Name: ECIS / Taksiler ile Hücresel Kemotaksis Ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Öğrenin, ECIS/Taxis sistemiyle hücresel kemotaksisi gerçek zamanlı ve otomatik olarak ölçme yöntemini. Elektrik hücre altyapı empedans algılama teknolojisi kullanılarak hücre hareketleri direnç değişimleriyle izlenir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (ES07408 ve EB00208) hibe ile desteklenmiştir.

1. ECIS / Taksiler Elektrot Hazırlanması <ol><li> ECIS / taksiler elektrot dizisine (sürgülü başına 8 odadan oluşan) ve altın yüzeyinin ilk steril koşullar altında, oda sıcaklığında 15 dakika için deiyonize su (2 dH O) steril 10 mM sistein ile ön-muamele ile stabilize edilir. </li><li> Her bir elektrot odasının sistein çözüm aspire, steril dH 2 O ile 3 kez yıkayın ve tam orta 250 ul (RPMI 1640,% 10 FBS, 25 mM HEPES tampon) ile değiştirin. </li><li> Elektrot denetimi gerçekleştirmek için enstrüman dizi tutucu pimleri irtibata elektrot dizisi bağlayın. </li><li> Düzgün bağlandığından emin Odaları bilgisayar ekranında yeşil vurgulanır. Odalarına kırmızı olarak görünüyorsa, birbirlerine bağlı değildir ve elektrot tüm odaları için temas kurmak için dizi sahibinin yeniden yerleştirilmelidir. </li><li> Tüm odaları bağlı olduğunda, caydırmak için yazılım denetleyicisi "onay" butonuna tıklayınHer oda için ilk direnç ve kapasite değerleri mayın. Direnç değerleri 1600 arasında ve 2000 ohm olmalıdır ve kapasitans değerleri 8 odası dizi için 5 ila 6 nanofarads olmalıdır. Bir oda, bu kabul edilebilir sınırlar dahilinde değil ise, tek tek odasına veri toplamak için kullanılmamalıdır. </li><li> Bireysel agaroz odalarına hazırlamak için dizi sahibinin elektrot ayırın. Odalarından orta aspire ve steril dH 2 O, her odası 3 kez yıkayın </li></ol> 2. Agaroz Chambers hazırlanması <ol><li> Steril bir 15 ml polipropilen konik tüp, ölçü 0.03 Seakem GTG agaroz g ve 1 ml steril PBS ekleyin. Gevşek tüp kap yerleştirin ve 2 dakika sıvı döngüsü için otoklavda agaroz (mikrodalga fırında eritme Bu deneyde etkili değildir) eritin. Bu kısa zaman konik tüp eritmeyecek. (Örneğin Diktiyostelyum diskodeyum)% 0.5, kültür için serum gerekmez az titiz hücreler içinagaroz uygun ortamda yapılan ve mikrodalgada eritebilir. Mikrodalgada eritilip, bu doğallığından edileceği gibi, otoklav, serum gerektiren hücreleri için gereklidir. </li><li> Bir su banyosu içinde ısıtılmış tam RPMI medyumu 5 mL (55 ° -60 ° C) doğrudan sıcak agaroz için,% 0.5 agaroz ve pipet kadar bir son konsantrasyon elde etmek ve aşağı doğru hafifçe karıştırılır. </li><li> Her bir odacık içine eritilmiş agaroz orta pipet 300 ul, ECIS / taksiler dizi kapağı değiştirmek ve oda sıcaklığında jel izin verir. </li><li> Agaroz jel değerlendirmek için 15 ml tüp kap içine agaroz kalan pipetleyin. Bu aşırı agaroz bölüm 4 de kullanılacaktır: agaroz içine kuyu Kesme. </li></ol> 3. Peki Kesici Takım Oluşturma ve Kanül Bileme <ol><li> , 5/64 "bit. Düşük devirli her kanül açılış matkap ucu döndürün kullanarak matkap her kanül op tüm iç kenarı keser belli yaparak, iki 14 gauge kör uç kanüller Keskinleştirkeskin bir kesme kenarı (Şekil 4A) oluşturmak için kısalmasının. </li><li> Bir matkap basın bit 1 "x 2" x ¼ "5/64 ile pleksiglas (Şekil 4B-D)" ile iki delik açın. Her pleksiglas delikten eşit mesafede çıkacak şekilde her bilenmiş 14 gauge kanül takın. </li></ol> 4. Agaroz içine Wells Kesme <ol><li> Hafifçe ipuçları alev tarafından 14 gauge kanül sterilize edin. Önceden ECIS odacık içinde kuyu kesilmesi için kanül oda sıcaklığına soğumasına izin vermek, ya da 15 ml tüpün kap içinde agaroz dokunarak kanüller soğumaya. Kanül sıcaklığı çok yüksek ise odasına kuyular kesilir gibi, agaroz kuyuları şekilsiz ve kusurlu render eriyecek. </li><li> Her bir odacık içinde hedef elektrot (Şekil 2C ve 5) çevreleyen iki altın nokta yukarıda kanül çifti hizalama. Kanül arasında hafif temas halinde durdurma, herhangi bir yatay hareket olmadan, kanül dikey olarak yerleştirinelektrod yüzey. Dikkatlice herhangi bir yatay hareket olmadan tekrar kanül kaldırın. Gradyanları karşıt için ek kuyuların Yerleştirme kanül jig bir yeniden yapılandırılması ile mümkündür. </li><li> Yavaşça agaroz atık yakalamak Bir vakum tuzak düşük vakum basıncı bağlı steril bir 9 "Pasteur pipeti, kullanarak, kanül bıraktığı agaroz fişi aspire. </li><li> Agaroz bombalamak için 2 dakika, 37 her odanın yüzeyine ° C ile tam RPMI medya 300 ul ekleyin ve sonra yavaşça agaroz bozmadan yüzey ve kuyulardan medya aspire. </li></ol> 5.. Wells Yükleniyor <ol><li> Her iyi 7 ul hacmi tutma yetisine sahiptir. Her odasında bir iyi için, hücre süspansiyonu 7 ul ekleyin. Jurkat T hücreleri için, 2 x10 7 hücre / ml kullanımı. Bu hücreler 200 serum yoksun eksik RPMI ile seyreltilen ng / ml SDF-1α, 7 ul cevap verecektir. Olumsuz bir devam olarak tek başına eksiksiz bir medya kullanınrol. </li><li> Kuyular yüklendikten sonra, tüm kuyuları kesilmiş ve düzgün dolduruldu sağlamak için bir inverted mikroskop ile dizinin her odası görüntülemek. Hücreler de en sınır sınırları içinde olmalıdır. Bu kuyular hem görülür, ya da hücre de sınır ötesine yayılıyor, sonra bir boşluk agaroz altında oluşturmuştur. Veriler güvenilir olanlar odalarından yorumlanamaz gibi, yanlış kurmak kuyuları unutmayın. </li></ol> 6. Bilgi toplama <ol><li> Dizi tutucu elektrot yerleştirin ve sahibinin yaylı pogo iğne elektrot dizi altın yastıkları yeniden bağlanmak ve "Kur" butonuna tıklayınız. Düzgün bağlandığından emin kuyular yeşil vurgulanır. Kuyu kırmızı ise, birbirlerine bağlı değildir ve elektrot dizisi tutucu yeniden