Name: Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Öğrenin fare embriyonik fibroblast hücrelerini izole etme ve kültürleme yöntemini. Bu teknik, insan embriyonik ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerinin farklılaşmamış büyümesini desteklemek için temel besleyici katman hazırlamada kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

. 2007 Greber ark yayınlanan aktivin A ELISA protokolü kurmak için Dr Boris Greber özel teşekkürler. Biz grafik bakış hazırlanması için Bayan Monica Shevack özellikle müteşekkiriz. Biz çekimler öncesi ve sırasında her türlü yardımı ve değerli önerileri için Dr Heiko Fuchs için minnettarız. Biz MEFS ve CM sabit bir kaynağı korumak için Adjaye laboratuvar, özellikle Elisabeth Socha tüm üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Biz de onların sürekli destek için MPIMG bir hayvan tesis bünyesinde çalışan tüm arkadaşlarımız kabul ediyorsunuz. Bu çalışma kısmen Max Planck Topluluğu ve tarafından finanse edilmiştir [BMBF; hibe sayısı 0315717A], ERASysBio ortakları + AB 7.Çerçeve Programı&#39;na ERA-NET Plus, programı kapsamında desteklenen girişim.

1. Fare Embriyonik Fibroblastlar izolasyonu (MEFS) Aşağıdaki iki adım non-aseptik koşullar altında gerçekleştirilir. <ol><li> Servikal dislokasyon ile 13 veya 14 DPC (Günlük post-coitum) bir gebe fare (CF1, Harlan, ABD) Kurban. </li><li> Uterus boynuzu dışarı dissect, kısa bir süre Ca2 + Mg 2 olmaksızın PBS içeren bir Falcon tüpe 70% (v / v) etanol ve yerinde durulama + (Gibco, Invitrogen). </li></ol> Aşağıdaki adımları aseptik koşullarda bir doku kültürü kaputu yürütülen ve steril aletler kullanıyor. <ol start="3"><li> Petri içine laparotomi yerleştirin ve plasenta ve embriyo kesesi her embriyo ayırın. </li><li> Kafası ve kırmızı organları incelemek, PBS içinde yıkayın ve temiz bir petri tüm embriyolar yerleştirin. İnce bu Pipeti mümkün hale gelinceye kadar steril bir jilet kullanarak doku kıyma. </li><li> % 0.05 1 ml ilave edilir tripsin / EDTA (Gibco, Invitrogen), incluembriyo başına DNaz I (USB) ding 100 Kunitz birimleri. </li><li> Bir 50 ml Falcon tüpüne aktarılır ve doku 37 azından 15 dakika süreyle inkübe edilir ° C. Inkübasyon her 5 dakika sonra, iyice yukarı ve aşağı pipetleme hücreleri ayrışır. </li><li> Taze hazırlanmış MEF besiyeri yaklaşık 1 hacim ekleyerek tripsin inaktive. MEF kültür ortamı (bileşenler, medya, 500 ml oluşturan tüm bileşenler ve filtre karıştırmak için): 450 ml DMEM, FBS ve 50 ml (10% (v / v)), 200 mM L-glutamin (1/100 (v / v)) ve 5 ml penisilin-streptomisin 5 ml (1/100 (v / v)). </li><li> 5 dk, (300 xg) düşük hız ile hücreler santrifüj, dikkatle sıcak MEF orta süpernatan ve Pastör pipetiyle hücre pelletini kaldırın. </li><li> Levha yaklaşık 2 saat süreyle% 0.2 jelatin (büyükbaş hayvanların derilerinden, Tip B, Sigma jelatin) ile kaplanmış her T150 (TPP) şişeye 3-4 embriyo eşdeğer bir hücre sayısı. Fibroblastlar (P0, pasaj 0) jelatin kaplı matara eklemek için yeteneği var sadece hücrelerdir. </li&gt; <li> İdeal olarak, hücre 24 saat sonra% 80-90 konfluent olup, bu aşamada P0 hücrelerinin büyük bir kısmı gelecekteki kullanım için dondurulur. </li><li> P3 veya P4 kadar P0 hücrelerin kalan T150 balonuna (ler) genişletin, sonra inaktive ve besleyiciler hESC replate veya klimalı ortamda (CM) üretmek için kullanın. </li></ol> 2. Inaktivasyonu ve Kaplama MEFS (Besleyici Hücreler Hazırlık) Tüm adımları aseptik koşullarda bir doku kültürü kaputu yapılmaktadır. <ol><li> En az 2 saat oda sıcaklığında% 0.2 jelatin ve inkübe ile kaplamak T150 şişeler. </li><li> Mitomisin C PBS içerisinde (1 mg / ml) ve filtre ile seyreltilir. </li><li> MEFS medya aspire ve Ca 2 + Mg 2 + PBS ile yıkayın. </li><li> 10 mikrogram / MEFS üzerine mitomisin C ml içeren orta yeri 20 ml. </li><li> 37 2 saat boyunca inkübe ° orta içeren mitomisin C ile C PBS, trypsinize, santrifüj (300 xg&#39;de 5 dakika) ve sıcak ortamda Pastör pipetiyle hücreleri ile iki kez yıkayın. </li><li>56,000 hücre / T150 şişeler içerisinde cm 2 arasında bir yoğunlukta hücreleri ve plaka saymak ve aşağıdaki 6 gün boyunca CM üretimi için kullanımı. </li></ol> 3. Koşullu Orta (CM) hazırlanması Tüm adımları aseptik koşullarda bir doku kültürü kaputu yapılmaktadır. <ol><li> HESC ortamı (UM, doğuştan orta) (0.5 ml / cm 2) ile MEF orta yerine 56,000 hücre / cm 2 arasında bir yoğunlukta inaktive MEFS kaplama sonrası gün 4 ng / ml arasında FGF2 ile desteklenmiş taze. </li><li> 24 saat inkübasyondan sonra besleyici matara gelen CM toplayın ve 4 ng / fiderlere FGF2 ml içeren taze hESC orta ekleyin. </li><li> Gelecek 6 gün için bu yordamı yineleyin. Her gün mağaza -20 ° C&#39;de CM toplanan </li><li> 6 gün, orta ve filtre (Corning, 0.22 um, PAS) tüm alikotları karıştırın sonra. -80 Az 50 ml hacimde ve mağaza olun ° C </li><li> Matrigel yetişen hESC eklemeden önce ek 4 ng / ml FGF2 CM tamamlayın. &lt;/ Li&gt; </ol> 4. Koşullu ortam bir aktivin ölçümü (ELISA) 15 <ol><li> Tüm örnekler ve reaktifler oda sıcaklığına getirin. </li><li> Mikroplaka eklemek,% 1 BSA ile PBS (İnsan \ Fare \ Rat aktivin A MAb, R &amp; D Systems) antikor yakalamak (100 ul / kuyu) ve RT gece inkübe sulandırınız. </li><li> 24 saat blok (% 1 BSA / PBS, 300 ul / kuyucuk) oda sıcaklığında 1 saat daha sonra PBST (% 0.05 Tween 20 ile PBS) (de 300 ul /) ile üç kez kuyuları yıkayıp sonra. </li><li> Bu süre içinde bir aktivin A 7 dilüsyonları (30 ng / ml konsantrasyonu daha az) ve boş bir örnek de dahil olmak üzere (R &amp; D Systems) standart eğri, hazırlamak. Aktivin doğrusal çalışma aralığı 0.25 ile 32 ng / ml &#39;dir. </li><li> Kuyular (iyi 100 ul /) için standartlar ve örneklerin kopyası ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. </li><li> Kuyu üç kez (PBST 300 ul) yıkayın. </li><li> Ikincil (biyotin) antikoru (İnsan / Fare / Rat aktivin