Name: Yılında Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü Protein İfadesi ve Arıtma Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Keşfedin, kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatörü proteininin Saccharomyces cerevisiae'de miligram düzeyinde ifadesi ve arıtılması için GFP etiketli yöntem. Bu teknik, ilaç tarama ve yapısal çalışmalar için temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz, CFTR 3D-Yapı Konsorsiyumu (hibe sayısı FORD08XX0) aracılığıyla bu iş için fon Kistik Fibrozis Vakfı (CFF) teşekkür ederim. Biz CFTR gen tasarım, özellikle bu iş için Konsorsiyum içinde tüm meslektaşlarımızın büyük katkılarından dolayı teşekkür. Ayrıca Drs çok değerli katkılarından dolayı. James Birtley (NCSR Demokritos, Yunanistan), Mark Genç (Cardiff Üniversitesi, Birleşik Krallık) ve David Drew (Imperial College, Londra, Birleşik Krallık) çalışmalarının ilk aşamalarında. Özellikle yazının eleştirel okuma Dr Ina Urbatsch (Texas Tech. Üniversitesi, Lubbock) teşekkür ederim.

1. Medya ve Tamponlar hazırlanması <ol><li> YNB: Bir litre, 1 litre suda urasil olmadan amino asit ve 0.77 g eksiksiz karışımı takviyesi olmadan 6,9 g maya nitrojen baz askıya. Otoklavlayın. 4 ° C&#39;de depolamak </li><li> YNBA: 400 ml için, amino asitler olmadan 2.76 gr maya nitrojen baz askıya alma, 350 ml su içinde urasil ve 8g bakteriyolojik agar olmadan 0.38 g tam ek karışımı. Otoklavlayın. Eriyene kadar yavaşça 50 ml su ve ısı ile 8 g glukoz karıştırın. 0.2 um bir filtre ile sterilize ve agar erimiş olduğunu iken YNBA eklemek. Oda sıcaklığında saklayın. </li><li> % 20 glukoz orta: eriyene kadar 500 ml, 500 ml yavaşça YNB ve ısı ile 100 gr şekeri karıştırın. Steril bir şişeye Duran 0.2 um bir filtreden geçirilir. Oda sıcaklığında saklayın. </li><li> % 20 galaktoz orta: eriyene kadar 2 litre su için, hafifçe 2l YNB ve ısı ile 400 g galaktoz karıştırın. Steril bir şişeye Duran 0.2 um bir filtreden geçirilir. Oda sıcaklığında saklayınızbelgelendiğinden. </li><li> Proteaz inhibitörü stokları: CFTR proteoliz 4 derece hassastır. Yazarlar okuyucuların kendi ihtiyaçlarını karşılamak için özel bu listeyi isteyebilirsiniz olsa takip inhibitörleri, proteoliz sınırlandırılmasında etkili olduğu bulundu. Dondurma-eritme problemleri azaltmak için -20 ° C &#39;de 100 ul hacimde saklanmalıdır. Tüm inhibitörleri stok çözümleri aşağıdaki gibi çalışma konsantrasyonuna dilüe edilmelidir: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Önleyici </td><td> Stok Konsantrasyon </td><td> Hamur Hazırlama </td><td> Çalışma Konsantrasyon </td></tr><tr><td> AEBSF </td><td> 200 mM </td><td> 1 ml distile su içinde eritilir 48mg </td><td> 0.2 mM </td></tr><tr><td> Benzamidin </td><td> 300 mM </td><td> 1 ml distile su içinde eritilir 36mg </td><td> 0.3 mM </td></tr><tr><td> Kimostatin </td><td> 4 mM </td><td> 1ml kuru DM 2.5mg eritilirSO </td><td> 4 uM </td></tr><tr><td> D-64 </td><td> 7 mM </td><td> 1 ml distile su içinde eritilir 2.5mg </td><td> 7 mcM </td></tr><tr><td> Löpeptin </td><td> 20 mM </td><td> 1 ml distile su içinde eritilir 10mg </td><td> 20 uM </td></tr><tr><td> Pepstatin A </td><td> 15 mM </td><td> 1 ml kuru DMSO 10mg eritilir </td><td> 15 uM </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 1 M </td><td> 1 ml kuru DMSO 174mg eritilir </td><td> 1 mM </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> DTT (1 M): 1 ml damıtılmış su içinde 154 mg ditiyotretol eritilir. -20 ° C de saklayınız Tamponlarda 1:1000 dilüsyon kullanın belirtti. </li><li> EDTA (0.5 M): 100 ml su ile Karışım 29,22 g etilendiamintetraasetik asit. EDTA her çözülmüş ve pH 8 olana kadar 10 N NaOH çözeltisi damla damla ilave edin. Su ile 200 ml Makyaj ve steril Duran şişeye filtre 0.2 mikron geçer. Oda sıcaklığında saklayın. </li><li> CRB (300 mM Tris-HCl,pH 7.4, 0.56 M sorbitol, 1 mM EDTA): 350 ml su içinde 18.17 g Tris-bazlı bir eritilir ve HCI eklenerek pH 7.4 &#39;e ayarlanır. Sorbitol 51.35 g ekleyin ve su ile 500 ml birimi oluşturacak. Otoklavlayın. 4 az 1 ml EDTA stok solüsyonu ve mağaza ° C ekle </li><li> CFTR tamponu (50 mM Tris, pH 8.0,% 10 v / v gliserol): 500 ml su içinde 6.06 g Tris-bazlı bir eritilir. HCI ile pH 8&#39;e ayarlamak, 100 ml gliserol ekleyin ve su ile 1 L tamamlanır. 