konumlandırılabilir olmalıdır. </li><li> Dizi yapılandırması belirtmek için yazılım panelindeki açılır menüden gelen "8WE1" (8 sıra 1 elektrot) seçin. </li><li> Yazılım Contr de "onay" seçeneğini seçinHer sıra için ilk direnç ve kondansatör değerlerini belirlemek üzere ol paneli. Kapasitans değerleri 5 ila 6 nanofarads olmalı ise direnci değerleri, 1600 ila 2000 ohm olmalıdır. </li><li> Çeşitli frekanslarda direncini ölçmek için birden fazla frekans seçin. Frekansları özelleştirme, ya da tavsiye edilen bir frekans kümesini kullanarak bir seçim var. Standart çoklu frekans satın ayarları 8 kuyu / dak hızında 11 ön ayarlı frekans (52.5, 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 8.000, 16.000, 32.000 ve 64.000 Hz) veri yakalama. Ölçümler arasındaki zaman aralığı da özelleştirilebilir. Birden fazla frekans Veri Toplama kapasitans, empedans ve direnç analizi sağlar. 4.000 Hz direnç değerleri toplanıyor memeli hücre kemotaksisi çalışmaları için genellikle yeterli olur, ancak ek frekansları başka bağlamlarda 12,13 de bilgi sunabilir. </li><li> Toplam deneme süresi sağ taraftan ayarlanabilirpaneli veya deney hücrelerin elektrotta varış göstergesidir direnci üretmişlerdir kez "finish" tıklayarak, elle durdurulabilir. Hücreler elektrot ulaşmak için geçen süre kullanılan hücre tipine bağlıdır. </li><li> Veri toplama başlatmak için "Başlat" düğmesini tıklayın. </li></ol> 7. Veri Yönetimi <ol><li> Verileri Excel'e de, ECISθ sistemi eşlik ECIS 1600R yazılım, ECIS / Taksiler verilerini analiz etmek için en etkili yöntemdir. </li><li> Yazılım veri analizi araç çubuğu radyo düğmeleri Z, R ve C Bunlar sırasıyla empedans, direnç, ya da kapasitans, x-ekseni (geçen süre) karşı dikey eksende çizilen olup olmadığını belirlemek içerir. </li><li> ECIS / Taksiler verileri en verimli 4.000 Hz de zaman içinde direnç olarak görüntülenir. Hızlı direnç dalgalanmalar ya da microtransients (Şekil 1), elektrot üzerinden hücresel hareketin kanıtıdır. O, Derlemer binning veri noktaları öyle değil tüm noktaları grafikle olduğunu, ECIS / Taksiler için tavsiye edilmez bu verilerin ortalama microtransients dışarı edeceğinden. </li><li> Grafik ECIS1600R yazılımı ile yapıldıktan sonra, dosya menüsünden "ihracat grafiği" seçerek ve bir. Tif veya. Jpg dosyası olarak kaydedilir tarafından ihraç edilebilir. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar Hücresel kemotaksis 4.000 Hz'de direnç artışı ile gösterilir. Hedef hücreler elektrot üzerine gelmesinden da Opp et açıklandığı gibi microtransients veya micromotion adlandırılan direnci hızlı değişimden görünüşü gösterilmektedir. ark., 2009 (Şekil 1) 14. Negatif bir sonuç tutarlı gösterilir, ya da Şekil 1'de kırmızı görülen 4.000 Hz direnci hafif bir azalma, edilir. Microtransients yokluğu da elektrot hücre hareketin yokluğu bir işaretidir. Direncinde artış, doğrudan doğruya bir proelektrot 10 geçmeye numarasını hücrelere portional. G proteinin reseptörler ile etkileşime bilinen monoklonal antikor ilave bir kemoatraktan için spesifik olan ya da toksin kemotaksi 11 bloke edebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig1.jpg"> Şekil 1.. SDF1α. İnsan T hücreleri Jurkat (2.0x10 6 hücre / ml) yanıt olarak T İnsan Jurkat hücrelerinin kemotaksi SDF-1α bir gradyan maruz bırakıldı, bir negatif kontrol olarak ya RPMI 1640 (konsantrasyonu 100 ng / ml 'den başlayarak). 4000 Hz'de normalize direnci grafikle edildi. Herhangi bir hareket RPMI 1640 maruz kalma ile görülen iken insan Jurkat T hücreleri gibi direnci ve microtransients artışı gösterdiği, SDF-1α yanıt olarak hareket ettirilir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig2.jpg"> Şekil 2. Bir ECIS / Taksiler üstten görünümü ezelî Elektrodt agaroz. Her ECIS / Taksiler elektrot 8 ayrı odadan oluşmaktadır. Her bir odacık büyük bir elektrot (a) Grubu ve her bir hedef elektrot (b) içerir. Her haznesi ayrıca kanülle agaroz içinde kuyu keserken bir kılavuz olarak kullanılan 2 altın halkalar (c) sahiptir. Altın kareler (d) elektrot için AC akım uygulamak için pogo pimleri bağlanmak temas pedleri vardır. Tekil hedef elektrotlar daha büyük karşı elektrot (e) ile her bir devre içinde bulunmaktadır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig3.jpg"> Şekil 3. İki Wells her agaroz dolu odasına kesilir. Kemoatraktan iyi bir eklendiğinde iyi kemoatraktan en yakın chemoattract en yüksek konsantrasyon ile, agaroz bir degrade oluşturmak için yayılır. Hücreler kemoatraktan yüksek konsantrasyonda doğru agaroz altında seyahat ve hedef elektrot üzerinden geçebilir. Gibihücreleri hedef elektrot çapraz direnç artışı ECIS 1600R yazılım tarafından kaydedilir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig4.jpg"> Şekil 4. Pleksiglas içine iki adet 14 gauge kanül yerleştirilmesi. A) 5/64 "matkap kanül ucu netleştirmek için kullanılır. B) iki delik düzeni atış göre 14 ölçü kanüller barındırmak için Pleksiglas Delinmiş edilmelidir. C) sağlamak üzere delikleri, bir sondaj pres kullanımı dik olan pleixglass yüzey. D) İki bilenmiş Cannulae ¼ "pleksiglas, birbirinden 2 mm (iç kenarlarından ölçüldüğünde) aracılığıyla eklenir. Bu bilenmiş kanüller dikkatle kuyuları kesmek için agaroz eklenir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3840/3840fig5.jpg"> Şekil 5. ECIS / Taksiler odasındaki altın noktalarla kanüller hizalama. Kuyuları kesmek için, bilenmiş kanüller gerekirECIS / Taksiler odasının altındaki hedef elektrot kuşatan altın nokta ile uyumlu hale getirilmesi. Kanüller herhangi bir yatay hareketi olmadan, dikey olarak yerleştirilir, ve aynı şekilde kaldırılması gerekir.