A MAb, R &amp; D Systems biyotinile) (0 ekleyin.25 ug / ml% 1 BSA / PBS) ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edilir. </li><li> Kuyu üç kez (PBST 300 ul) yıkayın, Streptavidin-HRP (% 1 BSA / PBS, R &amp; D Systems ile sulandırılmış) ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. </li><li> Kuyu üç kez (PBST 300 ul) yıkayın, substrat çözeltisi 100 ul (Quantikine, R &amp; D Systems) ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. </li><li> Her bir kuyuya durak çözüm 100 ul (Quantikine, R &amp; D Systems) ekleyin ve hafifçe karıştırın. </li><li> De her optik yoğunluğu belirlemek için 540 veya 570 nm dalga boyu düzeltmesi ile 450 nm Set Mikroplaka okuyucu (Molecular Devices Spectra Max 250, Global Tıbbi Cihazlar A.Ş., Minnesota),. </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Izolasyon prosedürü genel şeması Şekil 1&#39;de verilmiştir. HESC ve farklı koşullar altında kültüre hiPSCs tipik morfolojisi Şekil 2&#39;de sunulmuştur. Morfolojisi<html> MEFS ve CM hazırlamak için kullanılan inaktif besleyici hücreler Şekil 3&#39;te sunulmuştur. Genel olarak, hücreler 24 saat sonrası izolasyon konfluant ve dondurulmuş veya genişletilebilir hazır olmalıdır. Ancak, bazen bu birleşik kültürler almadan önce 2-3 gün sürebilir. CM pasaj 4 değil, daha az hücrelerden hazırlanır. Primer hücreler sadece yaşlılık başlangıcı önce 4-5 geçişleri için açılabilir, çünkü bu çok önemlidir. Sitokin, aktivin A, pluripotent hücreler 14 farklılaşmamış büyüme desteği için besleyici hücreler tarafından salgılanan en önemli faktör olarak kabul edilir. CM A aktivin düzeyinin ölçümü (Şekil 4) MEFS kalitesini izlemek için çok uygun bir kantitatif bir testtir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig1.jpg" /> Şekil 1. MEFS izolasyon prosedürü şematik gösterimi. ontent &quot;&gt; <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig2.jpg" /> Şekil 2,. (A) besleyici hücre, (B) şartlandırılmış orta ve (C) orta tanımlandığı varlığında kültüre andiferansiye hESC tipik morfolojisi. (D, E) besleyici hücre varlığında kültüre hiPSCs tipik morfolojisi. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig3.jpg" /> Şekil 3. Fare embriyonik fibroblast tipik morfolojisi (MEFS). (A) Passage 0 (P0) kaplama / izolasyon iki gün sonra, 56.000 hücre / cm yoğunluğu (B) inaktive besleyici tabaka. 2 <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig4.jpg" /> Şekil 4. Enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) tabanlı klimalı ortamda (CM) pr bir aktivin konsantrasyonu ölçümleriCF1 fare soyundan türetilmiş fare embriyonik fibroblastlar ile epared. CM 6 gün boyunca toplandı ve ardından birleştirilmiş edildi. CM &quot;1&quot; ve CM &quot;2&quot; medya ve şartsız medyaya UM farklı gruplar bakın. Conditioning işleminin fonksiyonu MEFS, aktivin tarafından aracı madde içine bir salgılama aktivin gibi bir UM hemen hemen mümkün değildir.

