlılık kaybı bipha takip<html> sic eğilim 9. Nüfusun küçük bir yüzdesi ne olursa olsun antibiyotik veya maruz kalma süresi konsantrasyon antibiyotiklere tamamen inatçı kalan hangi kalıcı bir fazı izler ilk üç ile dört gün boyunca canlılık içinde hızlı bir düşüş. Şekil 3 rifampisin 50μg/mL için 7 günlük maruziyet (MIC göre 50 kat daha yüksek) sonra olgun Biyofilmlererde canlı basil sayısını gösterir. <img alt="Şekil 1A." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig1A.jpg" /> M. Şekil 1A. Erken görünüm inkübasyon 3 hafta sonra bakterilerin hava-medya arayüzü tüberküloz basili. <img alt="Şekil 1B." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig1B.jpg" /> Şekil 1B. M. biyofilm Vadesi inkübasyon beş hafta sonra hava-medya arayüzü tüberküloz. 820/3820fig2A.jpg &quot;/&gt; M. Şekil 2A. 5 haftalık biyofilmler Tüberküloz 12-iyi biçimde büyüdü. <img alt="Şekil 2B." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig2B.jpg" /> Şekil 2B. Parafilm olmadan 12-iyi plaka M. tuberculosis biyofilm büyümeye bir başarısız girişimi. <img alt="Şekil 3." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig3.jpg" /> M. ilaç hoşgörülü persisters sıklığını gösteren 3. Bir temsilci arsa Şekil Tüberküloz 12-iyi biçimde büyüdü ve yedi gün boyunca Rifampisin ile 50μg/mL maruz Biyofilmler.

<ol><li>Saltini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+and+diagnosis+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Med%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy and diagnosis of tuberculosis.</a> Respir. Med. 100, 2085-2097 (2006).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+and+dispersal+and+the+transmission+of+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens.</a> Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).</li>
<li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+a+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+build+a+biofilm%3A+a+fungal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">How to build a biofilm: a fungal perspective.</a> Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).</li>
<li>Henke, J. M., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+social+engagements%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial social engagements.</a> Trends Cell Biol. 14, 648-656 (2004).</li>
<li>Kolter, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+for+all+and+all+for+one%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">One for all and all for one.</a> Science. 280, 226-227 (1998).</li>
<li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+the+matrix+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).</li>
<li>Ojha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GroEL1%3A+a+dedicated+chaperone+involved+in+mycolic+acid+biosynthesis+during+biofilm+formation+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria.</a> Cell. 123, 861-873 (2005).</li>
<li>Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Mycobacterium+tuberculosis+biofilms+containing+free+mycolic+acids+and+harbouring+drug-tolerant+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria.</a> Mol. Microbiol. 69, 164-174 (2008).</li>
<li>Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+hydrolysis+of+trehalose+dimycolate+releases+free+mycolic+acids+during+mycobacterial+growth+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms.</a> J. Biol. Chem. 285, 17380-17389 (2010).</li>
<li>Dye, C., Lonnroth, K., Jaramillo, E., Williams, B. G., Raviglione, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+tuberculosis+incidence+and+their+determinants+in+134+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Trends in tuberculosis incidence and their determinants in 134 countries.</a> Bull World Health Organ. 87, 683-691 (2009).</li>
<li>Jindani, A., Dore, C. J., Mitchison, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactericidal+and+sterilizing+activities+of+antituberculosis+drugs+during+the+first+14+days%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Bactericidal and sterilizing activities of antituberculosis drugs during the first 14 days.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 1348-1354 (2003).</li>
<li>Carter, G., Wu, M., Drummond, D. C., Bermudez, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+biofilm+formation+by+clinical+isolates+of+Mycobacterium+avium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium.</a> J. Med. Microbiol. 52, 747-752 (2003).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+the+rapidly+growing+mycobacterial+species+Mycobacterium+fortuitum%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by the rapidly growing mycobacterial species Mycobacterium fortuitum.</a> FEMS Microbiol. Lett. 168, 77-84 (1998).</li>
<li>Alibaud, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-dependent+regulation+of+mycolic+acid+cyclopropanation+in+saprophytic+mycobacteria%3A+role+of+the+Mycobacterium+smegmatis+1351+gene+%28MSMEG_1351%29+in+CIS-cyclopropanation+of+alpha-mycolates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Temperature-dependent regulation of mycolic acid cyclopropanation in saprophytic mycobacteria: role of the Mycobacterium smegmatis 1351 gene (MSMEG_1351) in CIS-cyclopropanation of alpha-mycolates.</a> J. Biol. Chem. 285, 21698-21707 (2010).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Mycobacterium tuberculosis enfeksiyonu nedeniyle tüberküloz (TB), küresel halk sağlığı için büyük bir tehdit olmaya devam etmektedir. Dünya nüfusunun yaklaşık üçte biri asemptomatik patojen ile enfekte olduğu tahmin edilmektedir, 9 milyon yeni vaka aktif verem ve enfeksiyonun yaklaşık 1,7 milyon kalıp her yıl 11 belirtileri ile her yıl klinikte göstermek. Hastalık büyük bir yük öncelikle bir aşı ve altı ile dokuz ay boyunca uygulanan bir ilaca rejimi içeren bir derece karmaşık kemoterapi eksikliği ta...