<ol><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+gradients+of+chemotactic+factors+in+chemotaxis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays.</a> Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).</li>
<li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+under+agarose%3A+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).</li>
<li>Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+chemokinetic+behavior+of+inflammatory+lung+macrophages+in+a+linear+under-agarose+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay.</a> J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).</li>
<li>Keese, C. G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Whole+Cell+Biosensor+bsed+on+Cell-Substrate+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).</li>
<li>Laevsky, G., Knecht, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking+of+actin+filaments+by+myosin+II+is+a+major+contributor+to+cortical+integrity+and+cell+motility+in+restrictive+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments.</a> J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).</li>
<li>Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+amoeboid+chemotaxis%3A+an+evaluation+of+the+cortical+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion.</a> 11, 5-6 (1990).</li>
<li>Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+real-time+measurement+of+chemotactic+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Automated real-time measurement of chemotactic cell motility.</a> Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).</li>
<li>Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+real-time+measurements+of+leukocyte+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis.</a> J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).</li>
<li>Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metallothionein+mediates+leukocyte+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis.</a> BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).</li>
<li>Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+MCP-1+expression+in+airway+epithelial+cells%3A+role+of+CCR2+receptor+in+airway+epithelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury.</a> J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).</li>
<li>Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aryl+hydrocarbon+receptor+repressor+is+a+putative+tumor+suppressor+gene+in+multiple+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers.</a> J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).</li>
<li>Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electric+cell-substrate+impedance+sensing+to+assess+in+vitro+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).</li>
<li>Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+conflicting+chemotactic+signals.+The+role+of+memory+in+leukocyte+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation.</a> J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).</li>
<li>Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intracellular+signaling+hierarchy+determines+direction+of+migration+in+opposing+chemotactic+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients.</a> J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).</li>
</ol>

