Name: GIRK Kanal Modülatörler belirlenmesi için Floresan Tarama Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Keşfedin GIRK kanal modülatörlerini floresan tarama testi ile farmakolojide. ATT20 hücreleri ve membran potansiyeli duyarlı boyalar kullanılarak yüksek verimli ilçe tarama yapılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Amerikan Halk Sağlığı Servisi ödül NS-071.530 tarafından desteklenmiştir.

1. Hücreler hazırlanması <ol><li> % 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferinde% 10 at serumu ve 37 ° C&#39;de kültür muhafaza ile desteklenmiş Dulbecco değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde hipofiz hücreleri AtT20 büyür. </li><li> Standart bir tripsinizasyon prosedürü kullanılarak hücrelerin 5-7 günde bir alt kültüre tarafından kültürü muhafaza. </li><li> Siyah, açık bir alt katın kuyuları, poli-L-Lizin 50 uL 96-kuyucuklu plaklar. Kuyular inkübatörde 30 dakika kurumasını bekleyin. </li><li> Çukur başına 30,000 hücre yoğunluğunda ve 3-4 gün için inkübatöre hücreleri depolamak 200 uL ortamı içeren 96 kuyucuklu plaklar içinde plakası hücreleri. </li><li> Yavaş yavaş hücre monolayer gelen kültür ortamı aspire bir ucunda bir vakum bağlı kapaklı bir 4 litrelik kavanoz ve diğer ucunda 200 ul pipet oluşan bir aspirasyon kurulum, kullanın. </li><li> Normal tampon çözeltisinin 200 uL (132 mM NaCl, 5 mM KCI, 1 m hücreleri yıkayıpM CaCI2, 1 mM MgCl2, 5 mM dekstroz, 5 mM HEPES, NaOH ile pH 7.4). </li><li> Her oyuğa zar potansiyeli duyarlı boya (MPD) DiBAC 4 (3) ya da HLB 021-152 (5 uM) ihtiva eden tampon çözeltisinin 200 uL ekleyin ve 37 azından 40 dakika süreyle inkübe edilir hücreleri ° C. </li></ol> 2. Test Bileşiklerinin ve Hücre Tedavi hazırlanması <ol><li> Bir Versette (ThermoFisher) otomatikleştirilmiş sıvı taşıma sistemi kullanılarak bir bileşik kütüphanesinden test bileşiklerinin bir seri seyreltme (DMSO içinde stok = 10 mM) (96-kuyucuklu biçiminde) hazırlayın. </li><li> , 96-plaka çıkarın AtT20 hücreleri içeren, inkübatör gelen ve plakası oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Eski tampon kapalı aspire ve hücrelere MPD içeren taze tampon çözümü uygulayın. </li><li> Sıvı işleme sisteminin çeşitli test bileşiklerinin konsantrasyonu (10 nM 10 uM) (2-20 uL) ve kontrol çözeltileri (% 0.1 DMSO) (tampon çözeltisi containi uygulanır kullanılarakhücreler içeren 96 kuyucuklu plak için ng MPD). </li><li> Floresan ölçümü için önceden test bileşikleri ile birlikte 5 dakika süreyle inkübe hücreleri. </li></ol> 3. GIRK Kanallar aktivasyonu, Floresan Ölçüm ve Analiz <ol><li> Bir BIOTEK Synergy2 floresan plaka okuyucu içine 96-plaka takın ve sırasıyla, uyarma ve emisyon dalga boyları 520 ve 560 nm floresan arka sinyal edinin. </li><li> Synergy2 enjektör sistemini kullanarak GIRK kanalları etkinleştirmek için (toplam hacim = 220 uL) kuyulara GPCR ligandlar (somatostatin = 200 nM veya karbakol = 10 uM) ya da kontrol solüsyonu (tampon tek başına) (20 uL) uygulayın. Sırasıyla, uyarma ve emisyon dalga boyları 520 ve 560 nm, 300 s örnekleme dönemi boyunca 10 sn aralıklarla veri puan toplayın. </li><li> Zaman ders ve BIOTEK Gen5 yazılımı kullanarak floresan değişimi tepe genliği elde etmek ve daha fazla analiz için Excel&#39;e veri ihracat. </li&gt; <li> Assay of güvenilirliğini belirlemek için Z&#39;-faktörü hesaplamak. Z&#39;faktör tayini için kullanılan plakalar 2 satır olumlu her (GPCR ligand) ve negatif (tampon yalnız) kontrolleri içeriyordu. Z&#39;-faktörü olarak tanımlanır: Z &#39;= 1 - (p + 3σ 3σ N) / | μ P - μ N | μ P &amp; μ N pozitif kontrol ve negatif kontrol sinyallerinin aracı olup, ve σ P &amp; σ N pozitif kontrol standart sapmalarının ve negatif kontrol sinyalleri, sırasıyla, 6 vardır. 