4 ° C&#39;de otoklav ve mağaza </li><li> 50 mM Tris-HCl (pH 7.6),% 5 gliserol, 5 mM EDTA (pH 8.0),% 0.02 Bromofenol mavisi, 4% SDS, 0.05 M DTT: yük boya 2x. -20 ° C&#39;de 10 mL, tablet ve saklamak hale </li></ol> 2. Eleme Transformatlar Bu protokol CFTR-GFP-8His füzyon geni bir GAL1 galaktoz organizatörü (Şekil 1) bir maya plazmid aşağı içine ve bu sokulduğu varsayar plazmid FGY217 hücreleri S. cerevisiae 10 mutant bir Pep4 silme dönüşmüştür </em&gt;. Hücreler YNBA plakalar üzerinde büyüdü ve 4 ° C&#39;de birkaç hafta saklanabilir Daha uzun süreli saklama için, gliserol stokları yapılmalı ve -80 ° C&#39;de C. Klonlanması ve dönüşümü için yöntemleri Drew ve ark. (2008) 10 ile detaylı olarak tarif edilmektedir. <ol><li> Bir dönüşüm plaka 5-10 iyi ayrılmış koloniler seçin. % 20 glükoz orta 9 ml YNB ve 1 ml içeren ayrı bir steril 50 ml Falcon tüp için her bir koloni transfer edin. Bu aşama için, hücre büyümesi korumak için kültürü içinde% 2 glükoz (w / v) bir son konsantrasyon elde edilmesi önemlidir. Orbital çalkalama inkübatöründe 30 ° C&#39;de, 250 rpm&#39;de 16 saat gece boyunca büyür. </li><li> Koloniden her biri için gliserol stokları edin. Aseptik olarak etiketlenmiş vida-üst flakonlarda 0.2 ml steril gliserol, -80 de vorteks kısaca ve mağaza ° C&#39;ye gecede kültürlerin 0.8 mL </li><li> % 20 glükoz besiyeri içeren 250 ul YNB içinde 50 ml nihai hacme kadar, geri kalan bir gece boyunca kültürler, seyreltilir.Yüksek glukoz GAL1 organizatörü 10 bastırmak çünkü bu adım için, bu kültür yaklaşık% 0.1 (w / w) için glukoz konsantrasyonu sulandırmak için önemlidir. Etiketli 250 ml Erlenmeyer kültürler büyümeye 250 rpm, orbital çalkalama inkübatör 30 ° C&#39;de 0,7-0,8 bir OD 600 matara şaşırttı. </li><li> Her bir şişeye 5 ml% 20 galaktoz ortamı eklenerek kültürler indüklemek ve 16 saat boyunca üzerinde yetişebilir. </li><li> Floresan mikroskobu kullanarak CFTR ifade onaylayın. Kültürünün 100 ul alın ve çözüm hücre hareketliliği sınırlamak için 100 ul gliserol ekleyin. Bir FITC filtresi (490 nm ve 528-538 nm dalga boyunda emisyon dalgaboyu) altında bir mavi lazer kullanarak Delta Vizyon RT restorasyon mikroskobu (veya benzeri) üzerine hücreler, analiz edin. CFTR-GFP füzyon proteininin ifadesi pozitif maya hücrelerinin plazma membranında floresans bir halka olarak görülmelidir. Setinde maya hücreleri, bir kontrol olarak kullanılabilir. </li><li> Aktarın50ml Falcon tüpler içine kültürleri. Bir tezgah üstü santrifüj içinde 10 dakika boyunca 3500 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de santrifüje edilerek hücreler hasat. Santrifüj çalışıyor iken, buz üzerinde yaklaşık 500 ul asitle yıkanmış cam boncuk ve yeri içeren vida üstleri ile 2 ml mikrofuge&#39;de tüpler hazırlamak. Süpernatantlar atın ve 500-800 ul buz KİB her pelletini ile proteaz inhibitörleri. Boncuklar içeren mikrofuge&#39;de tüplere süspansiyonlar aktarın ve buz üzerinde tutun. </li><li> Şiddetle dönemleri arasında buz üzerine oturtulmuş, 30 saniye 10 dönem boyunca sallayarak / Her mikrofuge&#39;de tüp vortekslendi tarafından akyuvarlar. Bir beadbeater alternatif olarak istihdam edilebilirler, 3 dakika boyunca işletilen bir BioSpec Mini beadbeater örneğin. </li><li> 5 dakika boyunca 3500 x g&#39;de, 4 ° C de, bir tezgah üstü mikrofuj ve santrifüj tüpü içine yerleştirin. Buz üzerinde mikrofuge&#39;de tüpleri ve yer temizlemek için ham membran nüfus içeren süpernatantlar aktarın. 500 ul taze buz-co ekleld CRB Her tüpe proteaz inhibitörleri ve membranlar birikir işlemi tekrarlayın. </li><li> 2 saat boyunca, bir tezgah üstü mikrofuj maksimum hızı, 4 ° C de iplik ile ham membranları Collect. Süpernatant atın ve 50 ul buz CFTR tampon her pelletini. </li><li> Temiz mikrofuge&#39;de tüplerde, aşağı yukarı pipetleme ve 15 ul 2x yük boya ile her süspansiyon 15 ul karıştırın. Bir 10 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. Bu SDS-çözünmez agregatlar oluşturması ve aynı zamanda GFP etiketi bozabileceğinden için CFTR ve diğer membran proteinleri neden olacağından, örnekler kaynatmayın. </li><li> 4-20% Tris / glisin gradient jel (NuSep) üzerine PageRuler Artı prestained protein standardı (Fermentas) ile birlikte numuneleri yükleyin ve 40 dakika için 150 V kadar veya boya ön jel dibinde çalıştırın. </li><li> In-jel floresan yüksek salgılayan hücrelerin tanımlayın. Böyle bir Typhoon tarayıcı olarak bir floresan görüntüleme sistemi içine yerleştirin. Jel u tara488 nm dalgaboyu, mavi lazer ve 526 nm emisyon dalga boyu şarkı. CFTR-GFP füzyon yaklaşık 220 kDa görünür olmalıdır. Ayrıca muhtemelen içsel bir maya FAD içeren membran proteini 11,12 (örneğin süksinat dehidrogenaz altbirim A as) yaklaşık 70 kDa görünür zayıf bir floresan bandı olacaktır. </li><li> Uygun bir resim görüntüleme yazılımı paketi kullanılarak floresans tarama ile karşılaştırma yapmak için jel destain ve tarama, Coomassie ile jel Leke. Coomassie lekeli jel jeli, her parça üzerine yüklenen toplam protein miktarı için normalizasyon sonra farklı klonal