David A Knecht ve Michael A Lynes olarak Uygulamalı Biyofizik, Inc Connecticut Üniversitesi tarafından lisans almış ECIS / Taksiler teknolojisi için verilen patent var

ECIS / Taksiler testinin roman özelliklerine hücreleri kemoatraktan yanıt olarak gerçek zamanlı veri toplama otomatikleştirmek yeteneğini içerir. Bu teknolojinin en yaygın uygulama bireysel kemotaktik gradientinden hücresel tepkileri ölçmek veya kemotaksis agonistleri ve antagonistleri karışımlarından oluşan gradientinden üzere iken, ECIS / Taksiler yaklaşımı da oldukça yararlı olabilecek bu yapılandırmalar için varyasyonların mükellef olduğu hücresel yanıt değerlendirilmesi. Örtüşen veya ardışık gradyanlar yeni yollar ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> ECIS Zθ </td><td> Uygulamalı Biyofizik </td><td></td><td> <a href="http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php">http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php</a> </td></tr><tr><td> ECIS Elektrot Array </td><td> Uygulamalı Biyofizik </td><td> 8W Kemotaksis </td><td> <a href="http://www.biophysics.com/cultureware.php">http://www.biophysics.com/cultureware.php</a> </td></tr><tr><td> Seakem GTG agaroz </td><td> Biowhittaker Moleküler Uygulamaları </td><td> 50070 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone Fetal Bovine Serum </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH300703 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomisin </td><td> MP Biomedicals </td><td> 1670049 </td><td> Penisilin 5000 U / ml; streptomisin 5 mg / ml </td></tr><tr><td> HEPES tampon </td><td> MP Biomedicals </td><td> 1688449 </td><td> 1M solüsyonu, hücre kültürü dereceli </td></tr><tr><td> 14 Gauge paslanmaz çelik Kanül (2) 4 inç </td><td> Genel Laboratuvar Kaynağı </td><td> 5-8365-1 </td><td> Blunt noktası </td></tr></tbody></table>