0,5-1,0 aralığında Z&#39;-faktörleri assay of kalitesi 6 mükemmel olduğunu göstermektedir. 0.5 Aşağıda Z&#39;-faktörleri ile Tabaklar analiz dışında tutulmuştur. </li><li> Floresan sinyali modüle Bileşikler içeri düzeltici K + kanal özgüllük onaylamak için Ba 2 varlığı + veya tertiapin-Q yeniden test edilir. </li></ol> 4. Representative Sonuçlar GIRK kanalı deneyi kullanılarak ölçülmüştür floresans sinyalinin bir örnek, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. AtT20 hücrelere GPCR ligand somatostatin (200 nM) ilave HLB 021-152 flüoresan sinyali bir hızla, zamana bağlı azalma (Şekil 2) neden olmuştur. Bunun aksine, kontrol solüsyonu ilave süre ile (Şekil 2) başlangıç ​​dönen bir floresans küçük bir ani yükselme üretilir. Somatostatin kontrolü ve çözümleri enjekte 96-kuyucuklu plaklar içinde tepe floresan değerleri ile karşılaştırılması 0,7-0,5 arasında değişen bir Z&#39;-faktörleri verdi. Daha da nicelendirilmek üzere, kontrol kayıt kayıt somatostatin çıkarıldı ve elde edilen somatostatin duyarlı sinyali (Şekil 2) analiz edildi. Assay hızlı GIRK kanallar modüle ilaçların belirlenmesi için bir yöntem sağlar. Örneğin, ilaç GIRK cha inhibe ettiklerinnel hücrelerinden K + efflux önleyerek floresans GPCR ligand-aracılı azalır azaltacaktır. Bloklar GIRK kanal 7, somatostatin-aracılı flüoresan değişikliğinin bir inhibisyon üretilen Şekil 3, tertiapin-Q, bir toksin sahip hücrelerin tedavisinde de gösterildiği gibi. Propafenon, kalp 8 blok GIRK kanalı, aynı zamanda flüoresan değişimi (Şekil 4) inhibe ettiği bir anti-aritmik ilaç. Assay da GIRK kanalının aktivatörleri belirlenmesi için yararlı olabilir. Çözeltisi (p &lt;0.5) kontrol ile karşılaştırıldığında Ancak, etanol uygulama (100 ve 200 mM), GIRK kanalı 2,3, bir aktivatör flüoresan sinyali önemli bir değişiklik yoktur neden oldu. <img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. GIRK kanal fluoresan antikor testi Deneysel tasarım. AtT20 hücreleri, bir membran ihtiva eden tampon içinde kuluçkalanıre potansiyel duyarlı floresan boya (D). Boya molekülleri hücre içine girmek ve proteinleri (üst panel) bağlanarak üzerine floresan olur. Onun GPCR için (Som) somatostatin Bağlama GIRK kanalı (alt panel) aktivasyon neden G inhibitör protein (G i) uyarır. K hücre dışı + ve daha sonra akış hücreleri çıkmak için daha negatif ve boya molekülleri haline zar potansiyeli neden olur. Sonuç olarak floresan sinyal azaldıkça (alt panel). <img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Somatostatin veya kontrol solüsyonu eklenmesi sırasında AtT20 hücrelerinin zaman içinde ölçülen Şekil 2. Temsilcisi HLB 021-152 floresan sinyal. Floresan yoğunluğu (F / F O) oranı (F O) reklamı önce ölçülen temel sinyal ile somatostatin varlığı (F) (veya kontrol solüsyonu) sinyal bölünmesi ile elde edilmiştirsomatostatin olduğunu belirtmektedir (ya da kontrol solüsyonu). Her nokta ortalama ± SE 5-6 kuyularda elde temsil eder. Somatostatin veya kontrol solüsyonu zaman sıfır (↓) ilave edildi. Kontrol solüsyonu ilave flüoresan sinyal küçük bir geçici bir artışa yol açmıştır. Bu çözelti enjeksiyon neden olduğu bir sıcaklık değişimi ile sonuçlanmıştır. <img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3. Tertiapin-S (500 nm) AtT20 hücreleri tedavisi için bağlayıcı ve GIRK kanalı bloke flüoresan sinyali somatostatin-aracılı azalma inhibe eder. Her nokta ortalama ± SE 4-6 kuyularda elde temsil eder. Somatostatin zaman sıfır (↓) ilave edildi. <img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Şekil 4. Propafenon (20 uM) ile AtT20 hücreler arıtılması ayrıca somatostatin-aracılı azalma inhibefloresan sinyal. Her nokta ortalama ± SE 5-6 kuyularda elde temsil eder. Somatostatin zaman sıfır (↓) ilave edildi.

