Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması

Bu prosedürün genel amacı, insan embriyonik kök hücreleri ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin kültürü için uygun fare embriyonik fibroblastları hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle her bir embriyonun ayrılması ve baş ile kırmızı organların çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, doku küçük parçalara ayrılır ve sindirilir.

Ardından hücreler, her flask başına üç ila dört embriyo olacak şekilde ekilir ve genişletilir. Son olarak, inaktive edilmiş mitler kondisyonlu ortam hazırlamak için kullanılır. Nihayetinde, pluripotent kök hücrelerin diferansiye olmamış büyümesini destekleyen kondisyonlu ortam içerisindeki aktif maddenin optimal konsantrasyonunu göstermek için e LSA kullanılır.

Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşarlar; çünkü hem insan embriyonik kök hücrelerinin hem de indüklenmiş pluripotent kök hücrelerinin farklılaşmadan büyümesini sağlayacak yüksek kaliteli fare embriyo fibroblastları üretmek için prosedürün standardize edilmesi gerekir. Fare embriyosunun işlenmesi belirli manuel beceriler gerektirdiğinden, embriyo izolasyonu ve diseksiyon adımlarının öğrenilmesi zordur; bu nedenle yöntemin görsel uygulaması kritik öneme sahiptir. Prosedürü, laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan Dr. Justina Suk ve aynı zamanda lisansüstü öğrencisi olan Caterina Dres uygulamalı olarak gösterecektir.

Çiftleşme sonrası 13 veya 14 günlük gebe bir fare sakrifiye edildikten ve uterin boynuzlar diseke edildikten sonra, doku kültürü kabininde aseptik koşullar altında bunları kısaca %70 etanol ile durulayın ve PBS içeren bir Falcon tüpüne yerleştirin. Uterin boynuzları bir Petri kabına koyun ve her bir embriyoyu plasentasından ve embriyonik kesesinden ayırın. Başı ve kırmızı organları çıkarın, kalan embriyo parçalarını PBS ile yıkayın ve steril bir jilet kullanarak temiz bir Petri kabına yerleştirin.

Son olarak, pipetle alınabilecek kıvama gelene kadar dokuyu ince ince doğrayın. Ardından, %0,05 tripsin EDTA ve embriyo başına 100 K ünite DNase I ekleyin. Daha sonra dokuyu 50 ml'lik bir Falcon tüpüne aktarın ve 37 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.

Her beş dakikalık inkübasyonun ardından, hücreleri iyice pipetleyerek birbirinden ayırın. Taze hazırlanmış meth.Medium'dan yaklaşık bir hacim ekleyerek tripsini inaktive edin. Hücreleri düşük hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve pelletini ılık meth ortamında yeniden süspande edin; %0,2 jelatin kaplı flasklar hazırlayın ve en az iki saat boyunca inkübe edin. Oda sıcaklığında, yaklaşık üç ila dört embriyodan elde edilen hücreleri her bir %0,2 jelatin kaplı flaska ekleyin. Jelatin kaplı flasklara tutunma yeteneğine sahip olan tek hücreler fibroblastlardır.

Yaklaşık 24 saat sonra, hücreler %80 ila %90 konfluense ulaştığında, bazı hücreleri -80 °C'de dondurun. Gelecekteki kullanımlar için, kalan hücreleri P3 veya P4 pasajına kadar genişletin. P3 P4 hücreleri kullanarak besleyici hücreler hazırlamak için, T150 flaskları %0,2 jelatin ile kaplayarak başlayın ve oda sıcaklığında en az iki saat inkübe edin.

Mitomisin C'yi PBS içinde seyreltin ve bir şırınga filtresinden süzün. Besiyerini methlerden aspire edin ve kalsiyum veya magnezyum içermeyen PBS ile yıkayın. Methlerin üzerine mililitre başına 10 mikrogram mitomisin C içeren 20 mililitre besiyeri ekleyin ve 37 derece Celsius'ta iki saat boyunca inkübe edin.