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Amit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonally+derived+human+embryonic+stem+cell+lines+maintain+pluripotency+and+proliferative+potential+for+prolonged+periods+of+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture.</a> Dev. Biol. 227, 271-278 (2000).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Ludwig, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+in+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nat. Biotechnol. 24, 185-187 (2006).</li>
<li>Yao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+self-renewal+and+directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+in+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Long-term self-renewal and directed differentiation of human embryonic stem cells in chemically defined conditions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6907-6912 (2006).</li>
<li>Lu, J., Hou, R., Booth, C. J., Yang, S. H., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+culture+conditions+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Defined culture conditions of human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 5688-5693 (2006).</li>
<li>Skottman, H., Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+conditions+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Culture conditions for human embryonic stem cells.</a> Reproduction. 132, 691-698 (2006).</li>
<li>Richards, M., Fong, C. Y., Chan, W. K., Wong, P. C., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+feeders+support+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+inner+cell+masses+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).</li>
<li>Richards, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+various+human+feeders+for+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 21, 546-556 (2003).</li>
<li>Amit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+feeder+layers+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Human feeder layers for human embryonic stem cells.</a> Biol. Reprod. 68, 2150-2156 (2003).</li>
<li>Inzunza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+in+serum+replacement+medium+using+postnatal+human+fibroblasts+as+feeder+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells.</a> Stem Cells. 23, 544-549 (2005).</li>
<li>Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+Human+Amniotic+Mesenchymal+Cells+as+Feeder+Layers+to+Sustain+Propagation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+in+the+Undifferentiated+State%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Utilization of Human Amniotic Mesenchymal Cells as Feeder Layers to Sustain Propagation of Human Embryonic Stem Cells in the Undifferentiated State.</a> Cell Reprogram. , (2011).</li>
<li>Eiselleova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+mouse+and+human+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells.</a> Int. J. Dev. Biol. 52, 353-363 (2008).</li>
<li>Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+2+modulates+transforming+growth+factor+beta+signaling+in+mouse+embryonic+fibroblasts+and+human+ESCs+%28hESCs%29+to+support+hESC+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 2 modulates transforming growth factor beta signaling in mouse embryonic fibroblasts and human ESCs (hESCs) to support hESC self-renewal.</a> Stem Cells. 25, 455-464 (2007).</li>
<li>Vallier, L., Alexander, M., Pedersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin%2FNodal+and+FGF+pathways+cooperate+to+maintain+pluripotency+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells.</a> J. Cell Sci. 118, 4495-4509 (2005).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan MEFS izolasyon prosedürü hESC ve hiPSCs için standart bir kültür durumun kurulmasını sağlar. Bundan başka besleyici hücreler tarafından sitokin üretimini değerlendirmek için kullanılmıştır ELISA bazlı sistemi MEF-türevi şartlandırılmış ortam kalitesi yararlı bir göstergesidir. Destekleyen fibroblastlar sağlayan fare suşu (CF1) rutin bakımı kültür ortamı toplu-seri varyasyonu önlemek için gereklidir. Dahası, aynı zamanda hücre tutarlıdır kalitesi elde etmek için çok sayıda farelerin embriyo izole edilmesi tavsiye edilir. Kesinlikle yeni ayrılmış MEFS P0 ve P1 dondurularak saklanabilir. Ayrıca inaktive MEFS hücre kültürü için gereksinimlerine bağlı olarak uygun miktarda hacimde donmuş muhafaza edilebilir. Genellikle yaklaşık 250.000 hücre kültürü hESC ve iPS hücreleri için 6-iyi plaka tek bir iyi kaplanmış olmalıdır. Kurulan ve optimize yöntemi rutin yönün arasındaki değişkenliği en aza indirmek için kullanılabilirdeneyler kira.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> DMEM (Yüksek Glukoz) </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 41966-052 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 25030-024 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin-streptomisin </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Vakum filtre sistemi </td><td> Corning </td><td> 431097 </td><td> 500 ml, 0.22 mikron, PAS </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Knockout DMEM </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 10829-018 </td><td></td></tr><tr><td> Knockout Serum Değiştirme </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td></td></tr><tr><td> Non-Essential Amino Asitler </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 11140-035 </td><td></td></tr><tr><td> beta-merkaptoetanol </td><td> Sigma </td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 14190-169 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> D4527 </td><td></td></tr><tr><td> Mitomisin C </td><td> Roche </td><td> 10107409001 </td><td></td></tr><tr><td> Bazik Fibroblast Büyüme Faktörü </td><td> PeproTech </td><td> 100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Tinile Anti-human/mouse/rat aktivin A Antikor </td><td> R &amp; D Systems </td><td> BAM3381 </td><td></td></tr><tr><td> Jelatin </td><td> Sigma </td><td> G9391 </td><td></td></tr><tr><td> / İnsan / FareSıçan aktivin A MAb </td><td> R &amp; D Systems </td><td> MAB3381 </td><td></td></tr><tr><td> % 0.05 tripsin-EDTA </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Ekstra İnce Iris Makas </td><td> FST </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Ekstra Güzel Graefe Forseps </td><td> FST </td><td> 11150-10 </td><td></td></tr><tr><td> Pierse Fiksasyon Forseps </td><td> FST </td><td> 18155-13 </td><td></td></tr></tbody></table>

