Gelişen ve Olgun Retina Nöronlar Tek hücreli Profilleme

Bu prosedürün genel amacı, mikroarray tabanlı transkriptom analizi için tek hücreleri izole etmektir. Bu, öncelikle retinanın çevre dokulardan diseke edilmesi ve ardından tek hücrelere ayrıştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, tek hücrelerin toplanması ve lizis tamponu içeren PCR tüplerine yerleştirilmesidir.

Ardından hücreler lizize edilir ve ters transkripsiyon ile ardından polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak cDNA amplifiye edilir. Son olarak, tek hücreli cDNA'nın bir AiMatrix mikroarray üzerinde hibridizasyonu, tek bir hücrede eksprese edilen mRNA'ları ortaya çıkarmak için kullanılır. Tek hücrelerde gen ekspresyonu profillemenin, tüm doku yaklaşımlarına kıyasla temel avantajı, tek hücre izolasyonunun, tüm dokuyu oluşturan çok küçük hücre popülasyonlarına erişim sağlamanıza imkan tanımasıdır.

Bu hücreler, farklı nöron tiplerinden küçük kök hücre popülasyonlarına kadar her şey olabilir. Tek hücre tekniğinin bu hücreler için bize sağladığı imkan, hem hücre tiplerini ve bu küçük hücre popülasyonlarına özgü belirteçleri tanımlamak hem de bu son derece nadir hücre alt kümelerinde eksprese edilen gen ağlarını belirlemektir. Ek olarak, tek hücre profilleme tekniği, çok küçük hücre alt kümelerinde, oldukça dinamik gelişimsel geçişler sırasında geçici olarak eksprese edilen gen ağlarını tanımlamamıza olanak tanır.

Bu yöntem, progenitör hücrelerin farklılaşma ile ilişkili gen ağlarını ne zaman eksprese etmeye başladığı ve bu progenitör hücrelerin birbirlerinden nasıl ayrıldığı gibi gelişimsel genetik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin doğurguları, glokom gibi nörodejeneratif hastalıklar için hücresel tedavilere kadar uzanmaktadır; çünkü bireysel hücrelerin gelişimindeki temel ağları aydınlatarak, bu hücreleri hücresel replasman tedavisinde kullanmak üzere üretmeye bir adım daha yaklaşmış oluyoruz. Bu prosedüre, fare retinasını PBS ile dolu bir kaba yerleştirerek başlayın.

Ardından, vitreus ve lensi çıkarın. Sonrasında retinal pigment epitelyumunun tamamını temizleyin. Retinayı 1,5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpünde 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, çökmüş hücreleri yerinden oynatmak için tüpe hafifçe vurun. Daha sonra P 1000 pipetle 10 ila 20 kez nazikçe trilte edin. Eğer büyük doku kümeleri devam ederse, örneği 37 °C'de 10 dakika daha inkübe edin ve 10 ila 20 kez tekrar trilte edin.

Ardından, retinaya 10 units/µL konsantrasyonunda beş µL DNA ekleyin ve beş dakika boyunca inkübe edin. Oda sıcaklığında, ardından P 1000 pipetleyici ile tekrar 10 ila 20 kez nazikçe karıştırın. 3000 RPM'de üç dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından süpernatantı uzaklaştırın ve dipte 100 ila 200 µL sıvı bırakın. Peleti yerinden oynatmak için tüpe hafifçe vurun. Daha sonra, 1 mL HBSS ekleyin ve peleti nazikçe rotasyonla yeniden süspande edin.

3000 RPM'de üç dakika boyunca santrifüj edin. İşlem tamamlandığında süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın. Ardından, örneği %0,1 BSA içeren 450 µL PBS içerisinde yeniden süspande edin; sonraki adımda, %0,1 BSA ile desteklenmiş beş mL PBS içeren iki adet altı santimetrelik kap hazırlayın.

Bir sonraki aşamada, disosiye edilen hücreleri tek bir kaba ekin. Hücrelerin çökmesi için en az beş dakika bekleyin. Ardından, disosiye hücrelerin bulunduğu kabı ters mikroskobun altına yerleştirin.

Tek bir hücreyi toplamak için aspiratör tüplü, ince uçlu bir pipet kullanın. Ardından mikropipeti hücreye yaklaştırın; hücre, kılcal etkileşim yoluyla kolayca mikropipete girecektir. Sonrasında hücreyi ikinci bir kaba aktarın ve gen ekspresyon profillemesi için yalnızca tek bir hücrenin toplandığından emin olun.

Bu işlem, ya gereksiz hücrelerin uzaklaştırılmasıyla ya da ilgilenilen hücrenin yeni bir mikro pipet yardımıyla farklı bir konuma taşınmasıyla gerçekleştirilir. Tek bir hücre komşu hücrelerden tamamen izole edildiğinde, ilgilenilen hücreyi aspire etmek için yeni bir mikro pipet kullanın. Ardından, hücreyi doğrudan 4.5 µL hücre lizis tamponu içeren 0.2 mL'lik bir PCR tüpüne aktarın.