hatları CFTR-GFP tanımı seviyeleri göreceli bir değerlendirmenin sağlar. </li><li> Taze bir YNBA üstünde onun gliserol stok (2.2) yüksek eksprese eden hücre hat çıkışı Streak 2-3 gün süreyle 30 ° C&#39;de inkübe ve plaka. Bu plaka daha sonra 4 ° C&#39;de 2 hafta için kadar saklanabilir </li></ol> 3. Büyük ölçekli Fermentör Culture <ol><li> Fermentör için ön-kültür hazırlayın. YNBA bir hücre 1cm 2 alana Sıyırmak plakası (2,13) ​​steril bir döngü kullanılarak ve 45 ml YNB ve 5 ml% 20 glükoz orta OD 600 yaklaşık 0.1 olduğu gibi ekleyin. OD 600 1 ulaşıncaya kadar orbital çalkalama inkübatörde 250 rpm, 30 ° C&#39;de 250 ml Erlenmeyer şaşkın şişeler büyür. </li><li> Baffled iki 2 l Erlenmeyer arasında bölünür, her kültürü içeren 450 ml&#39;lik YNB ve 25 ml% 20 glükoz, orta şişeler. 250 rpm, orbital çalkalama inkübatör 30 ° C OD 600 1.2 ulaşıncaya kadar da bu büyümeye. </li><li> Bu ön kültürler büyüyor olsa da, fermentör kurdu. 1,1 olarak tarif YNB arasında 11.2l hale, fakat ek bir 8.28 g YNB ve indüksiyon azından gliserol ilave telafi etmek için ek dışarı 0.95 g damla çözülür. Aseptik olarak steril bir 20l fermentör gemi için 11.2 l YNB ve 75 ml% 20 glukoz orta eklemek ve çalışan sıcaklığını ayarlamak30 ° C. </li><li> Aseptik fermentasyon precultures ekleyin ve karıştırarak hızını yaklaşık 800 rpm ve 30 ° C sıcaklıkta muhafaza Basınçlı hava yaklaşık 15 dm 3 dk -1 akmalıdır. Fermentör kültürü 1.2 bir OD 600 ulaştığında, neden aseptik olarak 1,5 l YNB% 20 galaktoz solüsyon ve 1.2 l gliserol ekleyerek. 25 ° C sıcaklıkta azaltmak ve 16 saat boyunca kültürün büyür. </li><li> Bir peristaltik pompa kullanılarak buz üzerinde soğutulmuş 1l santrifüj kapları içine fermentör aktarın. Büyük bir kapasite rotor (ör. 6 litre) içinde 30 dakika boyunca 3500 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de santrifüje edilerek hücreler hasat. Proteaz inhibitörleri ile 150 ml buzlu soğuk CRB içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Burada itibaren, tüm iş 4 ° C de yapılmalıdır </li><li> Her iki durumda da buz üzerinde lizat toplanması, 25, 30, 32 ve 35 kPa&#39;dan az 4 geçer bir sabit Systems hücre bozucu geçerek hücreleri Lyse. Alternatif olarak, bir boncuk Beate kullanımıasitle yıkanmış 0.5 mm cam boncuklar eşit hacmi ile r (Biospec) ve tam güç ile 3 dakika için ajitasyon. 3500 xg, bir tezgah üstü santrifüj içinde 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüje edilerek 50ml Falcon tüpler ve pellet hücre enkazları için lizat transfer edin. </li><li> Soğutulmuş santrifüj tüplerine süpernatant aktarın. Mitokondri kaldırmak için bir santrifüj içinde 30 dakika süreyle 14,000 xg, 4 ° C&#39;de santrifüje. </li><li> Soğutulmuş ultrasantrifüjdeki tüplere süpernatant aktarın. Mikrozomlan toplamak için bir ultrasantrifüjdeki 90 dakika boyunca 200,000 xg, 4 ° C&#39;de santrifüje. </li><li> Dikkatle boşaltmak ve supernatant atmak ve her tüpe proteaz inhibitörleri ve 1 mM DTT ile 2ml buz CFTR tamponu ekleyin. Yavaşça bir girdap mikser kullanarak CFTR tampon ve karışımı ile her tüpe kadar üst bir fırça kullanarak pelet yeniden süspanse. </li><li> Bir ultrasantrifüjdeki 60 dakika boyunca 200,000 xg, 4 ° C&#39;de santrifüje süspansiyon, 2 ml buzda soğutulmuş tampon CFTR w süpernatan ve Pastör pipetiyle peletler atmakITH proteaz inhibitörleri Bir fırça kullanarak (hiçbir DTT). </li><li> Havuz süspanse mikrozomları, CFTR tamponu ile 50 ml&#39;ye son ses seviyesini ayarlamak ve iyice karıştırın. Rezerv olarak 2,9 tarif SDS-PAGE jeli analizi için bir 1 ml bir örnek, - 2.11. Mikrozomları şimdi flaş sıvı nitrojen içinde dondurulmuş olması ve sonra gerektiği kadar -80 ° C&#39;de muhafaza edebilirsiniz. </li><li> Lityum perfluorooctonoate asit (LiPFO), tetradecanoly-lyso-phosphatidylglycerol (LPG14), n-dodesil-β-D-maltoside (DDM): CFTR Aşağıdaki deterjan biri kullanılarak mikrozomlan elde edilebilir. CFTR tamponu, proteaz inhibitörleri ve% 5 deterjan (w / w) ile mikrozomlan karıştırılır. DDM kullanılması durumunda, aynı zamanda tampon NaCl 300 mM ekleyebilir. Bir tüp döndürücü üzerinde 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;de çalkalayın. </li><li> Bir ultrasantrifüjdeki 1 saat için 100,000 xg, 4 ° C&#39;de santrifüje örnekleri. Süpernatan korumak ve SDS-PAGE jeli analizi için, küçük bir alikotu alır. CFTR artık immobilize metal solublised malzemeden saflandırılabilirafinite kromatografisi boyut harici kromatografi ile izledi. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar CFTR içeren plazmid ile maya Dönüşüm% 100 verimli değildir. Bir dönüşüm deney seçilen koloniler CFTR ifade temsilcisi küçük ölçekli ekran proteini ifade 4 koloni yaklaşık 1 verecektir. Bir tabaktan aldı 5 koloni bir ekran tipik bir sonucu A Şekil panelinde gösterilir. 