kültürleme İnsan embriyonik ve bağlı pluripotent kök hücrelerinin için uygundur fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Genel olarak, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSCs) 1 değişken koşullarda yetiştirilebilir. Bununla birlikte, bu kültüre için etkili bir sistem oluşturmak için bu hücreler kolay değildir. Kültür koşullarında hESC ve hiPSCs yılında pluripotency bahşeder gen ekspresyonunu etkileyebilir yana, optimizasyon ve kültür yöntemi standardizasyon çok önemlidir. HESC hatlarının kurulması ilk besleyici hücreler ve fetal sığır serumu (FBS) içeren kültür ortamı 2 olarak MEFS kullanılarak tanımlanmıştır. Sonra, FBS hESC 3 çoğalmasını artıran nakavt serum replasmanı (KSR) ve FGF2, ile değiştirildi. Son olarak, besleyici içermeyen kültür sistemlerinde Matrigel kaplı plakalar üzerinde hücreleri kültür etkinleştirmek KSR içeren klimalı orta (orta MEFS koşullanmış) 4. Daha sonra, hESC kültür koşullarında kimyasal defin içinde besleyici-özgür kültür doğru ilerledik5-7 ed koşulları. Dahası, xeno içermeyen bileşenler kullanılarak patojenler ve hayvansal proteinler kültürü yöntemlerle potansiyeli kirlenmesini önlemek için 8 oluşturulmuştur. Iyileştirilmiş koşullar elde etmek için fare besleyici hücreler insan hücre hatları (örneğin fetal kas ve deri hücrelerinin 9, yetişkin deri hücrelerine 10, sünnet derisi fibroblast 11-12, amniyotik mezenkimal hücreler 13) ile değiştirildi. Ancak, insan sünnet derisi fibroblast kaynaklı besleyici katmanlar kullanarak farklılaşmamış hESC korumanın verimliliği A 14 aktivin salgısı alt düzeyde olması nedeniyle fare besleyici hücreler o kadar yüksek değildir. Açıkçası, fare ve insan besleyici hücreler tarafından büyüme faktörü üretimde belirgin bir fark vardır. Fare ve insan besleyici hücrelerin transcriptomes Analizleri ve destekleyici olmayan destekleyici hücreler arasında önemli farklılıklar saptandı. Eksojen FGF2 maintai için çok önemlidirhESC ve hiPSCs kendini yenileme ning ve Tgfβ1, aktivin A ve besleyici hücreler içinde Gremlin (BMP antagonisti) ifadesi düzenleyen önemli bir faktör olarak tespit edilmiştir. Aktivin A OCT4, SOX2 ve hESC 15-16 in NANOG ifadesi neden olduğu gösterilmiştir. Uzun süreli kültür için hESC ve hiPSCs kendi ayrışmamış durumunu korumak için mitotik inaktif MEFS veya Matrigel kaplı plakalar üzerinde MEF-CM (MEF-Şartlı Orta) olarak besleyici içermeyen koşullarda yetiştirilebilir. Doğrudan hESC büyümesini etkiler yana hem kültürü koşullarının başarısını tamamen besleyici hücre kalitesine bağlı olarak değişir. Burada, fare embriyonik fibroblast izolasyonu ve kültürü (MEFS) için optimize edilmiş bir yöntem, klimalı ortamda (CM) ve medyanın içindeki bir aktivin seviyelerini değerlendirmek için enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) hazırlanması sunuyoruz.