ecis / taksiler ile hücresel kemotaksis Ölçümü

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Dış uyaranlara yanıt Hücresel hareket yara iyileşmesi, enflamasyon ve enfeksiyona yanıt dahil, birçok hücresel süreçleri için esastır. Kemotaksi ölçmek için ortak bir yöntem hücreleri ve kemoatraktan bir gözenekli zar ile ayrılmış edildiği Boyden haznesi assay vardır. Hücreleri kemoatraktan doğru zarından göç gibi, onlar membran veya temel ortamı içine düşme alt uymak ve daha sonra boyandı ve görsel 1 sayılır. Bu yöntemde, hücreler dokuları 2&#39;de bulunan geçişlerini kötü bir temsil olduğu düşünülmektedir dik ve geçici kemoatraktan degrade, maruz kalmaktadır. Başka bir deney sisteminde, altında-agaroz kemotaksi deneyi, 3, agaroz tabakasının altında oluşturan bir sulu ince film bir alt tabaka arasında bir katı 4 önlemleri hücre hareketi. Agaroz gelişir degrade sığ ve bir uygulama olduğu düşünülmektedirdoğal eğimleri meydana gelen temsili uygun olur. Kemotaksis katedilen mesafe mikroskopik görüntüleme ile değerlendirilebilir. Boyden çemberinin tahlil ve altı agaroz testi genellikle iki nokta deneyleri olarak yapılandırılır. Otomatik ECIS / Taksiler sistemi Elektrik Hücre-substrat Empedans Algılama (ECIS) 5, 6 altı agaroz yaklaşımı birleştirir. Bu deneyde, hedef elektrotlar 8 odalarına her yer alır. Büyük bir karşı-elektrot 8 odalarına (Şekil 2) her biri aracılığıyla çalışır. Her bir odacık agaroz ile doldurulur ve iki küçük kuyu hedef elektrot her iki tarafında da agaroz kesilmiş olan edilir. Diğer difüzyon kemoatraktan kaynakları (Şekil 3) tutarken biri de, test hücre popülasyonu ile doludur. Sistem geçirilir Mevcut hücreleri hedef elektrot üzerine çıkması olarak ortaya çıkar direnç değişim belirlemek için kullanılabilir. Hedef Hücreler elektrodlarıe sistemi 6 direncini artırır. Buna ek olarak, dalgalanma direnci hızlı elektrot yüzey ile hücre etkileşim içinde değişikliklerin temsil eden ve hücresel şekil değişikliği işaret etmektedir. ECIS / Taksiler sistemi uzun süre üzerinden gerçek zamanlı olarak hücre popülasyonunun hareketini ölçmek değil, aynı zamanda hedef elektrot tek bir hücrenin varış algılayacak kadar duyarlıdır. Dictyostelium discoidium bir folat gradyanı 7, 8 ve kemotaktik tepkisi doğru ECIS / Taxis 9 ile ölçülebilir varlığında geçirmek bilinmektedir. Lökosit kemotaksi, SDF1α ve kemotaksi antagonistleri yanıt olarak, aynı zamanda ECIS / Taksiler 10, 11 ile ölçülmüştür. SDF1α için lökosit tepkisi bir örnek Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir.

ECIS / Taksiler sistemi hücresel kemotaksis ölçer otomatik, gerçek zamanlı bir testtir. Bu deneyde, bir hedef hücreler elektrot varmak için agaroz bir katmanı altındaki hareket eder. Hücresel hareketi AC akım 0 direnç başlangıcı ile ölçülür.

ECIS / Taksiler ile Hücresel Kemotaksis Ölçümü

Dış uyaranlara yanıt olarak gerçekleşen hücresel hareket; yara iyileşmesi, inflamasyon ve ... yanıtı dahil olmak üzere birçok hücresel süreç için temel teşkil eder.