3. Koloniler biri tipik olarak gösterildiği gibi, 250 kDa ve 130 kDa belirteçler arasında çalışan CFTR-GFP füzyon proteininin ifadesi bir kuvvetli seviyesini göstermektedir. CFTR-GFP floresans seviyeleri Şekil koloni 4, deneyler arasında önemli farklılıklar olacaktır. Hakkında 70kDa de içsel floresan grubundan çok 3 gösteren en az 10 kat daha fazla floresans. CFTR-GFP ifade seviyeleri 70 kDa bandı daha az floresans vermek görünüyorsa, o zaman muhtemelen yeniden dönüşüm ve bir koloni seçerken değerCFTR-GFP tanımının yüksek seviyeleri ile. Şek. 3A, bu CFTR-GFP grubu Coomassie boyama ile hücre özütü olarak ayırt olacağı, hatta CFTR-GFP yüksek bir seviyede ifade ile, pek mümkün değildir. Şekil olarak Seçildikten sonra koloniler, mikrozomları içinde CFTR-GFP varlığının değerlendirilmesi gerekir, izole mikrozomları daha büyük ölçekli deneyler yetişen ve edilmiştir. 3B. Bu deneyin sonuçları mikrozomlan dikkatli bir şekilde hazırlanmış ve bu proteoliz en aza indirgenmiştir olmadığını kontrol etmek için önemlidir, sadece ifade indüksiyon etkinliğini değerlendirmek için, hem de vardır. Sonuçlar Şek. 3B Bu deneyde CFTR-GFP Ancak bu izlenim bu floresans dedektör aşırı maruz tarafından önyargılı paneli A. gösterilen küçük ölçekli deneme daha (as içsel 70kDa bant göre değerlendirilecektir) biraz daha düşük olduğunu ima ölçümü. Deneyci checki Bunun nedeni olduCFTR oluşturmak proteolitik parçalarının varlığı için ng. Orada 130 kDa ve 100 kDa işaretleri arasında bazı floresan proteolitik parçaları için bu deneyde bazı kanıtlar vardır, ancak bu tam boy CFTR-GFP bandına göre çok zayıftır. Proteaz inhibitörleri burada açıklanan, biz hücre kırılması sonra CFTR proteolitik yıkımı için çok az delil bulmak. Önemli proteoliz görülürse, taze proteaz inhibitörü stok çözümler yapma öneririz. Ayrıca ticari proteaz inhibitörü kokteyl tabletler bu sistem için etkili olmadığını bulduk. Şekil 4 &#39;de gösterildiği gibi 16 ötesine hücrelerinin büyümesini saat (post-indüksiyon) azalmıştır CFTR ekspresyonuna sebep olur. Bu muhtemelen belki de protein devir, maya proteini kalite kontrol makine 6-9,13 upregülasyonunun nedeniyle kaynaklanmaktadır. Mümkünse en uygun zaman hücreleri ma hasat gibi bu, galaktoz ile indüksiyon sonrası CFTR ifade düzeyleri izlemek için bu nedenle tavsiye ediliry bir laboratuvar diğerine değişir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig1.jpg" /> Şekil 1.. Plazmid CFTR yapı ihtiva eden mantar. CFTR-GFP füzyon-8His bir galaktoz (GAL1) arttırıcının kontrolü altında, 2μ p424GAL1 ifade vektörünün içine sokulur. Vektör, aynı zamanda, bir urasil seçim işaretleyici (URA) ve Ampisilin direnç geni (Amp) içerir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig2.jpg" /> Şekil 2. Görselleştirildiği protokolü özetleyen akış şeması. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig3.jpg" /> Şekil 3. CFTR ifade ve arınma Temsilcisi SDS-poliakrilamid. Panel A beş rastgele CFTR ifade için tarandı transformant koloniler (şerit 1-5) aldı gösterir. Panel B 15L ferm izole edildi mikrozomları gösterirkültür girin. Panel C boyut dışlama kromatografisi takip afinite kromatografisi ile iki aşamalı arıtma sonrası elde edilen fare CFTR saflaştırılmış gösterir. Tüm jeller GFP alanı (solda) ve Coomassie sonra heyecan verici floresans (sağ) leke aydınlatma koşulları altında gösterilir. Moleküler ağırlık standartları göreceli konumları sol (kDa) üzerinde yer almaktadır. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig4.jpg" /> Şekil 4. Maya CFTR ifade Temsilcisi verileri. Panel A galaktoz ile indüksiyon sonrası CFTR ifade bir zaman kurs gösterir. Hücre ekstreleri SDS-PAGE ile analiz edildi ve CFTR-GFP protein bandı için GFP floresans entegre edildi. Panel B hücreleri 16 saat sonrası indüksiyon GFP-ifade floresan mikroskobu için tipik sonuçlarını gösterir. Tipik olarak, hücrelerin sadece bir kısmını, yüksek seviyelerde ifade CFTR.

<ol><li>Ford, R. C., Birtley, J., Rosenberg, M. F., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+three-dimensional+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">CFTR three-dimensional structure.</a> Methods Mol. Biol. 741, 329-346 (2011).</li>
<li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22CFTR%29.+J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> CFTR). J. Biol. Chem. 279, 39051-39051 (2004).</li>