<ol><li>Hibino, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifying+potassium+channels%3A+their+structure%2C+function+and+physiological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Inward rectifying potassium channels: their structure, function and physiological roles.</a> Physiol. Rev. 90, 291-366 (2010).</li>
<li>Lusscher, C., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+for+G+protein-gated+inwardly+rectifying+potassium+%28GIRK%29+channels+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emerging roles for G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels in health and disease.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 301-315 (2010).</li>
<li>Kobayashi, T., Ikeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-activated+inwardly+rectifying+potassium+channels+as+potential+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cur.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">G protein-activated inwardly rectifying potassium channels as potential therapeutic targets.</a> Cur. Pharm. Des. 12, 4513-4523 (2006).</li>
<li>Terstappen, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+native+and+recombinant+ion+channels+using+a+high-capacity+nonradioactive+rubidium+efflux+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of native and recombinant ion channels using a high-capacity nonradioactive rubidium efflux assay.</a> Anal. Biochem. 272, 149-155 (1999).</li>
<li>Cheng, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+HERG+potassium+channel+function+assay%3A+an+old+assay+with+a+new+look%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Dev.+Ind.+Pharm%22%5BJournal%5D)">A high-throughput HERG potassium channel function assay: an old assay with a new look.</a> Drug Dev. Ind. Pharm. 28, 177-191 (2002).</li>
<li>Zhang, J. -H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochem. 37, 13291-13299 (1998).</li>
<li>Inomata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-arrhythmic+agents+act+differently+on+the+activation+phase+of+the+Ach-response+in+guinea+pig+atrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Anti-arrhythmic agents act differently on the activation phase of the Ach-response in guinea pig atrial myocytes.</a> Br. J. Pharmacol. 108, 111-116 (1993).</li>
<li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+high+throughput+functional+assay+methods+for+HERG+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of high throughput functional assay methods for HERG potassium channel.</a> J. Biomol. Screen. 6, 325-331 (2001).</li>
<li>Wolff, C., Fuks, B., Chatelain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+membrane+potential-sensitive+fluorescent+probes+and+their+use+in+ion+channel+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 533-513 (2003).</li>
<li>Niswender, C. M., Johnson, K. A., Luo, Q., Avala, J. E., Kim, C., Conn, P. J., Weaver, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+of+Gi%2Fo-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+group+III+metabotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharm. 73, 1213-1224 (2008).</li>
<li>Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+Ether-%C3%A1-go-go+related+gene+screening+assays+based+on+IonWorks+Quattro+and+thallium+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">Comparison of human Ether-á-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Membran potansiyeli duyarlı floresan boyalar iyon kanallarını modüle uyuşturucu 9,10 tanımlamak için kullanılmış iken, bu nöronal GIRK kanal ilaç keşfi için uygulama ilk rapordur. Burada sunulan GIRK kanal fluoresan antikor testi ligand kapılı K + kanalları tarama için hızlı, güvenilir ve gerçek zamanlı bir yöntem sağlar. Tahlil, bir eksojen rekombinant GIRK kanalı 11 veya klonal hücre çizgileri (AtT20, PC-12), bir endojen kanalı ifade ifade ölümsüzleştirilmiş hücreleri çizgileri (HEK293...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> CellGro </td><td> 10-013 </td></tr><tr><td> At serumu </td><td> Invitrogen </td><td> 16050-114 </td></tr><tr><td> 96-kuyucuklu plaklar </td><td> Corning </td><td> 3603 </td></tr><tr><td> Poli-L-Lizin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4707 </td></tr><tr><td> Somatostatin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9129 </td></tr><tr><td> Karbakol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4382 </td></tr><tr><td> HLB 021-152 </td><td> AnaSpec </td><td> 89300 </td></tr><tr><td> Versette otomatik sıvı işleyici </td><td> ThermoFisher </td><td> 650-01 </td></tr><tr><td> Synergy2 floresan plaka okuyucu </td><td> BIOTEK </td><td></td></tr><tr><td> Gen5 analizi software </td><td> BIOTEK </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Özel reaktifler ve ekipman Tablo.