<table><tbody><tr><td>İnkübatör</td><td>VWR international</td><td>Model # 1923/25</td><td></td></tr><tr><td>Polistiren kültür şişeleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-374-300</td><td></td></tr><tr><td>12 kuyucuklu doku kültürü plakası</td><td>VWR international</td><td>62406-165</td><td></td></tr><tr><td>50-mL konik tüpler</td><td>VWR international</td><td>89039-660</td><td></td></tr><tr><td>Sallayıcı (Rocker)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>57019-662</td><td></td></tr><tr><td>Kromatografik buzdolabı</td><td>VWR international</td><td>55702-520</td><td></td></tr><tr><td>petri kabı</td><td>VWR international</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (monobazik)</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1565-1</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>L-asparajin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4284-100G</td><td></td></tr><tr><td>sitrik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1857-100G</td><td></td></tr><tr><td>ferrik amonyum sitrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5879-100G</td><td></td></tr><tr><td>gliserol</td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4750-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-pantotenik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2250-25G</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H9 Besiyeri</td><td>BD Biosciences</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook OADC Zenginleştirici</td><td>BBL</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164-500</td><td></td></tr><tr><td>250mL saklama şişesi</td><td>Corning</td><td>430281</td><td></td></tr><tr><td>12 kuyucuklu plakalar</td><td>Falcon BD</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>rifampisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501-1G</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>JT Baker</td><td>9070-05</td><td></td></tr><tr><td>10mL şırınga</td><td>BD Biosciences</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>1-200&amp;mu;L pipet uçları</td><td>VWR international</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>parafilm M</td><td>VWR international</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>15mL santrifüj tüpü</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-285</td><td></td></tr><tr><td>Difco Mycobacteria 7H11 Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>283810</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (dibazik)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