<li>Zhang, L., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+location+within+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+investigated+by+electron+microscopy+and+gold+labelling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Domain location within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein investigated by electron microscopy and gold labelling.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1808, 399-404 (2011).</li>
<li>Kiser, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Expression and degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in Saccharomyces cerevisiae.</a> Arch. Biochem. Biophys. 390, 195-205 (2001).</li>
<li>Huang, P., Stroffekova, K., Cuppoletti, J., Mahanty, S. K., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1281, 80-90 (1996).</li>
<li>Ahner, A., Nakatsukasa, K., Zhang, H., Frizzell, R. A., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+heat-shock+proteins+select+deltaF508-CFTR+for+endoplasmic+reticulum-associated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Small heat-shock proteins select deltaF508-CFTR for endoplasmic reticulum-associated degradation.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 806-814 (2007).</li>
<li>Fu, L., Sztul, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-associated+complexes+%28ERACs%29+containing+aggregated+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+are+degraded+by+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">ER-associated complexes (ERACs) containing aggregated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are degraded by autophagy.</a> Eur. J. Cell. Biol. 88, 215-226 (2009).</li>
<li>Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derlin-1+promotes+the+efficient+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+and+CFTR+folding+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Derlin-1 promotes the efficient degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and CFTR folding mutants.</a> J. Biol. Chem. 281, 36856-36863 (2006).</li>
<li>Zhang, Y., Michaelis, S., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+expression+and+ER-associated+degradation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">CFTR expression and ER-associated degradation in yeast.</a> Methods Mol. Med. 70, 257-2565 (2002).</li>
<li>Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Protoc. 3, 784-798 (2008).</li>
<li>Knight, A. W., Billinton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+wood+through+the+trees%3A+A+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Seeing the wood through the trees: A review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Anal. Biochem. 291, 175-197 (2001).</li>
<li>Robinson, K. M., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+nucleotide+sequence+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+gene+for+the+succinate+dehydrogenase+flavoprotein+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and nucleotide sequence of the Saccharomyces cerevisiae gene for the succinate dehydrogenase flavoprotein subunit.</a> J. Biol. Chem. 267, 10101-10107 (1992).</li>
<li>Gnann, A., Riordan, J. R., Wolf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+degradation+depends+on%5BTitle%5D)+AND+%22the+lectins+Htm1p%2FEDEM+and+the+Cdc48+protein+complex+in%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator degradation depends on.</a> the lectins Htm1p/EDEM and the Cdc48 protein complex in. 15, 4125-4135 (2004).</li>
<li>Yoo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-conventional+trafficking+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+through+the+early+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Non-conventional trafficking of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator through the early secretory pathway.</a> J. Biol. Chem. 277, 11401-11409 (2002).</li>
<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+and+structural+changes+associated+with+phosphorylation+and+nucleotide+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Architecture of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and structural changes associated with phosphorylation and nucleotide binding.</a> Journal of Structural Biology. 167, 242-251 (2009).</li>
<li>Wellhauser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).</li>
<li>Ramjeesingh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monomer+is+the+minimum+functional+unit+required+for+channel+and+ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).</li>
