Gelişen ve Olgun Retina Nöronlar Tek hücreli Profilleme

Bu prosedürün genel amacı, mikrodizi tabanlı transkriptom analizi için tek hücreleri izole etmektir. Bu, önce retinanın çevre dokudan diseke edilmesi ve daha sonra tek hücrelere ayrılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, tek hücrelerin hasat edilmesi ve bunların lizis tamponu içeren PCR tüplerine bırakılmasıdır.

Daha sonra hücreler parçalanır ve CDNA, ters transkripsiyon kullanılarak amplifiye edilir, ardından polimeraz zincir reaksiyonu yapılır. Sonuç olarak, tek hücreli CD NA'nın bir A iMatrix mikrodizisi üzerinde hibridizasyonu, tek bir hücrede eksprese edilen mRNA'ları ortaya çıkarmak için kullanılır. Tek hücrelerde gen ekspresyonunun profilini çıkarmanın tüm doku yaklaşımlarını kullanmaya karşı temel avantajı, tek hücre izolasyonunun, tüm dokuyu içerecek çok küçük hücre popülasyonlarına erişim sağlamanıza izin vermesidir.

Bu hücreler, farklı nöron türlerinden küçük kök hücre popülasyonlarına kadar her şey olabilir. Tek hücre tekniğinin bu hücreler için yapmamıza izin verdiği şey, her iki hücre tipini, bu küçük hücre popülasyonları için spesifik belirteçleri tanımlamak ve bu son derece nadir hücre alt kümelerinde ifade edilen gen ağlarını tanımlamaktır. Ek olarak, tek hücre profilleme tekniği, çok küçük hücre alt kümelerinde çok dinamik gelişimsel geçişler sırasında geçici olarak ifade edilen gen ağlarını tanımlamamıza izin verir.

Bu yöntem, progenitör hücrelerin farklılaşma ile ilişkili gen ağlarını ifade etmeye başladığı ve bu progenitör hücrelerin birbirinden nasıl farklılaştığı gibi gelişimsel genetik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, glokom gibi nörodejeneratif hastalıklar için hücresel tedavilere kadar uzanır, çünkü tek tek hücrelerin gelişimindeki anahtar ağları açıklayarak, hücresel replasman tedavisinde kullanılmak üzere bu hücreleri üretebilmeye bir adım daha yaklaşıyoruz. Bu prosedüre, fare retinasını PBS ile doldurulmuş bir kaba yerleştirerek başlayın.

Ardından, vitreusu ve lensi çıkarın. Ardından tüm retina pigment epitelini çıkarın. Retinayı 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin.

Daha sonra, yerleşmiş hücreleri çıkarmak için tüpe hafifçe vurun. Ardından, bir P 1000 pipetleyici ile 10 ila 20 kez nazikçe üç kez derecelendirin. Büyük doku kümeleri devam ederse, 37 santigrat derecede 10 dakika daha inkübe edin ve 10 ila 20 kez soğutun.

Daha sonra, retinaya mikrolitre başına 10 birimde bir tane olmak üzere beş mikrolitre DNA ekleyin ve beş dakika boyunca inkübe edin. Oda sıcaklığında trier, daha sonra 10 ila 20 kez daha P 1000 pipetleyici ile nazikçe derecelendirin. 3000 RPM'de üç dakika santrifüjleyin.

Sonra süpernatanı çıkarın ve altta 100 ila 200 mikrolitre sıvı bırakın. Peleti çıkarmak için tüpe dokunun. Daha sonra, bir mililitre HBSS ekleyin ve peleti yumuşak bir tat ile yeniden süspanse edin.

3000 RPM'de üç dakika santrifüjleyin. Tamamlandığında, süpernatanı dikkatlice çıkarın. Daha sonra resus, bir sonraki adımda% 0.1 BSA içeren 450 mikrolitre PBS içinde askıya alın,% 0.1 BSA ile desteklenmiş beş mililitre PBS içeren iki altı santimetre tabak hazırlayın.

Sonraki tabak, ayrışmış hücreleri bir tabağa koyun. Hücrelerin en az beş dakika oturmasına izin verin. Bundan sonra, ayrışmış hücrelerin tabağını ters çevrilmiş bir mikroskop altına yerleştirin.

Tek bir hücreyi hasat etmek için aspiratör tüplü ince uçlu bir pipet kullanın. Daha sonra mikro pipeti hücrenin yakınına yerleştirin ve kılcal bir hareketle mikro pipete kolayca girecektir. Daha sonra hücreyi ikinci bir tabağa atın ve gen ekspresyonu profili oluşturmak için yalnızca bir hücrenin hasat edildiğinden emin olun.

Bu, ya yabancı hücrelerin çıkarılması ya da ilgilenilen hücrenin yeni bir mikro pipetle farklı bir yere taşınması yoluyla yapılır. Tek bir hücre komşu hücrelerden tamamen izole edildiğinde, ilgilenilen hücreyi aspire etmek için yeni bir mikro pipet kullanın. Daha sonra, doğrudan 4,5 mikrolitre hücre lizis tamponu içeren 0,2 mililitrelik bir PCR tüpüne atın.