büyüme mycobacterium tuberculosis biyofilmler

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, insan tüberküloz etyolojik ajan, antibiyotikler de dahil olmak üzere çevresel streslere karşı hayatta kalabilmek için olağanüstü bir yeteneği vardır. Rağmen M. stres toleransı tüberkülozu, tüm tüberküloz 1 6 aylık uzun kemoterapi olasılıkla katkıda biridir, patojen bu özelliği fenotip altında yatan moleküler mekanizmaları tam olarak bilinmemektedir. Birçok mikrobiyal türlerin biyofilm 2-4 olarak adlandırılan son derece organize, bağlı yüzey ve matris kapsüllü yapılarda kendine montaj tarafından stresli ortamlarda hayatta kalmak için evrildi. Topluluklarda Büyüme mikropların tercih edilen bir hayatta kalma stratejisi gibi görünüyor, ve yüzey eki, hücrelerarası iletişimi ve hücre dışı polimerik maddelerin sentezi (EPS) 5,6 düzenleyen genetik bileşenleri yoluyla elde edilir. Çevresel strese toleransı olasılıkla physiolo belki de EPS kolaylaştırdı ve birbiyofilmlerin 7 karmaşık mimarisi içindeki heterojen mikroçevrelerde bireysel basilinin cerrahi adaptasyonu. Son kağıtları bir dizi biz kurduğu M. tüberküloz ve Mycobacterium smegmatis&#39;in fazla 50 kez anti-tüberküloz ilaçlar izoniazid ve rifampisin 8-10 minimal inhibitör konsantrasyonları tolere edebilir biyofilm olarak adlandırılan organize çok hücreli yapılar büyümeye güçlü bir eğilimi, var. M. ortamı gibi bir atmosfer havası ile 9 arasında, sınırlı değişimi: tüberküloz, bununla birlikte, ilgi çekici tepe boşluğu özellikle 9:01 oranında olgun biyofilmlerde, oluşturmak için spesifik koşulları gerektirmektedir. Özel çevre koşullarının Gereksinimleri muhtemelen o M. gerçeği ile bağlantılı olabilir tüberküloz, zorunlu insan patojeni ve böylece doku ortamlara adapte olmuştur. Bu yayının biz kültür M. yöntemleri göstermek tüberkülozbir şişe ve bakteriyolojik yanı sıra genetik çalışmalar için uygun bir 12 de plaka biçiminde biyofilmler. Biz, M. olarak zayıflatılmış bir suş için protokol tanımlamışlardır patojen 9 in vivo büyüme için kritik olan iki lokus, panCD ve RD1, silinmek ile tüberküloz, mc 2 7000,. Bu şekil değiştirme güvenle ve böylece pahalı bir BSL-3 tesisinin ihtiyacı kaçınarak tuberculosis patojenin temel biyolojisi anlamak için bir BSL-2 çevreleme kullanılabilir. Yöntem diğer kültürleştirilebilir mikobakteriyel türlerin biyofilm büyümeye, medya uygun modifikasyon ile uzatılabilir. Genel olarak, kültür mikobakteriyel biyofilm yeknesak bir protokol mikobakteri temel esnek özellikleri eğitim ile ilgilenen araştırmacılara yardımcı olacaktır. Ayrıca, büyüyen mikobakteriyel biyofilmlerin açık ve özlü bir yöntem de, klinik ve ilaç inv yardımcı olacaktırestigators potansiyel bir ilacın etkinliğinin test etmek için.

Belli koşullarda kültüre zaman Mycobacterium tuberculosis ilaç hoşgörülü biyofilm oluşturmaktadır. Burada kültür M. yöntemleri tarif tuberculosis biyofilmler ve ilaç tolerans persisters sıklığını belirlenmesi. Bu protokoller M. ilaç hoşgörü mekanizmalarına daha sonraki çalışmalar için faydalı olacaktır tüberküloz.

Büyüme Mycobacterium tuberculosis Biyofilmler

İnsan tüberkülozunun etiyolojik ajanı olan Mycobacterium tuberculosis, ... dahil olmak üzere çevresel streslere karşı hayatta kalma konusunda olağanüstü bir yeteneğe sahiptir.

