Bir Mikroplaka Pıhtılaşma Analiz Kullanarak İnsan Plazma Faktör V Aktivitenin Ölçümü

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, insan plazmasında bir fibrin pıhtısı oluşumu sırasında bir pıhtılaşma protein faktörü V'nin aktivitesini ölçen bir mikroplaka testi geliştirmekti. Yaralanmaya yanıt olarak, kan pıhtılaşma süreci aktive edilir ve sonuçta pıhtılaşma enzimi trombinin, trombin cleves'in fibrin monomerlerine çözünür fibrinojenin üretilmesine yol açan bir dizi Ksimojen'den proteaza dönüşüm reaksiyonu ile sonuçlanır ve bunlar daha sonra çözünmez bir fibrin pıhtısı oluşturmak üzere birleşir. Normalde, kan, sağlıklı veya yaralanmamış durumda serbestçe akan bir sıvı olarak kalır ve oluşan fibrin miktarı, bozulan veya parçalanan fibrin miktarına eşittir.

Bununla birlikte, bazı hastalık durumlarında, çok fazla pıhtılaşma kalp hastalığına ve felce yol açarken, çok az pıhtılaşma hemofililerde sıklıkla görülen kanama eğilimlerine yol açar. Faktör V, aktive edilmiş form faktörü beş A'da bulunan plazmadaki bir proteindir, protrombin enzim kompleksinin bir parçası olarak fibrin pıhtısı oluşumu sırasında trombin oluşumunun kritik bir hızlandırıcısıdır, protrombin dört bileşenden oluşur: faktör 10 A, proteaz faktörü beş A, kofaktör lipid, yüzey ve kalsiyum. Melin faktörü beş A, faktör 10 A'nın substrat protrombinine doğru katalitik etkinliğini veya kcat'ini yaklaşık 3000 kat arttırır, böylece trombin oluşumunu ve fibrin pıhtı oluşumunu derinden arttırır.

Mikroplaka platformu, kolaylık, zaman maliyeti, küçük numune hacimleri, sürekli izleme ve yüksek verim nedeniyle enzim katalizli olayları ölçmek için tercih edilir. Fibrin pıhtısı oluşumu olayı, fibrin pıhtısı bulunmayan ve minimum ışık absorbansı olan berrak sarı bir görünümden, fibrin pıhtısı ve maksimum ışık absorbansı olan opak bulutlu bir görünüme geçerken plazmanın ışık absorbansındaki artışı ölçerek bir mikroplaka okuyucu ile izlenebilir. Bu tekniğin, manuel eğimli tüp tahlilleri veya otomatik analizörlü tahliller gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajları, yöntemin hızlı, ucuz olması ve küçük numune hacmi gereksinimlerine sahip olması ve yüksek verime sahip olmasıdır.

Test, toplam fonksiyonel aktivitesinin tam bir kantitatif değerlendirmesini elde etmek için kasıtsız olarak aktive edilen ve trombin aktive edilen faktör beşin aktivitesini ölçer. Bu tekniği gösteren, laboratuvarda yüksek lisans öğrencisi olan Derek Tilley olacak. Bir plazma örneğindeki faktör beş aktivitesini ölçmek için, faktör beş tek aşamalı aktiviteyi, panel A'da fibrin pıhtı oluşum zamanının standart eğrilerini ve panel B'de fibrin pıhtı oluşumunun başlangıç oranını, tanım gereği ML başına bir birim faktör beş Aktivite içeren bir standart olarak oluşturmak gerekir. normal insan plazması ve örnek plazma bilinmeyenleri ve tromboplastin 37 derecede 10 dakika.

Faktör beş eksik plazma ve tromboplasti transferini ayrı plastik yıkama tepsilerine nazikçe karıştırın ve buz üzerinde inkübe edin. Normal insan plazmasını ve numune plazma bilinmeyenlerini nazikçe karıştırdıktan sonra buz üzerinde saklayın. Kalsiyum klorür 25 milimolar'ı damıtılmış Suda, oda sıcaklığında ayrı bir yıkama tepsisinde, faktör beş bir Aşama aktivite standart eğrileri için saklayın.