Hücrenin lizis tamponuna batmasını sağlamak için örneği bir mikro santrifüjde kısa süreliğine döndürün. Bu döndürme işlemini her beş hücrede bir ve toplama işleminin sonunda tekrarlayın. Tek hücre izolasyonu süresince tüpü buz üzerinde tutmayı unutmayın ve bu prosedürde en iyi sonuçları elde etmek için tek hücreleri disosiasyondan sonraki iki saatlik zaman dilimi içerisinde toplayın; tek hücrenin hücre lizis tamponuna batmış olduğundan emin olmak için örneği bir mikro santrifüjde kısa süreliğine döndürün.

Hücre lizini teşvik etmek için örneği bir termosiklet cihazında 70 °C'de 90 saniye boyunca inkübe edin. Ardından tüpü hemen iki dakika boyunca tekrar buza yerleştirin. Ters transkripsiyonu gerçekleştirmek için 0,33 µL ekleyin.

200 unit/µL konsantrasyonunda 0,05 µL Superscript three, 40 unit/µL konsantrasyonunda 0,07 µL inhibitör ve tüpe T four geni ile 32 protein ekleyin. Reaksiyon karışımını bir termosiklet cihazında 50 °C'de 50 dakika boyunca inkübe edin; 50 dakika sonra, enzimi 70 °C'de 15 dakika daha tutarak inaktive edin.

Bu işlem tamamlandığında, tüpü tekrar buza yerleştirin. Serbest primerleri uzaklaştırmak için tüpe 0,1 µL 10 x ekzonükleaz tamponu, 0,8 µL dH₂O ve 0,1 µL (20 ünite/µL konsantrasyonunda) ekzonükleaz ekleyip bir termosiklet cihazında 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.

30 dakika sonra, reaksiyon karışımını 80 °C'de 25 dakika inkübe ederek enzimi inaktive edin. İşlem sonunda tüpü tekrar buz üzerine yerleştirin. Ardından, numuneye altı µL kuyruklama reaksiyon karışımı ekleyin.

Örneği termosiklatörde 37 °C'de 20 dakika, 70 °C'de 10 dakika inkübe edin ve ardından 4 °C'de muhafaza edin. Sonrasında, kuyruklu örnekten 10 µL'yi PCR reaksiyon karışımına ekleyin. cDNA'yı işaretlemek için ikinci zincir sentezini ve PCR amplifikasyonunu gerçekleştirin.

iMatrix mikro dizilerinde güçlü bir hibridizasyon elde etmek için, öncelikle tek hücreli CD NA'nın 10 ila 20 µL'sini sekiz µL 1x 1 for all tamponu ekleyerek fragmente edin. Ardından, bu seyreltilmiş DNA'dan 1 µL'yi 80 µL'lik bir reaksiyon çözeltisine ekleyin. Sonra, buna 20 µL 5X TDT tamponu, 2,5 µL biotin ve altı D-D-A-T-P ile 1 µL seyreltilmiş TDT ekleyin.

Ardından, karışıma 20 µL 5X TDT tamponu, 2.5 µL biotin, 6 µL dDATP ve 1 µL TDT ekleyin. Karışımı 37 °C'de 90 dakika boyunca inkübe edin. Ardından 65 °C'de beş dakika bekletin.

Ardından -20 °C'de saklayın veya hemen bir a iMatrix mikro dizisine hibridize edin. Burada tek hücreli cDNA yaymalarının ve gene özgü PCR'ların temsilci bir örneği verilmiştir; A-F-G-N-H şeritleri güçlü cDNA yaymaları içerirken B, C, D ve E şeritleri önemli ölçüde daha az güçlüdür. cDNA'lar floresan retinal ganglion hücrelerinden izole edilmiş ve ardından retinal ganglion hücresi belirteçleri olan BRN 3B ve PAC 6 için özgü PCR primerleri ve fotoreseptör belirteci için gene özgü PCR kullanılarak test edilmiştir.

Tek hücredeki kontaminasyon düzeyini belirlemek için CRX kullanılmıştır. cDNA'lar ve retinal ganglion hücrelerinin alt kümeleri, tachy kinin one geninin varlığı taranarak tanımlanmıştır. 22 farklı tek hücrede eksprese edilen seçili genlere ait mikroarray sonuçları, ısı haritası formatında gösterilmektedir.

Mikrodizi sinyallerinden elde edilen yoğunluklar, kırmızı rengin yoğunluğuna karşılık gelecek şekilde ölçeklendirilmiştir; siyah ise mikrodizide sinyalin yokluğunu belirtir. Bu prosedürün ardından, mikrodizide görülen gen ekspresyon paternini doğrulamak için QPCR gibi ek yöntemler kullanılabilir. C hibridizasyonundaki sonuçlar, belirli genleri eksprese eden hücrelerin konumları hakkında sahip olabileceğiniz ek soruları yanıtlamak için de kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, retinaların nasıl ayrıştırılacağı, tekil hücrelerin nasıl izole edileceği ve mikroarray üzerinde hibridizasyon için bu tekil hücrelerden nasıl cDNA üretileceği konusunda oldukça iyi bir fikre sahip olmalısınız.