Bu prosedürün genel amacı, hava-besiyeri arayüzünde m tuberculosis biyofilmlerini büyütme yöntemini göstermek ve biyofilmlerdeki ilaç toleranslı hücrelerin frekansını belirlemektir. Bu işlem, öncelikle uygun besiyerlerinin ve inokulumların hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise 12 kuyucuklu plakalarda m tuberculosis biyofilmlerini büyütmektir.Ardından, istenen konsantrasyonda bir test antibiyotiği eklenir ve ilaca toleranslı persisterlerin frekansı belirlenir. M tuberculosis'te biyofilmler tespit edilebilir. Nihayetinde bu teknik, biyofilm gelişiminin temelini anlamaya yardımcı olmak ve M tuberculosis'teki ilaç toleransı mekanizmalarını çözmek için kullanılabilir. Deterjan içermeyen besiyerlerinde in vitro M tuberculosis biyofilm kültürü yetiştirmenin temel avantajı, bazal kompleks çok hücreli mimarinin spontan büyümesinin, planktonik kültürlerde görülmeyen organizmaya özgü benzersiz özellikleri ortaya çıkarmasıdır.Bunlar arasında yüzeye tutunma, hücreler arası etkileşimler, yardımcı matris sentezi ve bu yapının heterojen mikroçevresi içindeki fizyolojik adaptasyon yer almaktadır. Önemli bir nokta olarak, bu bilgiler M tuberculosis'in, çok hücreli yapılardaki yardımcı ortamlarda basillerin aşırı büyümesinin meydana gelme olasılığının yüksek olduğu kaviteler gibi belirli özelleşmiş nişlerdeki kalıcılığının temelini anlamak açısından oldukça ilgili olacaktır. Bu tekniğin doğurduğu sonuçlar, biyofilmlerle ilişkili faktörlerin belirlenmesi ve hedeflenmesinin biyofilmlerdeki ilaç toleranslı alt popülasyonların sıklığını azaltabilmesi nedeniyle, tüberkülozun daha kısa süreli tedavisine kadar uzanmaktadır.Bu protokolde, M tuberculosis kültürü için standart bir soans besiyeri bileşimi kullanılmıştır. Bununla birlikte, diğer mikobakteri türlerinin biyofilmlerini yetiştirirken uygun özel besiyerlerini kullanın ve M tuberculosis primer inokulumlarını 15 mililitre sıvı besiyeri içeren 125 mililitrelik plastik şişelerde hazırlayın.Kültürleri, OD 600 değerleri 0,7 ile 1,0 arasına gelene kadar standart koşullarda büyütün; bu işlem yaklaşık bir hafta sürer. Bu yoğunluktaki kültür, 1/100 seyreltme ile doğrudan inokulum olarak kullanılabilir. İnokulum hazırlandıktan sonra, 60 mL Sawtons besiyerine 600 µL ekleyin.İnokülum besiyeri ile nazikçe karıştırıldıktan sonra, karışımın 4,5 mililitresi 12 kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa dağıtılır, plaka kapatılır ve parafilm ile birkaç kez sarılır. Ardından plaka, 37 °C sıcaklıktaki nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edilir.Beş haftalık kesintisiz büyümenin ardından, ilaca toleranslı persister hücrelerin testi ile devam edin. Beş haftalık olgunlaşma süresi sonunda, medya hacmi dört kuyucukta kuyucuk başına yaklaşık üç mililitreye düşmüş olacaktır. İlgili antibiyotiği, medyanın üzerindeki biyofilmin hemen altına enjekte edin.Diğer dört kuyucuğa sadece çözücü enjekte edilmeli ve son dört kuyucuk ise olduğu gibi bırakılmalıdır. Bu işlem istatistiksel güç ve uygun kontroller sağlar; antibiyotiğin besiyerine tamamen yayılması için plak nazikçe sallanmalıdır. Şimdi plağın üzerini kapatın.Plakanın etrafına taze paraform katmanları yerleştirin ve deneyin gereksinimlerine göre plakayı bir ila yedi gün arasında inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, her bir kuyucuğa tween 80 ekleyin. Deterjanın homojen bir şekilde yayılması için tüm plakayı nazikçe sallayın.Ardından plakayı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. 