girk kanal modülatörler belirlenmesi için floresan tarama testi

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G-protein bağımlı içeri düzeltici K + (GIRK) kanalları hormonlar ve nörotransmitterler geniş bir yelpazede hücresel mediatörler olarak işlev ve beyin, kalp, iskelet kas ve endokrin doku 1,2 olarak ifade edilir. GIRK kanallar ve plazma zar bağlı, G proteinine kenetlenmiş reseptörlerin (GPCRs) ila (nörotransmiterler, hormonlar, ilaç vs) ligand bağlama sonra aktive olur. Bu bağlanma sonradan bağlanır ve GIRK kanalı aktive protein G (G i ve G o) uyarılması neden olur. Bir kez GIRK kanal K hareketi + dışarı daha olumsuz olma potansiyeli istirahat membran neden hücrenin sağlar açtı. Sonuç olarak, nöronlarda GIRK kanal aktivasyon spontan aksiyon potansiyeli oluşumu azalır ve eksitatör nörotransmitterlerin salınımını inhibe eder. Kalbinde, GIRK kanal aktivasyonu böylece kalp hızını yavaşlatan pacemaker aktivitesi inhibe eder. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; GIRK kanal tedavisi nöropatik ağrı, ilaç bağımlılığı, kardiyak aritmiler ve diğer bozukluklar 3 için yeni terapötik ajanların geliştirilmesi için yeni hedefleri temsil eder. Bununla birlikte, bu kanalların farmakoloji büyük ölçüde keşfedilmemiş kalır. Anti-aritmik ajanlar, antipsikotik ilaçlar ve antidepresan ilaç içeren bir dizi GIRK kanalı bloke rağmen, bu inhibisyon seçici değildir ve nispeten yüksek bir ilaç konsantrasyonlarını 3 meydana gelir. Burada, GIRK kanalların yeni modülatörleri belirlenmesi için bir reel-zamanlı tarama deneyi açıklanmaktadır. Bu deneyde, GIRK kanallar ifade nöronal AtT20 hücreleri, bu tür bis-(1,3-dibutylbarbituric asit) gibi zar potansiyeli hassas boyaların flüoresan ile yüklenir trimethine oxonol [4 DiBAC (3)] ya da HLB 021-152 (Şekil 1 ). Boya molekülleri hücreleri (Şekil 1) içine kuvvetli flüoresan aşağıdaki uptake hale gelir. TedaviGPCR ligandlar olan hücrelerin açmak için GIRK kanallar uyarır. Hücresinin neden K + efflux dışarı daha negatif haline zar potansiyeli ve azaltmak için flüoresan sinyali (Şekil 1) neden olur. Böylece, GIRK kanalı yoluyla K + efflux modüle ilaçlar bir floresan plak okuyucu kullanarak test edilebilir. Diğer iyon kanal tarama testleri gibi atomik absorpsiyon spektrofotometresi 4 veya radyotracer analizi 5 aksine, GIRK kanal fluoresan antikor testi, hızlı, gerçek zamanlı ve ucuz bir tarama prosedürü sağlar.