Fare embriyonik fibroblast (MEFS) kalitesi, CF-1 gibi farenin sağ suşu tarafından dikte edilir. Bu elde edilen Pluripotency destekleyici MEFS ve klimalı ortam (CM) işbirliği içinde kendini yenileyen ve pluripotency korumak için aktivin / Düğüm ve FGF yolları için gerekli aktivin A, Gremlin ve Tgfβ1 optimal konsantrasyonu içermelidir.

Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması

Genel olarak, insan embriyonik kök hücreleri (hESC'ler) ve insan uyarılmış pluripotent kök hücreleri (hiPSC'ler) değişken koşullar altında kültüre edilebilir. Ancak, bu...

Bu prosedürün genel amacı, insan embriyonik kök hücreleri ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin kültürü için uygun fare embriyonik fibroblastları hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle her bir embriyonun ayrılması ve baş ile kırmızı organların çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, doku küçük parçalara ayrılır ve sindirilir.Ardından hücreler, her flask başına üç ila dört embriyo olacak şekilde ekilir ve genişletilir. Son olarak, inaktive edilmiş mitler kondisyonlu ortam hazırlamak için kullanılır. Nihayetinde, pluripotent kök hücrelerin diferansiye olmamış büyümesini destekleyen kondisyonlu ortam içerisindeki aktif maddenin optimal konsantrasyonunu göstermek için e LSA kullanılır.Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşarlar; çünkü hem insan embriyonik kök hücrelerinin hem de indüklenmiş pluripotent kök hücrelerinin farklılaşmadan büyümesini sağlayacak yüksek kaliteli fare embriyo fibroblastları üretmek için prosedürün standardize edilmesi gerekir. Fare embriyosunun işlenmesi belirli manuel beceriler gerektirdiğinden, embriyo izolasyonu ve diseksiyon adımlarının öğrenilmesi zordur; bu nedenle yöntemin görsel uygulaması kritik öneme sahiptir. Prosedürü, laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan Dr. Justina Suk ve aynı zamanda lisansüstü öğrencisi olan Caterina Dres uygulamalı olarak gösterecektir.Çiftleşme sonrası 13 veya 14 günlük gebe bir fare sakrifiye edildikten ve uterin boynuzlar diseke edildikten sonra, doku kültürü kabininde aseptik koşullar altında bunları kısaca %70 etanol ile durulayın ve PBS içeren bir Falcon tüpüne yerleştirin. Uterin boynuzları bir Petri kabına koyun ve her bir embriyoyu plasentasından ve embriyonik kesesinden ayırın. Başı ve kırmızı organları çıkarın, kalan embriyo parçalarını PBS ile yıkayın ve steril bir jilet kullanarak temiz bir Petri kabına yerleştirin.Son olarak, pipetle alınabilecek kıvama gelene kadar dokuyu ince ince doğrayın. Ardından, %0,05 tripsin EDTA ve embriyo başına 100 K ünite DNase I ekleyin. Daha sonra dokuyu 50 ml'lik bir Falcon tüpüne aktarın ve 37 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.Her beş dakikalık inkübasyonun ardından, hücreleri iyice pipetleyerek birbirinden ayırın. Taze hazırlanmış meth.Medium'dan yaklaşık bir hacim ekleyerek tripsini inaktive edin. Hücreleri düşük hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve pelletini ılık meth ortamında yeniden süspande edin; %0,2 jelatin kaplı flasklar hazırlayın ve en az iki saat boyunca inkübe edin. Oda sıcaklığında, yaklaşık üç ila dört embriyodan elde edilen hücreleri her bir %0,2 jelatin kaplı flaska ekleyin. Jelatin kaplı flasklara tutunma yeteneğine sahip olan tek hücreler fibroblastlardır.Yaklaşık 24 saat sonra, hücreler %80 ila %90 konfluense ulaştığında, bazı hücreleri -80 °C'de dondurun. Gelecekteki kullanımlar için, kalan hücreleri P3 veya P4 pasajına kadar genişletin. P3 P4 hücreleri kullanarak besleyici hücreler hazırlamak için, T150 flaskları %0,2 jelatin ile kaplayarak başlayın ve oda sıcaklığında en az iki saat inkübe edin.Mitomisin C'yi PBS içinde seyreltin ve bir şırınga