Bu prosedürün genel amacı, elektrikli hücre substrat empedans algılaması veya EISs kullanan otomatik bir gerçek zamanlı analizle kemotaksisi ölçmektir. Bu işlem, öncelikle her bir bölme tam RPMI medyumunda %0,5 agros ile doldurularak axxis elektrotlarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, 14 gauge kanül düzeneği ile her bölmedeki agros tabakasına eş zamanlı olarak iki kuyu açmak ve her bölmedeki iki agros tıpasını aspire ederek dışarı çıkarmaktır.Bir kuyu tek hücre süspansiyonu ile, diğeri ise kemoatraktan ile doldurulur. Ardından, elektrot; test edilen hücre tipine uygun atmosferik parametrelere ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirilen dizi tutucu aracılığıyla ISIS theta sistemine bağlanır. Son olarak, hücrelerin iki kuyu arasındaki hedef elektroda ulaşmasıyla birlikte dirençteki değişimin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi yoluyla hücresel kemotaksi gözlemlenebilir.Axxis analizinin Boyden odacığı analizi veya geleneksel mikroskop tabanlı agar altı analizleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, sistemin sürekli manipülasyonuna gerek kalmadan kemotaksisin gerçek zamanlı otomatik ölçümlerine olanak tanımasıdır. Elektrot hazırlığına başlamak için, ISIS Texas elektrot dizisinin altın yüzeyini, steril koşullar altında oda sıcaklığında 15 dakika boyunca deiyonize su içindeki steril 10 millimolar sistein ile ön işlem yaparak stabilize edin. Ön işlemin ardından, her bir elektrot odacığındaki sistein solüsyonunu aspire edin.Steril deiyonize su ile üç kez durulayın ve yerine 250 µL komple medyum ekleyin. Ardından, elektrot kontrolünü gerçekleştirmek için elektrot dizisini cihaz dizi tutucusundaki kontak pinlerine bağlayın. Doğru şekilde bağlanan odacıklar bilgisayar ekranında yeşil renkle vurgulanacaktır.Odacıklar kırmızıyla vurgulanmışsa, bunlar bağlı değildir ve tüm odacıklar için bağlantılar kurmak amacıyla elektrot, dizi tutucuda yeniden konumlandırılmalıdır. Tüm odacıklar bağlandığında, her bir odacığın başlangıç direnç ve kapasitans değerlerini belirlemek için ISYS Theta yazılım denetleyicisindeki kontrol düğmesine tıklayın; sekiz odacıklı bir dizi için direnç değerleri 1600 ile 2000 ohm arasında, kapasitans değerleri ise beş ile altı nanos arasında olmalıdır. Münferit bir odacık bu kabul edilebilir parametreler dahilinde değilse, veri toplamak için kullanılmamalıdır.Ardından, bireysel aros odacıklarını hazırlamak için elektrodu dizi tutucusundan ayırın. Odacıklardaki medyumu aspire edin ve her bir odacığı steril deiyonize su ile üç kez yıkayın. Aros odacıklarının kurulumuna başlamak için, yazılı protokolde tartışıldığı üzere RPMI medyum içeren bir aros çözeltisi hazırlayın.Her bir hazneye 300 µL eritilmiş agros ortamı pipetleyin, kalan agros'u 15 mL'lik bir tüpün kapağına pipetleyin. Agros jelleşmesini değerlendirmek için ISIS axxis dizi kapağını geri takın ve yeniden kullanılabilir kanül oluşturmak için oda sıcaklığında jelleşmeye bırakın. Kuyucuk kesme aracıyla iki adet 14 gauge küt uçlu kanülü sivriltin.Bir 5/64 inçlik matkap ucu kullanarak, matkap ucunu her bir kanül açıklığının içinde düşük hızda döndürün ve matkap ucunun her kanül açıklığının tüm iç kenarını kestiğinden emin olun. Keskin bir kesme kenarı oluşturmak için pleksiglas üzerinden 5/64 inçlik bir uçla iki delik açın. Bir sütunlu matkap kullanarak, her bir keskinleştirilmiş 14 gauge kanülü, pleksiglastan eşit mesafede çıkıntı yapacak şekilde deliklerden birine yerleştirin.EIS odacığında kuyucuklar açmadan önce, kanül uçlarını hafifçe alevden geçirerek 14 gauge kanül aracını sterilize edin. Kanülü, 15 milliliter tüpün kapağındaki agarla temas ettirerek soğutun. Kanülün sıcaklığı düşürülmezse, oda kuyucukları açılırken agar eriyecek, bu da kuyucukların şeklinin bozulmasına ve kusurlu olmasına neden olacaktır.Agrosların bütünlüğünü bozmadan kuyucukların kesilmesi, bu prosedürün en zor kısmıdır. Bu işlem, kanülün dikkatli bir şekilde hizalanmasını ve çok düşük vakum basıncını gerektirir. Kanül çiftini, her bir oda içindeki hedef elektrodu çevreleyen iki altın noktanın üzerine hizalayın.Kanülü, herhangi bir yatay hareket yapmadan, kanül ile elektrot yüzeyi arasında hafif bir temas oluştuğunda duracak şekilde dikey olarak yerleştirin. Kanülü, vakum tuzağına bağlı düşük vakum basınçlı steril beş inçlik bir pastör pipeti kullanarak, tekrar herhangi bir yatay hareket yapmadan dikkatlice çıkarın. Agar atıklarını toplamak için, kanül aleti tarafından bırakılan agar tıkaçlarını nazikçe aspire edin.Ardından, arosları doyurmak için 37 °C'de iki dakika boyunca her bir