G-protein bağımlı içe düzeltici K ile etkileşim ilaçların belirlenmesi için gerçek zamanlı tarama yöntemi<sup&gt; +</sup&gt; (GIRK) kanalları açıklanmıştır. Tahlil GIRK kanal aktivitesini ölçmek için membran potansiyeli duyarlı floresan boyalar kullanır. Bu teknik, hücre serileri bir dizi kullanım için uyarlanabilir.

GIRK Kanal Modülatörler belirlenmesi için Floresan Tarama Testi

G proteini geçitli içe doğru doğrultucu K+ (GIRK) kanalları, geniş bir yelpazedeki hormon ve nörotransmitterlerin hücresel aracıları olarak görev yapar ve ... içinde eksprese edilir.

Bu prosedürün genel amacı, grk kanallarını modüle eden yeni ilaçların belirlenmesidir. Bu işlem, öncelikle A TT 20 hücrelerinin 96 kuyucuklu plakaya ekilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise, test bileşiklerinin Verset sıvı plaka işlem sistemi kullanılarak seyreltilmesidir.Ardından, seyreltilmiş test bileşikleri verset kullanılarak hücrelere uygulanır. Son adım, 96 kuyucuklu plakanın Synergy two floresan plaka okuyucuya yerleştirilmesi ve kontrol ile somatostatin çözeltilerinin kuyucuklara enjekte edilmesidir. Nihayetinde, floresan plaka okuyucu, somatostatin tarafından indüklenen floresan sinyalini değiştiren ve böylece Grk kanallarını modüle eden bileşikleri göstermek için kullanılır.Bu prosedürün patch clamp kaydı gibi mevcut yöntemlere göre avantajı, gerk kanallarını modüle edip etmediklerini belirlemek için çok sayıda bileşiğin hızlı bir şekilde taranabilmesidir. Bu tekniğin etkileri, FI nosiseptif iletiminin inhibisyonuna yol açan ve Gerk kanalını aktive eden bileşiklerin tanımlanabilmesi sayesinde ağrı tedavisine kadar uzanmaktadır. 96 kuyucuklu plakaların kaplanması ve hücrelerin ekilmesi prosedürünü Maribel Vasquez göstermektedir.Laboratuvarımdaki bir öğrenci bu prosedüre, pituitary A TT 20 hücrelerini %10 at serumu ile desteklenmiş DMEM içerisinde, %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde, 37 degrees Celsius'ta büyüterek başlar. Standart bir izolyasyon prosedürü kullanarak hücreleri her beş ila yedi günde bir alt kültüre alarak kültürü sürdürün. Ardından, siyah şeffaf kuyucukları kaplayın.96 kuyucuklu plakanın tabanını 50 µL poly L lysine ile kaplayın. Kuyucukların inkübatörde 30 dakika boyunca kurumasına izin verin. Ardından fazla poly L lysine'i uzaklaştırın ve hücreleri, her kuyucukta 200 µL besiyeri olacak şekilde 30.000 hücre/kuyucuk yoğunluğunda 96 kuyucuklu plakaya ekin.Ardından hücreleri üç ila dört gün boyunca inkübatörde saklayın. Kültür ortamını hücre monotabakasından yavaşça aspire etmek için bir aspirasyon düzeneği kullanın, ardından hücreleri 200 µL normal tampon çözelti ile yıkayın. Sonrasında, her birine membran potansiyeline duyarlı boya içeren 200 µL tampon çözelti ekleyin.Hücreleri 37 °C'de 40 dakika boyunca inkübe edin. 40 dakika sonra, ATT 20 hücrelerini inkübatörden çıkarın, oda sıcaklığına dönmelerini bekleyin ve eski tamponu aspire edin. Ardından, hücrelere MPD içeren taze tampon çözeltisini uygulayın.Ardından, test bileşiklerinin ve kontrol çözeltilerinin çeşitli konsantrasyonlarını hücrelere uygulamak için sıvı taşıma sistemini kullanın. Floresan ölçümleri öncesinde, hücreleri 96 kuyucuklu plakada test bileşikleriyle birlikte beş dakika boyunca inkübe edin. Bu prosedürde, 96 kuyucuklu plağı bir biotech synergy two floresan plaka okuyucuya yerleştirin.520 nanometre eksitasyon dalga boyunda ve 560 nanometre emisyon dalga boyunda floresan arka plan sinyalini elde edin. Ardından, Synergy two injektör sistemini kullanarak GIR kanallarını aktive etmek için kuyucuklara G PCR R ligandlarını veya kontrol çözeltisini uygulayın. Daha sonra 302 saniyelik bir örnekleme süresi boyunca on saniyelik aralıklarla veri noktalarını toplayın.Uyarılma ve emisyon dalga boylarında. Analizin güvenilirliğini belirlemek için Z faktörünü hesaplayın. 0,5 ile 1,0 arasındaki Z faktörleri, analizin kalitesinin mükemmel olduğunu gösterir.Z faktörleri 0,5'in altında olan plaklar hariç tutulmuştur. Analiz sonucunda floresan sinyali modüle eden bileşikler, içe doğru doğrultucu potasyum kanalı özgünlüğünü doğrulamak amacıyla 2 millimolar baryum klorür veya 500 nanomolar terapin Q varlığında yeniden test edilmiştir; burada somatostatin veya kontrol çözeltisinin eklenmesiyle ATT 20 hücrelerinde zamanla ölçülen temsili bir HLB 0 2 1 1 15 2 floresan sinyali gösterilmektedir. Y eksenindeki floresan yoğunluğu oranı, somatostatin veya kontrol çözeltisi varlığındaki sinyalin, somatostatin veya kontrol çözeltisi eklenmeden önce ölçülen bazal sinyale bölünmesiyle hesaplanmıştır.Burada, A TT 20 hücrelerinin 500 nano molar Terapin Q ile tedavisi gösterilmektedir. Terapin Q, iki G kanalına bağlanıp bunları bloke ederek somatostatin aracılı floresan sinyal azalmasını inhibe eder. Burada ise, somatostatin aracılı floresan sinyal azalmasını yine inhibe eden 20 mikromolar propafenon ile A TT 20 hücrelerinin tedavisi gösterilmektedir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde işlem iki saatte tamamlanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, floresan plaka okuyucu kullanarak grk kanallarını modüle eden ilaçların nasıl tanımlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