filtresinden süzün. Besiyerini methlerden aspire edin ve kalsiyum veya magnezyum içermeyen PBS ile yıkayın. Methlerin üzerine mililitre başına 10 mikrogram mitomisin C içeren 20 mililitre besiyeri ekleyin ve 37 derece Celsius'ta iki saat boyunca inkübe edin.Ardından, hücreleri iki kez PBS ile yıkayın ve tripsinizle işleyin. İnkübasyondan sonra hücreleri meth besiyerinde süspande edin, ardından hücreleri santrifüjle çöktürün ve ılık meth besiyerinde yeniden süspande edin. Hücresel yoğunluk santimetrekare başına 56.000 hücre olacak şekilde hücreleri T150 flasklara ekleyin ve meth hücrelerini ekledikten bir gün sonra gece boyunca inkübe edin.Kültür ortamını, taze 4 ng/mL FGF2 ile desteklenmiş HESC koşullandırılmamış ortamı ile değiştirin ve 37 °C'deki inkübatöre yerleştirin. 24 saat sonra, flasklardaki koşullandırılmış ortamı toplayın ve bunu taze HESC ortamı ile değiştirin. Toplanan ortamı -20 °C'de saklayın.Altıncı toplam toplamdan sonra toplama işlemini toplam altı gün boyunca tekrarlayın. Tüm besiyerini birleştirin ve süzün. Ardından, 50 milliliter'lik alikotlar halinde minus 80 degrees Celsius'ta saklayın.Kondisyonlu ortamdaki aktif a'yı ölçmek için tüm numuneleri ve reaktifleri oda sıcaklığına getirin. Aktif a antikorunu %1BSA içeren PBS ile seyreltin ve bir mikroplakanın kuyucuklarına 100 µL ekleyin. Oda sıcaklığında 24 saat boyunca inkübe edin.Kuyucukları üç kez PBST ile yıkayın. Ardından kuyucukları oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edin. Bu sırada, 0,25 ile 32 nanogram/ml arası bir çalışma aralığı kullanarak, yedi dilüsyon ve bir boş örnek içeren aktif bir standart eğri hazırlayın.Standartların ve örneklerin tekrarlarını kuyucuklara ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. Kuyucukları üç kez PBST ile yıkayın. Ardından, biyotinlenmiş bir sekonder antikor ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin.Ardından kuyucukları üç kez PBST ile yıkayın ve streptavidin HRP ekleyin. Karıştırdıktan ve substratı ekledikten sonra, ışık koruması için duvarları sarın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Her kuyucuğa 100 µL durdurma çözeltisi ekleyin ve nazikçe karıştırın.Son olarak, mikroplaka okuyucuyu 540 nm dalga boyu düzeltmesi ile 450 nm'ye veya 570 nm'ye ayarlayın ve gösterilen her bir kuyucuk için optik yoğunluğu belirleyin. Burada; besleyici hücrelerin varlığında, kondisyonlu ortamda ve tanımlanmış ortamda kültüre edilmiş diferansiye olmamış hESC'lerin tipik morfolojisi yer almaktadır. Bu örneklerde, HI PSC'ler besleyici hücrelerin varlığında kültüre edilmiştir.Bu görüntüler, kondisyonlu ortam hazırlamak için kullanılan mitlerin ve inaktive edilmiş besleyici hücrelerin morfolojisini göstermektedir. Genel olarak hücreler, izolasyondan 24 saat sonra konfluen hale gelmeli ve dondurulmaya veya genişletilmeye hazır olmalıdır. Ancak, konfluen kültürlerin elde edilmesi bazen iki ila üç gün sürebilir.Koşullandırılmış ortam, pasaj dörtteki hücrelerden hazırlanmalı ve daha geç bir aşamada hazırlanmamalıdır. Bu durum kritiktir çünkü primer hücreler, senesans başlamadan önce yalnızca dört ila beş pasaj boyunca genişletilebilir. a içindeki aktif sitokin, plüripotent hücrelerin diferansiye olmamış büyümesini desteklemek için feeder hücreleri tarafından salgılanan en kritik faktörlerden biri olarak kabul edilir.Burada gösterildiği gibi, kondisyonlu ortamdaki aktif seviyesinin ölçülmesi, metlerin kalitesini izlemek için uygun bir kantitatif analizdir. Uzmanlaşıldığında, fare embriyonik fibroblast izolasyonu, doğru şekilde gerçekleştirilirse bir ila iki saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, hayvanların önceden üretilmesinin ve tüm aletlerin önceden hazırlanıp otoklavlanmasının hatırlanması önemlidir.