Hücreyi lizis tamponuna daldırmak için numuneyi bir mikro santrifüjde kısa bir süre döndürün. Bu döndürmeyi her beşinci hücreden sonra ve ardından toplamanın sonunda tekrar yapın. Tüpü tek hücre izolasyonu süresince buz üzerinde tutmayı ve bu prosedürde en iyi sonuçları elde etmek için tek hücreleri ayrışmadan sonraki iki saatlik bir pencere içinde toplamayı unutmayın, tek hücrenin hücre lizis tamponuna daldırıldığından emin olmak için numuneyi bir mikro santrifüjde kısaca döndürün.

Hücre lizizini teşvik etmek için, numuneyi bir termocycler'da 90 saniye boyunca 70 santigrat derecede inkübe edin. Ardından tüpü hemen iki dakika boyunca tekrar buzun üzerine yerleştirin. Ters transkripsiyonu gerçekleştirmek için 0.33 mikrolitre ekleyin.

Üst simge: mikrolitre başına 200 birim, 0.05 mikrolitre inhibitör, mikrolitre başına 40 birim ve 0.07 mikrolitre. T dört gen 32 proteini tüpe. Reaksiyon karışımını 50 dakika sonra bir termosiklertörde 50 santigrat derecede 50 dakika inkübe edin, enzimi 70 santigrat derecede 15 dakika daha inaktive edin.

Bu yapıldığında, tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin. Serbest astarı çıkarmak için 0,1 mikrolitre 10 x eksonükleaz tamponu, 0,8 mikrolitre, D H2O ve 0,1 mikrolitre ekleyin. Eksonükleaz, bir termocycler'da 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edilen tüpe mikrolitre başına 20 birimde bir.

30 dakika sonra, reaksiyon karışımını 80 santigrat derecede 25 dakika inkübe ederek enzimi inaktive edin. Sonunda, tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, numuneye altı mikrolitre atık reaksiyon karışımı ekleyin.

Termosiklerde 37 santigrat derecede 20 dakika, 70 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin ve ardından dört santigrat derecede tutun. Daha sonra, kuyruklu numuneden 10 mikrolitre PCR reaksiyon karışımına ekleyin. CDNA'yı etiketlemek için ikinci iplik sentezini ve PCR amplifikasyonunu gerçekleştirin.

Bir iMatrix mikrodizileri üzerinde sağlam bir hibridizasyon elde etmek için, önce tek hücreli CD NA'dan 10 ila 20 mikrolitre ekleyerek CD NA'yı sekiz mikrolitreye, bir x bir tüm tampon için parçalayın. Daha sonra bu seyreltilmiş DNA'nın bir mikrolitresini 80 mikrolitrelik bir reaksiyon çözeltisine ekleyin. Daha sonra, 20 mikrolitre, beş XTDT tamponu, 2.5 mikrolitre biotin ve altı D-D-A-T-P ve bir mikrolitre seyreltilmiş TDT ekleyin.

Ardından, 20 mikrolitre, beş XTDT tamponu, 2.5 mikrolitre, biotin ve altı D-D-A-T-P ve bir mikrolitre TDT ekleyin. Karışımı 37 santigrat derecede 90 dakika inkübe edin. Sonra 65 santigrat derecede beş dakika.

Daha sonra eksi 20 santigrat derecede saklayın veya hemen bir iMatrix mikro dizisine hibritleyin. İşte tek hücreli CD NA yaymalarının temsili bir örneği ve gene özgü PCR şeritleri A-F-G-N-H sağlam CD NA yaymaları içerirken, B, C, D ve E şeritleri önemli ölçüde daha az sağlamdır. CDNA'lar floresan retinal ganglion hücrelerinden izole edildi ve daha sonra retinal ganglion hücre belirteçlerine özgü PCR primerleri, BRN üç B ve PAC altı, fotoreseptör belirteci için gene özgü PCR kullanılarak test edildi.

Tek hücredeki kontaminasyon seviyesini belirlemek için CRX kullanıldı. CDNA'lar ve retinal ganglion hücrelerinin alt kümeleri, taşi kinin geninin varlığı taranarak tanımlandı. 22 farklı tek hücrede ifade edilen seçilmiş genler için mikrodizi sonuçları, bir ısı haritası formatında gösterilir.

Mikrodizi sinyallerinden gelen yoğunluklar, kırmızı rengin yoğunluğuna karşılık gelecek şekilde ölçeklendirilirken, siyah, mikrodizide sinyal olmadığını gösterir. Bu prosedürü takiben, mikroışında görülen gen ekspresyon paternini doğrulamak için QPCR gibi ek yöntemler kullanılabilir. C hibridizasyonundaki sonuçlar, belirli genleri ifade eden hücrelerin konumları hakkında sahip olabileceğiniz ek soruları yanıtlamak için de kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, retinaları nasıl ayrıştıracağınız, tek hücreleri nasıl izole edeceğiniz ve bu tek hücrelerden CDNA'yı nasıl üreteceğiniz konusunda oldukça iyi bir fikre sahip olmalısınız. Mikrodizi üzerinde hibridizasyon için.