a-fluorescent-screening-assay-for-identifying-modulators-girk

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz gramicidin kanal aktivitesinin bir ölçüsü olarak floresan su verme hızı monitörleri hızlı bir floresan bazlı analiz tanıtmak. Gramicidin kanalları, çift katlı kapsayan proteinler tarafından algılanan, çift katlı lipid özellikleri değişiklikleri izlemek için moleküler kuvvet dönüştürücüler olarak kullanılır.

Gramicidin tabanlı Floresan Testi; çift katlı lipid Özellikleri değiştirmek için Küçük Moleküller Potansiyel Belirleme

Içe doğru doğrultucu potasyum (Kir), yüksek verim Bileşik elemesi için kanal aktivitesini ölçmek için nicel bir floresan deneyi geliştirilmesi ve doğrulanması için yöntemler sunulmaktadır.

İçte düzeltici Potasyum Kanallarının Küçük moleküllü Modülatörler için Yüksek throughput Eleme

Kaynak: Rugjee, K. N., ve diğerleri. Pseudomonas aeruginosa'da c-di-GMP Sinyalini Modüle Eden Küçük Moleküllerin Taranması için Yüksek Verimli Bir Kurulumun Kurulması.  J. Vis. Uzm. (2016).Bu video, c-di-GMP'ye duyarlı bir promotörün kontrolü altında yeşil floresan proteini (GFP) eksprese eden genetiği değiştirilmiş bakteriler kullanılarak siklik di-GMP modülatörlerinin taranmasını göstermektedir. Floresan, farklı test bileşikleri içeren çok kuyulu bir plakada ölçülür. C-di-GMP üretimini...

Bir Floresan Raportör Proteini Eksprese Eden Bakteriler Kullanılarak Siklik di-GMP Modülatörlerinin Taranması 

Bu video, floresan bazlı test yoluyla immünomodülatör bileşiklerin taranmasını göstermektedir. Yeşil floresan protein ekspresyon kasetlerine sahip transgenik fare kaynaklı T lenfositleri bu bileşiklerle tedavi edilir. Geliştirilmiş ve azaltılmış GFP sinyalleri, sırasıyla bileşiklerin uyarıcı ve inhibitör etkilerinin tanımlanmasını sağlar.