15 dakika sonra, her bir kuyucuğun içeriğini homojen hale gelene kadar bir pipet yardımıyla karıştırın. Daha sonra kültürü 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.Konik tüpü santrifüjleyin ve resüspande edin. Peleti beş mililitre taze yıkama tamponunda süspande edin, çöktürün ve resüspande edin. Hücreleri yıkama tamponunda üç kez daha süspande edin.Ardından hücreleri, soğuk odada bir sarsıntılı platform üzerinde gece boyunca yıkama tamponunda bekletin. Düşük sıcaklık başlangıçta, dağılım sırasındaki büyümeyi en aza indirmek amacıyla EMS magmatik için geliştirilmiş olsa da M tuberculosis için de kullanılmıştır. Yavaş büyüyen türler, büyük olasılıkla sonuçlar üzerinde herhangi bir etki yaratmadan oda sıcaklığında sarsılabilir.BSL 3 düzeyindeki bir tesiste çalışılıyorsa, oda sıcaklığında sallama işlemi gerekli olabilir. Ertesi gün, homojenize etmek ve transfer etmek için bir şırınga hazırlayın. Her süspansiyon için steril bir şırıngaya mikro pipet ucu takın. Ucun geniş kısmını uygun boyutta kesin, şırıngaya bağlayın ve bağlantı noktasını parafilm ile sarın.Soğutulmuş hücre süspansiyonunu uç takılmış şırıngadan geçirin ve içeriği temiz bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Süspansiyon oldukça homojen görünene kadar, tüpü sürekli değiştirerek bu adımı beş ila altı kez tekrarlayın. Şimdi, her süspansiyonun seri dilüsyonlarını hazırlayın ve her bir dilüsyonu bir agar plağına ekim yapın.Plakaları üç hafta boyunca inkübe ettikten sonra, antibiyotikli plaklar ile kontrol plaklarındaki koloni sayılarını karşılaştırarak biyofilm popülasyonundaki persisterlerin frekansını belirleyin. Bir şişede kültüre edildiğinde, ilk hafta boyunca M tuberculosis şişenin tabanında büyümüştür.İkinci haftanın sonunda, hava-besiyeri arayüzünde bakterilerin yamalı büyümesi görülmüş ve bu durum üçüncü haftanın sonunda daha belirgin hale gelmiştir. Bakterilerin kap duvarına tutunduğu da gözlemlenmiş ve kültür büyümesi öncelikle hava-besiyeri arayüzünde gerçekleşmiştir. Yüzey büyümesinin altındaki sıvı berrak görünümdeydi.Beşinci haftanın sonunda yapı tamamen olgunlaşmıştı. Tamamen sarılmamış plaklarda, beş haftalık inkübasyonun ardından 12 kuyucuklu formatta, her bir kuyucuğun hava-besiyeri ara yüzeyinde güçlü bir biyofilm görüldü. Besiyerinde önemli miktarda buharlaşmanın yanı sıra farklılaşmış biyofilm büyümesi de gözlemlendi.Bu plaklardaki bakteriyel büyüme durduruldu. Biyofilmlerdeki canlı basil sayısı oldukça tekrarlanabilirdi ve farklı antibiyotiklere göre değişkenlik gösteriyordu. Örneğin, bakterisidal bir antibiyotik olan rifampisinle yapılan çalışmada, ilk üç ila dört gün boyunca canlılıkta hızlı bir düşüş gözlemlenmiş; bunu, antibiyotik konsantrasyonundan veya maruziyet süresinden bağımsız olarak, popülasyonun küçük bir yüzdesinin antibiyotiklere karşı tamamen dirençli kaldığı kalıcı bir faz takip etmiştir.Aynı prosedür, mycobacterium tuberculosis'ün biyofilm yüzeyine tutunmasında, bakterilerin arayüzeydeki büyümesinde ve biyofilmin olgunlaşmasında rol oynayan genleri belirlemek amacıyla mutantların taranmasında kullanılabilir. M tuberculosis ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür uygulanırken biyogüvenlik düzey üç koruma kullanımı gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