1.5 ml mikro santrifüj tüpleri kullanarak HBS pH 7.4'te 0 2 4 8 16 32 64, 1 28, 2 56 ve 512 kattan normal insan plazmasının iki kat seri seyreltilmesinin her biri için 200 mikrolitre hazırlayın, iyice vorteksleyin ve buz üzerinde inkübe edin. Plazma örneği bilinmeyenleri için, 1.5 ML mikro santrifüj tüpleri kullanarak HBS pH 7.4'te normal insan plazmasının ve bilinmeyen örnek plazmalarının 40 kat dilüsyonunun her biri için 200 mikrolitre hazırlayın. Mikroplaka okuyucunun şablon tutucusuna beş mikro kuyu şeridi yerleştirin.

Mikroplaka okuyucuyu açın ve çok kanallı bir pipet kullanarak Softmax Pro mikroplaka uygulama yazılımına erişin. Tek bir pipet kullanarak tüm numune mikroplaka kuyucuklarına 50 mikrolitre faktör beş eksik plazmanın aynı anda eklenmesini sağlayın, hazırlanan 10 seri normal insan plazmasının 50 mikrolitresini ve normal insan plazmasının 40 kat dilüsyonunu ve numune plazması bilinmeyenlerini çok kanallı bir pipet kullanarak MICROPLATE kuyucuklarına ekleyin, tüm numune kuyucuklarına 50 mikrolitre tromboplasti ekleyin. Bir dakikalık inkübasyonun 15 ila 25 saniyesi boyunca çalkalayarak bir dakika boyunca 25 santigrat derecede Mikroplaka okuyucuda inkübe edin.

MİKROPLAKA okuyucu arayüzlü bilgisayarı kullanarak Softmax Pro Microplate uygulama yazılımına erişin. Mikroplaka okuyucuyu absorbans dalga boyunu 405 nanometre moduna, kinetik sıcaklığa 25 santigrat dereceye ayarlayın ve Mikroplaka okuyucuyu kalsiyum klorür ilavesinden sonraki ilk beş saniye sallanacak ve altı dakika boyunca her beş saniyede bir 405 nanometrede absorbasyonu ölçecek şekilde programlayın. Daha sonra, beş saniyelik çalkalama aralığı, iki çok kanallı pipet kullanılarak hesaplanan pıhtı sürelerine dahil edilmez, aynı anda numunelerle birlikte iki mikroplaka şeridine 50 mikrolitre kalsiyum klorür eklenir.

15 saniye bekleyin ve testi başlatmak için bilgisayardan Softmax Pro'daki başlat simgesine hemen basın. Analiz edilen her plazma örneği için pıhtı oluşum zamanı belirlenir ve absorbansta yarı maksimum artışa ulaşmak için saniye cinsinden süre olarak tanımlanır. İlk pıhtı oluşum hızı, zamana karşı absorbanstaki artışın doğrusal kısmının ilk beş zaman noktası boyunca absorbanstaki artış oranı olarak tanımlanır.

Pıhtı oluşumunun derecesi, koşu sonunda pıhtı oluşumu olayı sırasında elde edilen maksimum ve minimum emilim arasındaki fark olarak tanımlanır. Normal insan plazmasının seri seyreltilmesi için pıhtı oluşumunun zamanını, başlangıç hızını ve derecesini belirlemek için Softmax Pro'daki EMİRASYONA karşı zaman profillerini kullanın. Faktör V tek aşamalı aktivite standart eğrilerini oluşturmak için, 40 kat seyreltilmiş normal insan plazması ve numune plazması bilinmeyenleri için pıhtı sürelerini kullanın, I, faktör beş tek aşamalı aktivite standart eğrisinden değirmen başına birim cinsinden faktör beş aktivitesini enterpolasyon yapın.

Bu, faktör beşi temsil eder, bir aşamalı aktiviteyi veya trombin tarafından kasıtlı aktivasyon olmadan gerçekleşir. Bu, mikroplaka okuyucu tarafından oluşturulan zaman içinde faktör beş tahlilinde fibrin pıhtı oluşumunun temsili bir örneğidir. Profil, tek bir mikroplakada 32 kat seyreltilmiş normal insan plazması kullanılarak fibrin pıhtısı oluşumunu temsil eder.

Dikey eksen, fibrin pıhtısı oluşumunun bir sonucu olarak meydana gelen 405 nanometredeki emici değişikliği ifade eder. Pıhtı oluşumu süresi, absorbansa karşı zaman eğrisinin orta noktası olan 36.4 saniye olarak hesaplandı. İlk pıhtı oluşum hızı dakikada 611.88 mili birim olarak hesaplandı.