Ardından, hücreleri iki kez PBS ile yıkayın ve tripsinizle işleyin. İnkübasyondan sonra hücreleri meth besiyerinde süspande edin, ardından hücreleri santrifüjle çöktürün ve ılık meth besiyerinde yeniden süspande edin. Hücresel yoğunluk santimetrekare başına 56.000 hücre olacak şekilde hücreleri T150 flasklara ekleyin ve meth hücrelerini ekledikten bir gün sonra gece boyunca inkübe edin.

Kültür ortamını, taze 4 ng/mL FGF2 ile desteklenmiş HESC koşullandırılmamış ortamı ile değiştirin ve 37 °C'deki inkübatöre yerleştirin. 24 saat sonra, flasklardaki koşullandırılmış ortamı toplayın ve bunu taze HESC ortamı ile değiştirin. Toplanan ortamı -20 °C'de saklayın.

Altıncı toplam toplamdan sonra toplama işlemini toplam altı gün boyunca tekrarlayın. Tüm besiyerini birleştirin ve süzün. Ardından, 50 milliliter'lik alikotlar halinde minus 80 degrees Celsius'ta saklayın.

Kondisyonlu ortamdaki aktif a'yı ölçmek için tüm numuneleri ve reaktifleri oda sıcaklığına getirin. Aktif a antikorunu %1BSA içeren PBS ile seyreltin ve bir mikroplakanın kuyucuklarına 100 µL ekleyin. Oda sıcaklığında 24 saat boyunca inkübe edin.

Kuyucukları üç kez PBST ile yıkayın. Ardından kuyucukları oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edin. Bu sırada, 0,25 ile 32 nanogram/ml arası bir çalışma aralığı kullanarak, yedi dilüsyon ve bir boş örnek içeren aktif bir standart eğri hazırlayın.

Standartların ve örneklerin tekrarlarını kuyucuklara ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. Kuyucukları üç kez PBST ile yıkayın. Ardından, biyotinlenmiş bir sekonder antikor ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin.

Ardından kuyucukları üç kez PBST ile yıkayın ve streptavidin HRP ekleyin. Karıştırdıktan ve substratı ekledikten sonra, ışık koruması için duvarları sarın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Her kuyucuğa 100 µL durdurma çözeltisi ekleyin ve nazikçe karıştırın.

Son olarak, mikroplaka okuyucuyu 540 nm dalga boyu düzeltmesi ile 450 nm'ye veya 570 nm'ye ayarlayın ve gösterilen her bir kuyucuk için optik yoğunluğu belirleyin. Burada; besleyici hücrelerin varlığında, kondisyonlu ortamda ve tanımlanmış ortamda kültüre edilmiş diferansiye olmamış hESC'lerin tipik morfolojisi yer almaktadır. Bu örneklerde, HI PSC'ler besleyici hücrelerin varlığında kültüre edilmiştir.

Bu görüntüler, kondisyonlu ortam hazırlamak için kullanılan mitlerin ve inaktive edilmiş besleyici hücrelerin morfolojisini göstermektedir. Genel olarak hücreler, izolasyondan 24 saat sonra konfluen hale gelmeli ve dondurulmaya veya genişletilmeye hazır olmalıdır. Ancak, konfluen kültürlerin elde edilmesi bazen iki ila üç gün sürebilir.

Koşullandırılmış ortam, pasaj dörtteki hücrelerden hazırlanmalı ve daha geç bir aşamada hazırlanmamalıdır. Bu durum kritiktir çünkü primer hücreler, senesans başlamadan önce yalnızca dört ila beş pasaj boyunca genişletilebilir. a içindeki aktif sitokin, plüripotent hücrelerin diferansiye olmamış büyümesini desteklemek için feeder hücreleri tarafından salgılanan en kritik faktörlerden biri olarak kabul edilir.

Burada gösterildiği gibi, kondisyonlu ortamdaki aktif seviyesinin ölçülmesi, metlerin kalitesini izlemek için uygun bir kantitatif analizdir. Uzmanlaşıldığında, fare embriyonik fibroblast izolasyonu, doğru şekilde gerçekleştirilirse bir ila iki saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, hayvanların önceden üretilmesinin ve tüm aletlerin önceden hazırlanıp otoklavlanmasının hatırlanması önemlidir.