<li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidylglycerol%3A+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu makale, kistik fibroz araştırma kolaylaştırmalıdır maya hücreleri murin CFTR proteini ifade etmek için bir yöntem sağlar. Amaç Kistik Fibrozis Vakfı (aracılığıyla sunulacaktır murin CFTR DNA yapı, serbest bırakılması ile bu kağıt bağlamak için <a href="http://www.cff.org/research/CFFT/">http://www.cff.org/research/CFFT/</a> ). Diğer orthologs sonra kullanılabilir hale gelmelidir. CFTR içeren vektör ile maya hücrelerinin dönüşümü basit, ancak CFTR yüksek seviyelerde ifade koloniler için ekranda için önemlidir. Değişken ifade seviyeleri çeşitli faktörler ortaya çıkabilir, ancak plazmid başına hücre kopya sayısını muhtemelen varyasyonun önemli bir derecesine oluşturuyor. Burada anlatılan Kritik adımları CFTR eksprese maya hücreleri ve mikrozomal membran CFTR içeren üretim izin vermelidir. Bir kez değişim, büyüme, hasat ve maya hücrelerinin parçalanması purif, hakim olmuşturProteinin ication mümkün olmalıdır, ve Şekil 3&#39;te çok faydalı bir referans olarak, bu durumda olmak üzere açıkça saflıkta bir örnek verdi. Bu proteinin saflaştırılması için detaylı metodoloji sağlamak için bu yazının bizim niyeti yoktur. Ancak, bu tür hücre parçalama ve mikrozom arınma gibi S.cerevisae ifade sistemine özgü bazı kritik aşağı arıtma adımlar vardır ve bunlar bu yazının ayrıntılı olarak dahil edilmiştir. Bu, belirtilmelidir ki, bu dışında kullanılacak olan iki yöntem ile, alternatif bir mantar hücre parçalama yöntemler böyle bir Fransız basınç hücrenin kullanımını olarak, kullanılan edilebilir. Rekombinant proteinin proteine ​​(Şekil 4) indüksiyonundan sonra izlenebilir olanak sağlayan bir TEV-yarılabilir C-terminal GFP alanı vardır. Maya aynı koşullar 11, ve bu altında fluoresces yararlı bir arası sağlayabilir bir içsel 70kDa proteini (muhtemelen dehidrogenaz 12 süksinat) sahiptam hücre ekstreleri ya mikrozomlan CFTR bağıl ifade seviyelerinin için nal kalibrasyon standart (Şekil 3). Bu, galaktoz ile indüksiyonundan sonra hücre hasat zamanlama önemli olduğunu Şekil 4&#39;te gösterilen veriler açıkça bellidir. CFTR damla verim precipitously indüksiyon yaklaşık 16 saat sonra, maya hücrelerinin herhangi bir tespit edilebilir CFTR indüksiyon 24 saat sonra çok az olacak şekilde. Saflaştırılmış proteini verim 15 litre başına 1 fermentör kültürü-2 mg CFTR proteini ile ilgilidir. Kurtarma mikrozom aşamasına toplam CFTR-GFP protein kadar yaklaşık% 70 olarak tahmin edilmekte ve saflaştırılmış protein yaklaşık% 25 oranında iyileşme olabilir. S. Karakterizasyonu cerevisiae-ifade CFTR devam etmektedir. Şekil görülmektedir. 4, hücre proteinin yerini floresan mikroskobu ile izlenebilir. Floresans çok beklenen 10 gibi hücre çevresi etrafına bulunmasına rağmen, protein bazı, bir noktalı Lokalizasyon görüntüler, ya, ya daSadece geç bir Golgi / endosome yolu 14 veya belki de ER 4 ulaşım vezikül tomurcuklanan bir bölmesi aşağı aracılığıyla geri dönüşüm CFTR bağlı olabilir plazma zarı içinde. PNGaseF, proteinler deglycosylates bir enzim tedavisi bu unglycosylated olduğunu ima, SDS-PAGE üzerindeki CFTR proteini grubun göç minimal değişiklik gösterdi, ya da çok az glikozilasyon 15 vardır. Protein fosforilasyon durumu üzerinde deneyler devam etmektedir. Şimdiye kadar test deterjanların bazı olarak, daha önceden saflaştırılmış protein 2,15 yayınlanan benzemektedir oranlarda (bir CFTR spesifik inhibitör 16 ile engellenir) ATPaz aktivite gösterir. CFTR kanalı aktivitesinin belirlenmesi nispeten yüksek bir kritik misel konsantrasyonu (CMC) 17 olan bir deterjan nihai bir saflaştırma adım anlamına gelir saflaştırılmış protein, rekonstitüsyon gerektirecektir. Maya containin mikrozomlarıg CFTR gibi, genellikle &quot;yumuşak&quot; olarak kabul edilir dodesil maltoside 2 gibi deterjanlar dahil olmak üzere çeşitli yaygın olarak kullanılan deterjan 18 ile solublised edilebilir. Ancak en yüksek cmc deterjanları Bu deterjanların içine döviz herhangi bir arıtma düzeni geç bir aşamada düşünülmelidir düşündüren, şimdiye kadar, solubilsation için verimsiz olduğu kanıtlanmıştır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog No </td></tr><tr><td> Pep4 silme 10 FGY217 S. cerevisiae soyu, </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Amino asitler olmadan Maya nitrojen bazın </td><td> Formedium </td><td> CYN0410 </td></tr><tr><td> Urasil olmadan takviyesi karışımı tamamlayın </td><td> Formedium </td><td> DCS0169 </td></tr><tr><td> Bakteriyolojik agar </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5306 </td></tr><tr><td> D-galaktoz </td><td> Balıkçı </td><td> BP656-500 </td></tr><tr><td> D-glukoz </td><td> Balıkçı </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> Pepstatin A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4265 </td></tr><tr><td> Löpeptin </td><td> Merck </td><td> 108975 </td></tr><tr><td> Kimostatin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7268 </td></tr><tr><td> Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7626 </td></tr><tr><td> Epoxysuccinyl-leucylamido-butan (E-64) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E3132 </td></tr><tr><td> Aminoethylbenzenesulfonyl florid (AEBSF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8456 </td></tr><tr><td> Benzamidin hidroklorür </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 434760 </td></tr><tr><td> Dimetilsülfoksit (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> ditiyotretol (DTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td></tr><tr><td> etilendiamintetraasetik asit (EDTA) </td><td> Balıkçı </td><td> BP120500 </td></tr><tr><td> Tris-bazlı </td><td> Formedium </td><td> TRIS01 </td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Balıkçı </td><td> P631 </td></tr&gt; <tr><td> D-sorbitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S1876 </td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> Balıkçı </td><td> 065017 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> n-dodesil-β-D-maltopyranoside </td><td> Affymetrix </td><td> D310S </td></tr><tr><td> Bromofenol mavi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 114391 </td></tr><tr><td> PageRuler Artı prestained protein standardı </td><td> Fermentas </td><td> SM1811 </td></tr><tr><td> NuSep tris-Gly 4-20% eğim jeller </td><td> NuSep </td><td> NB10-420 </td></tr><tr><td> Anında Mavi Coomassie Leke </td><td> Novexin </td><td> ISB1L </td></tr><tr><td> Cam boncuk, asit yıkanmış </td><td> Sigma </td><td> G8772 </td></tr><tr><td> 50ml Steril Falcon Tüpler </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 </td></tr><tr><td> 2mlSteril vida-top şişeleri </td><td> Sarstedt </td><td> 72.694.005 </td></tr><tr><td> 250ml Steril Erlenmeyer şaşırttı matara </td><td> BD Biosciences </td><td> 355119 </td></tr><tr><td> 2l Steril Erlenmeyer matara şaşırttı </td><td> BD Biosciences </td><td> 355131 </td></tr><tr><td> 2ml mikrofuge&#39;de tüpler </td><td> Sarstedt </td><td> 72.695 </td></tr><tr><td> 0.2μM şırınga filtresi </td><td> Sartorius </td><td> FC121 </td></tr><tr><td> ultrasantrifüjdeki tüpler </td><td> Beckman Coulter </td><td> 355618 </td></tr><tr><td> santrifüj tüpü </td><td> Beckman Coulter </td><td> 357000 </td></tr><tr><td> 1l santrifüj kapları </td><td> Beckman Coulter </td><td> 969329 </td></tr><tr><td> Orbital sıcaklık kontrolü ile inkübatör sallayarak </td><td> New Brunswick Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Deltavision RT restorasyon mikroskop </td><td> Uygulamalı Vizyon </td><td></td></tr><tr><td> Masaüstü santrifüj </td><td> HERMLE </td><td> Z300 </td></tr><tr><td> Masaüstü mikrofuge&#39;de </td><td> Balıkçı </td><td> 13-100-511 </td></tr><tr><td> Vorteks karıştırıcı </td><td> Star Labs </td><td></td></tr><tr><td> Typhoon Trio Tarayıcı </td><td> GE Healthcare </td><td> 63-0055-87 </td></tr><tr><td> LAS3000 görüntüleme sistemi </td><td> Fuji </td><td></td></tr><tr><td> 20l fermentörde damar ve kontrol ünitesi </td><td> Applikon </td><td></td></tr><tr><td> Sabit sistemler hücre bölücü </td><td> Sabit sistemler </td><td></td></tr><tr><td> Beadbeater hücre bölücü </td><td> BioSpec </td><td> 1107900 </td></tr><tr><td> Mini-beadbeater-16 </td><td> BioSpec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> JA-17 rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369691 </td></tr><tr><td> Optima L-100 ultrasantrifüjdeki </td><td> Beckman Coulter </td><td> 392050 </td></tr><tr><td> 50.2Ti rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> <a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901" target="_blank">337901</a> </td></tr></tbody></table>

yılında kistik fibrozis transmembran İletkenlik regülatörü protein İfadesi ve arıtma saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) mutasyon olduğunda, bu nedenle bu proteinin çok büyük bir ilgi olduğunu humans.There kistik fibrozis ortaya çıkmasına neden olabilir bir klor kanalı, ama yapısı ve faaliyet çalışma çabaları zorluk nedeniyle engellense 1-3 protein yeterli miktarda ifade ve arındırma. Birçok &#39;zor&#39; ökaryotik membran proteinleri gibi, hızlı büyüyen bir organizmanın ifade arzu, ama zorlu ve maya S. cerevisiae, şimdiye kadar düşük miktarda elde edildi ve rekombinant protein hızlı bir degradasyon 4-9 gözlenmiştir. Maya rekombinant CFTR işleme ile ilgili Proteinler 6-9 tarif edilmiştir. Bu raporda, önemli miktarda maya ve arıtma CFTR ifade etmek için bir metodoloji tanıtılmıştır. Protokolü önceki