GIRK Kanal Modülatörler belirlenmesi için Floresan Tarama Testi
24 Nisan 2012
G-protein bağımlı içe düzeltici K ile etkileşim ilaçların belirlenmesi için gerçek zamanlı tarama yöntemi + (GIRK) kanalları açıklanmıştır. Tahlil GIRK kanal aktivitesini ölçmek için membran potansiyeli duyarlı floresan boyalar kullanır. Bu teknik, hücre serileri bir dizi kullanım için uyarlanabilir.
Bu prosedürün genel amacı, grk kanallarını modüle eden yeni ilaçları tanımlamaktır. Bu, ilk olarak 96 oyuklu plakada A TT 20 hücrelerinin kaplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, Verset sıvı plaka işleme sistemini kullanarak test bileşiklerini seyreltmektir.
Daha sonra, seyreltilmiş test bileşikleri, verset kullanılarak hücrelere uygulanır. Son adım, 96 oyuklu plakayı Synergy iki floresan plaka okuyucusuna yerleştirmek ve kontrol ve somatostatin çözeltilerini kuyucuklara enjekte etmektir. Sonuç olarak, floresan plaka okuyucu, somatostatin kaynaklı floresan sinyalini değiştiren ve böylece Grk kanallarını modüle eden bileşikleri göstermek için kullanılır.
Bu prosedürün, yama kelepçesi kaydı gibi mevcut yöntemlere göre avantajı, çok sayıda bileşiğin, gerk kanallarını modüle edip etmediklerini belirlemek için hızlı bir şekilde taranabilmesidir. Bu tekniğin etkileri ağrının tedavisine kadar uzanır, çünkü FI nosiseptif iletiminin inhibisyonuna yol açan Gerk kanalını aktive eden bileşikler tanımlanabilir ve bu da kaplama prosedürünü gösterir. 96 kuyulu plakalar ve hücrelerin kaplanması Maribel Vasquez'dir.
Laboratuvarımdaki bir öğrenci Bu prosedüre, %5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde 37 santigrat derecede %10 at serumu ile desteklenmiş DMEM'deki hipofiz A TT 20 hücrelerini büyüterek başlayın. Standart bir izasyon prosedürü kullanarak hücreleri her beş ila yedi günde bir alt kültürleyerek kültürü koruyun. Sonra siyah açık kuyuları kaplayın.
Alt 96 oyuklu plaka, 50 mikrolitre poli L lizin ile. Kuyuların inkübatörde 30 dakika kurumasını bekleyin. Daha sonra, kuyucuk başına 30.000 hücre yoğunluğunda 200 mikrolitre ortam içeren 96 oyuklu plakadaki hücreleri fazla poli L lizin plakasını çıkarın.
Bundan sonra, hücreleri inkübatörde üç ila dört gün saklayın. Kültür ortamını hücre tek tabakasından yavaşça aspire etmek için bir aspirasyon kurulumu kullanın, ardından hücreleri 200 mikrolitre normal tampon çözeltisi ile yıkayın. Daha sonra, her birine membran potansiyeline duyarlı boya içeren 200 mikrolitre tampon çözeltisi ekleyin.
Hücreleri 37 santigrat derecede 40 dakika inkübe edin. 40 dakika sonra, A TT 20 hücrelerini inkübatörden çıkarın ve eski tampondan aspire ederek oda sıcaklığına dönmelerine izin verin. Daha sonra hücrelere MPD içeren taze tampon solüsyonu uygulayın.
Daha sonra, hücrelere test bileşiklerinin ve kontrol çözeltilerinin çeşitli konsantrasyonlarını uygulamak için sıvı işleme sistemini kullanın. 96 oyuklu plakada, hücreleri floresan ölçümlerine kadar test bileşikleri ile beş dakika inkübe edin. Bu prosedürde, 96 oyuklu plakayı bir biyoteknoloji sinerjisi iki floresan plaka okuyucusuna yerleştirin.
520 nanometre eksüdasyon dalga boyunda ve 560 nanometre görev dalga boyunda floresan arka plan sinyalini elde edin. Daha sonra, Synergy iki enjektör sistemini kullanarak GIR kanallarını etkinleştirmek için G PCR R ligandlarını veya kontrol solüsyonunu kuyucuklara uygulayın. Ardından, 302. örnekleme dönemi boyunca on saniyelik aralıklarla veri noktalarını toplayın.
Uyarma ve emisyon dalga boylarında. Testin güvenilirliğini belirlemek için Z faktörünü hesaplayın. 0.5 ila 1.0 aralığındaki Z. faktörleri, testin kalitesinin mükemmel olduğunu gösterir.
Z faktörü 0,5'in altında olan plakalar hariç tutulur. Analizden, floresan sinyali modüle eden bileşikler, içe doğru doğrultucu potasyum kanalı özgüllüğünü doğrulamak için iki milimolar baryum klorür veya 500 nano molar terapin Q varlığında yeniden test edilir, burada gösterilen temsili bir HLB 0 2 1 1 15 2 floresan sinyali, somatostatin veya kontrol çözeltisi ilavesiyle A TT 20 hücrelerinde zaman içinde ölçülür. Y eksenindeki floresan yoğunluğunun oranı, somatostatin veya kontrol çözeltisi varlığındaki sinyalin, somatostatin veya kontrol çözeltisi eklenmeden önce ölçülen temel sinyale bölünmesiyle hesaplandı.