bölmenin yüzeyine 300 µL komple RPMI besiyeri ekleyin. İki dakika sonra, arosları rahatsız etmeden yüzeydeki ve kuyucuklardaki besiyerini nazikçe aspire edin. Her bir kuyucuk, her bölmedeki bir kuyucuğa 7 µL hücre süspansiyonu tutabilecek kapasitededir.Bu gösterimde, jca T hücreleri mililitre başına 2 x 10⁷ hücre konsantrasyonunda kullanılmıştır. Ardından, kemoatraktanın 7 µL'sini odacıkların ikinci kuyucuğuna yükleyin. JCA T hücreleri için, eksik ortamda seyreltilmiş 200 ng/mL sdf-1α kullanılır.Negatif kontrol yüklemesi için kemotaktik çekici olarak RPMI kullanılır. İkinci kuyucuğa yalnızca yedi mikrolitre tamamlanmış besiyeri ekleyin. Kuyucuklar yüklendikten sonra, tüm kuyucukların uygun şekilde kesildiğinden ve doldurulduğundan emin olmak için dizinin her bir bölmesini evirt mikroskop ile inceleyin.Hücreler, kuyucuk sınırları içerisinde olmalıdır. Eğer her iki kuyucukta da hücreler görülüyorsa veya hücreler kuyucuk sınırının dışına taşıyorsa, aros altında bir boşluk oluşmuş demektir. Uygun şekilde kurulmamış kuyucuklardan elde edilen verilerin güvenilir bir şekilde yorumlanamayacağı unutulmamalıdır.Veri toplama işlemine başlamak için elektrodu dizi tutucuya yerleştirin. Elektrot dizisindeki altın pedleri, tutucunun yaylı pogo pinlerine yeniden bağlayın ve ISIS theta yazılımındaki kurulum ayarlarını tıklayarak belirleyin. Doğru şekilde bağlanan kuyucuklar yeşil renkle vurgulanacaktır.Kuyucuklar kırmızıysa bağlantı kurulmamış demektir ve elektrot, açılır menüden dizi tutucuda yeniden konumlandırılmalıdır. Yazılım panelinde, sekiz W bir noktalı virgül seçeneğini seçin. Bu, dizi konfigürasyonunu belirtir. Sekiz.Yazılım kontrol panelindeki bir kuyucuk elektrodu için, başlangıç direnç ve kapasitans değerlerini belirlemek üzere kontrol seçeneğini işaretleyin. Her biri için, direnci birkaç farklı frekansta ölçmek amacıyla birden fazla frekans seçin. Çoklu frekans verilerinin toplanması; kapasitans, empedans ve direncin analiz edilmesine olanak tanır.Frekansların özelleştirilmesi veya önerilen frekans setinin kullanılması seçenekleri mevcuttur. Standart çoklu frekans kazanım ayarları, dakikada sekiz kuyucuk hızında, önceden ayarlanmış 11 farklı frekansta veri toplayacaktır. Ölçümler arasındaki zaman aralığı da özelleştirilebilir.Toplam deney süresi sağ panelden ayarlanabilir. Alternatif olarak, deney "bitir" butonuna tıklanarak manuel olarak durdurulabilir. Hücreler, elektroda ulaştıklarına işaret eden bir direnç oluşturduğunda, veri toplamayı başlatmak için "başlat" butonuna tıklayın.Veriler excel'e aktarılabilse de, EISs theta sistemiyle birlikte gelen EISs 1600 R yazılımı, EISs tax verilerini analiz etmek için en verimli yöntemdir. Yazılımın veri analiz araç çubuğu Z, R ve C radyo düğmelerini içerir. Bunlar, dikey eksende X eksenine (geçen süreye) karşı sırasıyla empedansın mı, direncin mi yoksa kapasitansın mı çizileceğini belirler. EISs tax verileri, en verimli şekilde 4,000 hertz'de zamana bağlı direnç olarak görüntülenir.Dirençteki hızlı dalgalanmalar veya mikro geçişler, veri noktalarının birikmesi veya bükülmesi şeklinde elektrot üzerinden gerçekleşen hücresel hareketlerin kanıtıdır; tüm noktaların grafiğe aktarılmaması nedeniyle esys ekseni için önerilmez, çünkü bu durum mikro geçişlerin veri içinde ortalanmasına yol açacaktır. Grafik oluşturulduktan sonra, ISIS 1600 R yazılımı ile dosya menüsünden "export graph" (grafiği dışa aktar) seçeneği belirlenerek dışa aktarılabilir ve bir veya JPEG dosyası olarak kaydedilebilir.İnsan J CAT T hücreleri, hareketi stimüle etmek için bir SDF one alpha gradyanına veya negatif kontrol olarak RPMI 1640'a maruz bırakıldı. 4, 000 hertz'deki normalize edilmiş direnç burada grafiklenmiştir. Hücresel kemotaksis, insan J CAT T hücrelerinin SDF one alpha'ya yanıt olarak hareket etmesiyle 4, 000 hertz'deki direncin artmasıyla belirtilir.Hücrelerin hedef elektroda varışı, mikro geçişler (micro transients) olarak adlandırılan dirençteki hızlı dalgalanmaların görülmesiyle belirlenir. Dirençteki artış, elektrodun üzerinden geçen hücre sayısıyla doğru orantılıdır. Negatif bir sonuç ise, 4,000 hertz'de direncin stabil kalmasıyla veya dirençte hafif bir azalma olmasıyla belirtilir.Bu durum, hücreler RPMI 1640'a maruz bırakıldığında gözlemlenir. Mikro geçici akımların yokluğu, elektrottaki hücre hareketinin yokluğunun da bir göstergesidir. Bu temel prosedüre ek olarak, kemoatraktanlara özgü monoklonal antikorların, farmasötik modifikatörlerin veya toksinlerin varlığında hücresel hareketi izlemek için Esys, Texas kullanılarak başka modifikasyonlar da yapılabilir.