preparation-mouse-embryonic-fibroblast-cells-suitable-for-culturing

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video fare embriyonik fibroblast (MEF) besleyici hücreler insan embriyonik kök hücreleri (hESC) nasıl büyümeye göstermektedir. Part 1 3.

MEFS I Matrigel: MEFS Durum Pasajlanması hESC

Bu çalışma detayları 3D fibrin hazırlanması kültür ve plutipotent kök hücrelerin ayrıştırılması için iskeleleri. Bu tür iskelesi sıra ilaç verme sistemleri içeren değiştirilmiş olarak kök hücre davranışı üzerindeki çeşitli biyolojik etkiler bileşiklerin taranması için kullanılabilir.

3D Fibrin hazırlanması Kök Hücre Kültürü Uygulamaları için iskeleleri

Geçiş kültürlere besleyici-özgür koşullarda devam eden çabalarına rağmen, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve türetme ve kültürü fare embriyonik besleyiciler (MEFS) ile işbirliği kültürler büyük oranda bağımlı kalır. Burada, biz hızla öncesi deneylere hESC kültürlerden besleyiciler kaldırmak için yeni bir metodoloji göstermektedir.

Yüksek Yoğunluklu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürleri gelen Rapid Fibroblast Kaldırma

Onlar pluripotency için standart testleri geçmek bile oluşturuluyor indüklenen pluripotent kök hücre (IPSC) hatları gelişim potansiyeli birbirinden farklı çizgiler üretir. Burada sahip tam olarak pluripotency IPSC hattı tanımlayan iPSCs, tamamen edilen fareler üretmek için bir protokol...

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

Burada tek bir lentiviral yeniden programlanması vektörü kullanılarak periferal kan 3-4 ml insan iPSCs üretimi için basit ve etkili bir protokol göstermektedir. Hazır kan hücrelerinin yeniden programlanması daha geniş bir araştırma toplum için erişilebilir kılarak IPSC teknoloji kullanımı hızlandırmak için vaat ediyor.

STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

Bu video, fare embriyonik kök hücrelerinden kortikal internöron öncüleri oluşturmak için bir yöntem sunar. Protokol, kök hücrelerin, kök hücre çoğalmasını ve embriyoid cisimlere (EB'ler) agregasyonunu kolaylaştıran spesifik küçük molekül inhibitörleri içeren ortamlarda kültürlenmesini gerektirir. Daha sonra, EB'ler enzimlerle ayrıştırılır ve kortikal internöron öncülerine farklılaşmalarını teşvik etmek için adezyon proteinleri ile kaplanmış kültür plakası kuyucukları üzerine kaplanır.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Kortikal İnternöron Öncüllerinin Üretilmesi

Burada, ayrışmış tek hücrelerin koloni dışı tip tek tabakalı (NCM) büyümesine dayanan insan pluripotent kök hücre (hPSC) kültür protokollerini sunuyoruz. Rho ile ilişkili kinaz inhibitörleri veya laminin izoform 521 (LN-521) kullanan bu yeni yöntem, büyük miktarlarda homojen hPSC'lerin üretilmesi, genetik manipülasyon ve ilaç keşfi için uygundur.

İnsan Pluripotent için alternatif Kültürleri Hücre Üretim, Bakım ve Genetik Analizi Kök

Burada, murin embriyonik fibroblastlarının, Tfap2c, Gata3, Eomes ve Ets2'nin on günlük aşırı ekspresyonu ile tamamen işlevsel ve stabil trofoblast kök hücrelerine doğrudan dönüştürülmesi için bir protokol sunuyoruz.

Trofoblast Kök Hücre içine Fare Embriyonik Fibroblastlar Doğrudan Dönüşüm Protokolü

Burada açıklanan protokol, minimal bir transkripsiyon faktörü setinin aşırı ekspresyonu yoluyla fare embriyonik fibroblastlarında bir hemojenik programın indüksiyonunu detaylandırır. Bu teknoloji, hematopoez, hematolojik hastalık ve hematopoietik kök hücre nakli ile ilgili gelecekteki çalışmalar için platformlar sağlamak üzere insan sistemine çevrilebilir.

Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

Bu protokol, serumdan türetilmiş fare embriyonik kök hücrelerin içinde (Mesc) -conditioned ortamı (Mesc-CM) için bir yöntem sağlar (fetal inek serumu, FBS) - ve besleyici (fare embriyonik fibroblastlar, MEF'ler) bir hücrenin içermeyen koşullar -ücretsiz yaklaşım. Bu yaşlanma ve yaşlanma ile ilişkili hastalıkların tedavisi için uygun olabilir.

Serum- toplanması ve Besleyici serbest Fare Embriyonik Hücre içermeyen Yaklaşım Hücre klimalı Orta Kök

Bu makalede, verimli bir şekilde elde ve pluripotent kök hücre satırlarından fare embriyoların blastosist aşamasında kültür için bir protokol.

Fare Preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarından türetme

Öğrenin fare embriyonik fibroblast hücrelerini izole etme ve kültürleme yöntemini. Bu teknik, insan embriyonik ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerinin farklılaşmamış büyümesini desteklemek için temel besleyici katman hazırlamada kullanılır.

Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması (Video) | JoVE Journal

Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması

Daha fazla video keşfet