Burada A TT 20 hücrelerinin 500 nano azı dişi ile tedavisi gösterilmektedir. Terapin Q, floresan sinyalindeki somatostatin aracılı azalmayı, iki tanesini bağlayarak ve G kanallarını bloke ederek inhibe eder. Ve burada A TT 20 hücrelerinin 20 mikromolar propafenon ile tedavisi gösterilmektedir, bu da floresan sinyalinde somatostatin aracılı azalmayı da inhibe eder Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki saat içinde yapılabilir.
Bu videoyu izledikten sonra, bir floresan plaka okuyucu kullanarak grk kanallarını modüle eden ilaçların nasıl tanımlanacağını iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, G proteini ile kapatan içe yönelik düzeltici K+ (GIRK) kanalları ile etkileşime giren ilaçları tanımlamak için gerçek zamanlı bir tarama prosedürünü açıklar. Test, zar potansiyeli duyarlı floresan boyaları kullanarak GIRK kanal aktivitesini ölçer ve bu sayede çeşitli hücre hatları için uyarlanabilir hale gelir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Farmakoloji
- Nörobilim
- Elektrofizyoloji
Arka Plan
- GIRK kanalları nöronal sinyallemede kritik bir rol oynar.
- GIRK kanal modülatörlerinin tanımlanması yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yol açabilir.
- Gerçek zamanlı testler, ilaç taraması verimliliğini artırır.
- Floresan boyalar, kanal aktivitesinin hassas bir şekilde ölçülmesini sağlar.
Çalışmanın Amacı
- GIRK kanallarını modüle eden ilaçları taramakta kullanılacak bir prosedür geliştirmek.
- Birden fazla bileşiği test etmek için yüksek verimli bir format kullanmak.
- GIRK kanal farmakolojisi hakkındaki anlayışımızı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- TT 20 hücrelerini 96 kuyulu bir plakaya yerleştirmek.
- Test bileşiklerini seyreltmek için Verset sıvı kullanım sistemini kullanmak.
- Verset ile seyreltilmiş bileşikleri hücrelere uygulamak.
- Yanıtları ölçmek için bir Synergy iki floresan plak okuyucusu kullanmak.
Ana Sonuçlar
- Somatostatinin indüklediği sinyalleri değiştiren bileşiklerin tanımlanması.
- Testin çeşitli hücre hatlarına uyarlanabilirliğinin gösterilmesi.
- Test edilen bileşiklerin GIRK kanal aktivitesini başarılı bir şekilde modüle etmesi.
- Floresan plak okuyucusunun taramada etkinliğinin doğrulanması.
Sonuçlar
- Geliştirilmiş test, GIRK kanallarını hedef alan ilaç keşfi için değerli bir araçtır.
- Gerçek zamanlı tarama, potansiyel terapötiklerin tanımlanmasını hızlandırabilir.
- Tanımlanmış bileşiklerin klinik önerilerini araştırmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This assay enables high-throughput identification of GIRK channel modulators, supporting target validation in neuroscience and cardiovascular drug discovery. By providing real-time, quantitative fluorescence readouts, it reduces reliance on low-throughput electrophysiology and accelerates hit-to-lead progression. The method enhances predictive confidence in early discovery by linking compound effects to functional channel activity in a physiologically relevant cellular context.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring functional GIRK channel modulation in response to GPCR ligands.
- Operational Value: Enables rapid screening of compound libraries to identify activators or inhibitors with mechanistic specificity.
- Predictive Value: Supports target de-risking by confirming on-target activity through fluorescence signal changes correlated with K+ efflux.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses membrane potential-sensitive dyes (DiBAC4(3) or HLB 021-152) to generate quantifiable, real-time signals upon GIRK activation.
- Reproducibility: Z-factor calculation (excellent range: 0.5–1.0) ensures assay robustness for hit selection and campaign reproducibility.
- Scalability: Compatible with 96-well format and liquid handling systems (e.g., Verset) for automated compound dispensing and screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Modulators identified may inform therapeutic strategies for neuropathic pain, addiction, and cardiac arrhythmias via GIRK-mediated neuronal inhibition.
- Translational Continuity: Fluorescent readouts provide a bridge from target engagement to functional output, supporting preclinical phenotype anchoring.
- Mechanistic De-risking: Specificity confirmed using inhibitors like barium chloride or Terapin Q to distinguish GIRK-mediated effects from off-target activity.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, enabling functional screening of GIRK modulators prior to downstream optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking GPCR activation to GIRK-dependent fluorescence changes, clarifying pathway modulation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized dye loading, compound application, and kinetic fluorescence measurement over 300 seconds.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (fluorescence intensity ratios) enabling comparison of compound potency and efficacy.
- Translational Research: Connects to preclinical work by identifying compounds that alter neuronal excitability via GIRK, relevant to pain and addiction models.
- Enterprise Reuse: Platform-adaptable across cell lines and GPCR ligands, promoting reuse across multiple target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target modulation by reducing mechanistic ambiguity in ion channel drug screening.
- Operational Value: Offers standardization, reproducibility, and real-time kinetic data unattainable with endpoint assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early functional validation, reducing late-stage failure risk due to lack of target engagement.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of compounds with confirmed GIRK activity for advancement to lead optimization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture (AT T20 cells), fluorescent dye handling, and kinetic plate reader operation.
- Dependent on fluorescence plate reader with injection capability (e.g., Synergy 2) and compatible excitation/emission settings (520 nm/560 nm).
- Necessitates standardization of dye loading, incubation times, and buffer conditions across wells and plates.
- Adaptation to other cell lines requires validation of GIRK expression and dye loading efficiency.
- Practical limitation: Assay specificity must be confirmed using orthogonal inhibitors (e.g., Ba2+, Terapin Q) to exclude non-GIRK-mediated fluorescence changes.