measurement-of-cellular-chemotaxis-with-ecistaxis

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, chemoeffectors istikrarlı konsantrasyon gradyanlar bakteriyel kemotaksis soruşturma için bir mikroakışkan aygıt geliştirme açıklar.

Kararlı Konsantrasyon Degradeler Bakteriyel Kemotaksis miktarının mikroakışkan Aygıt

Bu video, nematod C. elegans'ta kemotaksisi tanıtıyor ve bakır sülfata karşı kemotaktik kaçınmayı test eden örnek bir protokolü gösteriyor.

C. elegans Kemotaksis Testi: Solucanlarda Kemosensasyonu Test Etmek İçin Bir Yöntem

Niceliksel kemotaktik tepkiyi değerlendirmek için bir...

C. elegans Kemotaksis Deneyi

Hücre göçü, insan gelişiminin ve yaşamının önemli bir parçasıdır. Hücre göçünü değiştirebilecek mekanizmaları anlamak için, mevcut tahlillerin modern difüzyon odası sınırlamalarının üstesinden gelmeye izin veren bir 3D kollajen matrisinde kemotaksisi araştırmak için düzlemsel bir gradyan difüzyon sistemi sunuyoruz.

Planar Gradient Difüzyon Sistemi 3D Kollajen Matrix Kemotaksis Araştırma

Görsel kemotaksis deneyleri kemoatraktan aracılı yönlü hücre göçü nasıl kontrol ökaryotik hücreler daha iyi anlaşılması için gereklidir. 1) Gerçek zamanlı, çoklu kemotaksis deneyleri yüksek çözünürlüklü izleme ve 2) aynı anda kemoatraktan degrade görselleştirmek ve nötrofil gibi HL60 hücrelerinde sinyal olaylarının zamanmekansal dinamiği: Burada ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır.

Görüntüleme G Nötrofil gibi HL60 Hücreleri Kemotaksis ve Sinyal Olaylar Reseptör aracılı Protein-çiftli

Lenfosit kemotaksis ve geçiş kantitatif değerlendirilmesi için protokolleri İmmünoloji araştırma için önemli araçlardır. Burada, bir vitro Protokolü izni gerçek zamanlı, hücre göç değerlendirilmesi yanı sıra bir tamamlayıcı vivo içinde teknik etkinleştirme izlemeyle yerli hücreleri dalak multiplexed açıklanmıştır.

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Burada akut mekanik stimülasyon hücresel yanıt değerlendirmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Mikroskopi tabanlı tahlil fluorescently etiketli biyosensörler kesme akışı ile kısa stimülasyon takip yerelleştirilmesini inceleyin. Ayrıca akut mekanik stimülasyon karşılık olarak ilgi çeşitli proteinlerin aktivasyonu biyokimyasal olarak test ediyoruz.

Dictyostelium discoideum yanıt-e doğru akut mekanik stimülasyon değerlendirilmesi

Burada sunulan bir in situ kemotaksis test için protokol, çevrede doğrudan mikrobiyal davranış çalışmaları sağlayan yeni geliştirilen mikroakışkan bir cihaz.

Sucul Ekosistemlerde Mikrobiyal Davranışı İncelemek Için Situ Chemotaxis Tsay'da

Burada, model organizma C. elegans'ta klasik koşullandırma gerçekleştirerek ilişkisel öğrenmeyi test etmek için bir protokol sunuyoruz. Paradigma, ortamdaki tuz konsantrasyonunu, kemotaksislerini tuza doğru veya tuzdan uzaklaştıran gıdanın varlığı veya yokluğu ile eşleştirmeye dayanır.

Nematod Caenorhabditis elegans'ın Kemotaksisinde İlişkisel Öğrenmenin Ölçülmesi

Mikroakiskan kullanarak Bakteriyel Kemotaksis Çalışmaları - Röportaj

Öğrenin, ECIS/Taxis sistemiyle hücresel kemotaksisi gerçek zamanlı ve otomatik olarak ölçme yöntemini. Elektrik hücre altyapı empedans algılama teknolojisi kullanılarak hücre hareketleri direnç değişimleriyle izlenir.

ECIS / Taksiler ile Hücresel Kemotaksis Ölçümü

Daha fazla video keşfet