growth-of-mycobacterium-tuberculosis-biofilms

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu kağıt büyüyen farklı yöntemleri açıklar.

Co-kültür Modelleri Pseudomonas aeruginosa</emCanlı İnsan Havayolu Hücreler Yetiştirilen> Biyofilmler

Tahlil, bakteri ve mantar erken biyofilm oluşumunu ölçmek için hızlı bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem mikrotiter plate mikrobiyal biyofilm oluşumu için alt tabaka olarak kullanır ve biyofilm kristal viyole suşu kullanılarak görüntülenmiştir. Tahlil ya erken biyofilm oluşumu için bir kalitatif veya kantitatif sağlar.

Microtiter Bulaşık Biyofilm Oluşumu Testi

Bu makalede, 8 kuyu odasına slayt içinde yetişen bir bakteriyel biyofilm oluşumu ve görselleştirme için prosedürü anlatılmaktadır.

8-iyi Odası Slayt in vitro Biyofilm Oluşumu

Mikrobiyal biyofilmler genellikle özel hücreler farklı subpopülasyonunun oluşturduğu edilir. Bu alt popülasyonlarının Tek hücreli analizi floresan gazetecilere kullanımını gerektirir. Burada birkaç subpopulationswithin görselleştirmek ve izlemek için bir protokol...

Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis</emFloresan Mikroskobu ve Akım Sitometri Kullanma> Biyofilmler

Bu video makalede, başarılı bir bütün omurgalı hayvan organizmayı kullanarak bileşik test ve ilaç keşfi için yeni bir güçlü bir araç sağlayan Zebra balığı embriyolarının büyük sayıda bulaştırmak ve analiz etmek için kurulmuştur yüksek kapasiteli boru hattı açıklanır.

Kuruluş ve Eğitim için bir Yüksek Verimli Kur Optimizasyonu<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Ve<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Enfeksiyon İlaç Keşif için bir model olarak

Bu protokol, bir slayt odası modeli kullanılarak konak faktörlerine maruz kaldıktan sonra biyofilm gelişiminin görselleştirilmesini açıklar. Bu model, biyofilm gelişiminin doğrudan görselleştirilmesinin yanı sıra bilgisayar yazılım programları kullanılarak biyofilm parametrelerinin analizine olanak tanır.

Bir odacıklı coverglass Modeli Kullanılarak Biyofilm Kalkınma Sputum Etkilerinin görselleştirme

Bu protokol, yüksek verimli 96 kuyulu sabitlenmiş kapak statik biyofilm taraması için kendinden montajlı derin kuyu PCR plakalı cihazları kullanarak biyofilm büyümesi ve biyokütle ölçümleri yapmak için metodoloji sunar.

PCR-Plate Deep Well Microplate Cihazları Kullanılarak Daha Büyük Bakteriyel Biyofilm Biyokütlesinin Oluşturulması

Bu protokol, pelikül biyofilmi geliştirmek için sağlam bir yöntemi tanımlar. Yöntem, farklı kültür hacimlerine ölçeklenebilir ve çeşitli deneysel hedefler için kolay benimseme sağlar. Yöntemin tasarımı, çeşitli mikobakteri türlerinin biyofilm oluşturma potansiyelinin kalitatif veya kantitatif olarak değerlendirilmesini sağlar.

Antimikrobiyal Direnci İncelemek İçin Bir Model Olarak Mikobakteriyel Biyofilm Yetiştirme

Bu metodoloji, araştırma ve klinik laboratuvarlarda antimikrobiyal duyarlılık testi için kistik fibrozda bir polimikrobiyal biyofilm modelinin oluşturulmasına izin verir. Bu model, bir dizi çıktıda doğru ve güvenilir sonuçlar sağlar.

Kistik Fibrozisde Antimikrobiyalleri Test Etmek İçin Polimikrobiyal Koloni Biyofilm Modelinin Geliştirilmesi

Bu makale, Proteus mirabilis biyofilmleri için özel olarak tasarlanmış bir Genleşme Mikroskobu tekniği olan PmbExM için kapsamlı bir protokol sunmaktadır. PmbExM, izotropik, 4,3 kat genişleme elde etmek için biyofilm numunelerinin aşamalı olarak enzimatik bir şekilde işlenmesini kullanır ve bu sapsız mikrobiyal topluluklar içindeki hücresel ve hücre altı yapıların uzamsal organizasyonunun süper çözünürlüklü analizini sağlar.

Proteus mirabilis Biyofilminin Genleşme Mikroskobu ile Süper Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Keşfedin, Mycobacterium tuberculosis biyofilmlerini hava-besin ortamı arayüzünde yetiştirme ve ilaç toleranslı kalıcı bakterilerin sıklığını belirleme yöntemini. Bu teknik, tüberküloz tedavi stratejilerini geliştirmeye yardımcı olur.

Büyüme Mycobacterium tuberculosis Biyofilmler

Daha fazla video keşfet