İmmünomodülatör Bileşiklerin Taranması için Tasarlanmış Lenfositlerin Kullanıldığı Floresan Bazlı Bir Test

Bu video, CXCR4 kemokin reseptörlerini eksprese eden glioblastoma hücrelerini içeren bir hücresel testi göstermektedir. Tahlil, ajan etkileşimi üzerine floresan değişikliklerini ölçmek için kalsiyuma duyarlı bir boya kullanır ve hücresel sinyalleşme dinamikleri hakkında içgörüler sunar.

CXCR4 ile Etkileşime Giren Ajanların Tanımlanması için Hücresel Bir Test

Burada açıklanan flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahlil yetim G-protein bağlı reseptörler (GPCR'ler) fonksiyonel olarak aktive edici ligandın (ler) in belirlenmesi için, bir orta-throughput ters farmakoloji tarama sistemidir.

Bir floresan bazlı Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi G proteini ile birleştirilmiş alıcıların karakterizasyonu

Açıklanan hücresel tahlil CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4) tanımlanması için tasarlanmıştır-inhibe veya teşvik, rekabetçi veya allosterically, CXCR4 etkinleştirme tarafından başlatılan intrasellüler Ca2 + serbest etkileşen aracıları.

Bir Kinetik Floresans tabanlı Ca2 + seferberlik tahlil G Protein birleştiğinde reseptör agonistleri, antagonistleri ve Allosteric modülatörler tanımlamak için

Burada, gap junction oransal kimyasal ilaç bulma ve toksikolojik değerlendirme için yüksek üretilen iş filtreleme için tasarlanmış bir roman gap junction hücreler arası iletişim tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.

Bir iyodür-Sarı floresan Protein-Gap Junction hücreler arası iletişim tahlil

GPCR-β-tutucu etkileşimleri GPCR uyuşturucu keşfi 'nde ortaya çıkan bir alandır. Canlı sistemlerde bu tür etkileşimleri izlemek için doğru, hassas ve kolay ayarlanabilir Yöntemler gereklidir. Biz gerçek zamanlı yaşam hücrelerinde GPCR-β-tutucu etkileşimleri izlemek için yapısal bir uluslara tahlil göstermek, ve herhangi bir GPCR uzatılabilir.

İzleme GPCR-β-arrestin1/2 etkileşimleri gerçek zamanlı yaşam sistemleri Ilaç Discovery hızlandırmak için

Bu protokol, membran potansiyelindeki değişiklikleri ölçerek elektrojenik membran proteinlerinin incelenmesi için bir yöntem açıklamaktadır. Bu tahlil, epitel hücre hatlarında endojen olarak eksprese edilen çoklu iyon kanallarının fonksiyonel olarak okunması için bir platform sağlar.

İki Epitel Hücre Hattında İki Endojen İyon Kanalının Yüksek Verimli Fonksiyonel Çalışması için Membran Potansiyelinin Floresan Bazlı Bir Analizi

Bu çalışmada, rekombinant G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerindeki küçük molekül kütüphanelerini taramak için 384 kuyucuklu plakalar için yüksek verimli, hücre içi kalsiyum floresan testi açıklanmaktadır. Hedef, sığır ateşi kenesinden kinin reseptörü, Rhipicephalus microplus, CHO-K1 hücrelerinde eksprese edilir. Bu tahlil, aynı hücreleri tek bir "çift eklemeli" tahlilde kullanarak agonistleri ve antagonistleri tanımlar.

Rekombinant G Proteinine Bağlı Reseptörlerin Yüksek Verimli Taraması için "Çift İlaveli" Bir Kalsiyum Floresan Testi

Keşfedin GIRK kanal modülatörlerini floresan tarama testi ile farmakolojide. ATT20 hücreleri ve membran potansiyeli duyarlı boyalar kullanılarak yüksek verimli ilçe tarama yapılır.

GIRK Kanal Modülatörler belirlenmesi için Floresan Tarama Testi

Daha fazla video keşfet