Bulut oluşum derecesi 0.35 birim olarak hesaplanmıştır. Faktör beş tahlili, bulut oluşumunun zamanını, başlangıç hızını ve kapsamını doğru bir şekilde ölçer. Tahlil tamamlandıktan sonra kuyuların incelenmesi, pıhtı oluşumunun meydana geldiğini doğruladı.

Tüm reaksiyonlar, tromboplasti ve kalsiyum klorür öncesi başlangıç absorbansı ile maksimum absorbans arasında 0.35 ila 0.45 birim arasında 405 nanometrede genel bir absorbans değişikliği ile yaklaşık olarak aynı CloudFormation derecesine ulaştı. Ek olarak, faktör beş, tek aşamalı aktivite, saniye cinsinden standart pıhtı zamanı eğrisi, mil başına birim cinsinden faktör beş aktivitesi ve faktör beşe karşı dakika başına mili birim cinsinden pençe oluşumu başlangıç hızının temsili örneklerine gidin. Normal insan plazması için mil başına birim cinsinden aktivite sırasıyla panel A ve panel B'de gösterilmiştir.

Faktör beş normalde trombin ile aktive edildiğinden. Trombin ilavesi ve inkübasyonundan sonra ikinci bir test olan aktif kofaktör faktörü beş, faktör beş iki aşamalı test için trombin eklenerek kasıtlı aktivasyon ile bir plazma örneğinin faktör beş iki aşamalı aktivitesini doğru bir şekilde ölçmek için kritik öneme sahiptir. HBS pH 7.4'te yüz nano molar final konsantrasyonunda 200 ila 300 mikrolitre saflaştırılmış trombin hazırlayın ve buz üzerinde inkübe edin, normalin üzerindeki insan plazmasının 120 mikrolitresini seyreltin ve plazmaları 40 kat ila 100 kat arasında seyreltin, 170 mikrolitre HBS pH 7.4 ile 2.8 milimolar.

Kalsiyum klorür. Her numuneye 10 nanomolar final konsantrasyonu elde etmek için 10 mikrolitre trombin ekleyin. Girdap. Karıştırmak ve 37 derecede inkübe etmek için Bir dakika boyunca, normal insan plazmasını ve numune plazmalarını 400 mikrolitre HBS pH 7.4 ekleyerek 500 kata kadar seyreltin.

Soft max Pro'daki absorbansa karşı zaman profillerinden numune plazma bilinmeyenleri testinin her birinde normal insan plazması için pıhtılaşma süresini belirleyin. 500 kat seyreltmeyi hesaba katarak, pıhtı zamanına karşı aktiviteye karşı faktör beş bir aşamalı standart eğrisinden faktör beş iki aşamalı aktiviteyi hesaplamak için her numune için pıhtı süresini kullanın. Bu, faktör beş, iki aşamalı aktiviteyi veya trombin tarafından kasıtlı aktivasyonu olan faktörü temsil eder.

Toplam faktör beş aktivitesi daha sonra faktör beş iki aşamalı aktivite eksi faktör beş faktör bir aşama Faaliyeti olarak hesaplanabilir. Normal insan plazmasındaki faktör beş aktiviteye karşı log pıhtı zamanının standart Eğrisi, normal insan plazmasında ve yaygın intravasküler pıhtılaşma veya DIC'li dokuz hastadan, dokuz DIC hastasının tümünden alınan plazmalarda faktör beş aktivitesini ölçmek için kullanıldı. Faktör beş, bir evre aktiviteler ve başlangıç pıhtı oluşum oranları ortalama olarak %54 ve %18 oranında azalmıştırDIC hastalarında faktör beş, iki evre ve toplam aktivite, normal insan plazmasına kıyasla ortalama %44 ve %42 oranında azalmıştır.

Faktör beş ve DIC hastaları uzun süre ve lif pıhtısı oluşum oranının azalmasına neden oldu. Bu videoyu izledikten sonra, bu yöntemi laboratuvarınızda nasıl uygulayacağınız konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız. Yöntem, plazmadaki herhangi bir pıhtılaşma faktörünün aktivitesini ölçmek için kolayca uyarlanabilir, bu da onu çok çeşitli araştırma ve klinik uygulamalar için uygun hale getirir.

Sonuç olarak, faktör V'nin bu bilgisi, DIC gibi trombotik veya kanama bozukluklarının daha erken tanı ve tedavisi yoluyla sağlık hizmeti ortamlarını olumlu yönde etkileyecektir.