proteoliz sorunların üstesinden nasıl açıklanır ve nasıl ifade seviyelerininCFTR büyük ölçüde hücre hasat öncesinde belirli süre içinde, hücre büyümesi koşulları değiştirerek ve indüksiyon koşulları kontrol ederek geliştirilebilir. Bu protokol (mürin CFTR eksprese maya hücreleri veya maya plazmid) araştırma sponsor oldu ABD Kistik Fibrozis Vakfı aracılığıyla dağıtılacaktır ile ilişkili reagants. CFTR tasarımı ve sentezi bu raporda istihdam oluşum, anlatan bir makale (.; Thibodeau, P. ve arkadaşları, yayınlanmamış Urbatsch, I.) ayrı olarak yayınlanacaktır. Plazmid içeren maya (Şekil 1) - Bu yazıda, CFTR yapı ile maya hücrelerinin dönüşümü ile bizim yöntem başında açıklayacağız. Yapı 10, C-terminalindeki CFTR için kaynaşmış bir yeşil floresan protein (GFP) dizilimi vardır ve Drew ve arkadaşları tarafından geliştirilen sistem kullanılır. (2008). GFP CFTR ifadesi ve saflaştırılması nispeten kolay takip edilmesini sağlar. Vallahi görüntülendi protocmaya hücrelerinden mikrozomal hazırlandıktan sonra ol tamamlandığında, biz mikrozomları gelen protein saflaştırılması için bazı öneriler içermesine rağmen. Okuyucular protein ve kendilerine sunulan yerel ekipman ile yapılacak son deneyler bağımlı mikrozom saflaştırma işlemi, kendi değişiklikler eklemek isteyebilirsiniz. Maya-ifade CFTR proteini kısmen bir içsel polyhistidine saflaştırma etiketi kullanılarak, metal iyonunun afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırılabilir. Daha sonraki boyut dışlama kromatografisi olarak SDS-PAGE ve jel Coomassie-boyama tarafından değerlendirilecek,&gt;% 90 saf gibi görünen bir protein üretir.

Kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) ifade etmek için girişimleri<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Şimdiye kadar protein nispeten düşük miktarda vermiştir. Kistik Fibrozis Vakfı aracılığıyla dağıtılan Bu protokol ve ilgili reaktifler bu &#39;zor&#39; ökaryotik membran proteini miligram miktarlarda hazırlanması izin vermelidir.

Yılında Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü Protein İfadesi ve Arıtma Saccharomyces cerevisiae

Kistik fibrozis transmembran iletkenlik düzenleyici (CFTR), mutasyona uğradığında ...'da kistik fibrozise yol açabilen bir klor kanalıdır.

Bu prosedürün genel amacı, Charmy Visier'de miligram miktarlarında CFTR proteini eksprese etmektir. Bu işlem, öncelikle 50 mililitrelik hücre kültürlerinde büyüme ve ekspresyon denemeleri için TRANSFORMANT kolonlarının seçilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, hücre hatları ve CFTR eksprese eden kolonlar tanımlanır.Ardından, en yüksek CFTR ekspresyonu gösteren koloniler 15 litrelik bir fermentör kültüründe büyütülür. Son olarak, hücre lizatları ve CFTR içeren mikrozomlar hazırlanır. Nihayetinde sonuçlar, GFP füzyonlu CFTR'nin ekspresyonunu ve ekstraksiyonunu Ingel floresansı ve floresan mikroskobu aracılığıyla göstermektedir.Bu tekniğin CFTR ekspresyonuna yönelik mevcut yöntemlere göre temel avantajı; ucuz, hızlı ve yetiştirilmesi kolay, basit bir ökaryotik konak kullanmasıdır. Ekspresyon düzeylerinin hızlıca izlenmesine olanak tanıyan bir yeşil floresan protein etiketi mevcuttur. Son olarak, bu prosedürde moleküler biyoloji basamakları minimize edilmiştir.Bu yöntem, CFTR proteininin biyofiziksel özellikleri gibi kistik fibrozis alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin doğurduğu sonuçlar, saflaştırılmış proteine dayalı yeni ilaç taramalarına yol açabileceği için kistik fibrozis tedavisine kadar uzanmaktadır. Proteinle doğrudan etkileşime giren bu ilaçlar sayesinde yeni ilaç kategorileri ortaya çıkabilir.Kistik fibrozisteki birincil kusurun daha spesifik olması ve potansiyel olarak daha az pleiotropik etkiye sahip olması gerekir. Ayrıca, CFTR için yüksek çözünürlüklü bir yapı elde etmek adına proteinin büyük miktarlarda saflaştırılması önemlidir. Protein yapısı tabanlı ilaç tasarımı, mevcut ilaçları geliştirmeli ve potansiyel olarak yeni ilaçların keşfine yol açmalıdır.Bu makalenin ve beraberindeki videonun yayınlanması, DNA veya transforme edilmiş hücrelerin Cystic Fibrosis Foundation aracılığıyla sağlanmasıyla bağlantılıdır. Bu materyalleri temin etmek isterseniz, lütfen Cystic Fibrosis Foundation'dan Elizabeth Joof ile iletişime geçin. Bir materyal transfer sözleşmesi doldurmanız gerekecektir.Bu yöntem, Imperial College London'dan David Drew ve çalışma arkadaşlarının tanıttığı, membran proteinlerinin ekspresyonu için A GFP etiketinin kullanımına dair bilgi sağlayabilir. Bu yöntemde yeni olan kişiler transformasyon aşamasında zorlanabilirler. İyi ekspresyon seviyeleri elde etmek için transformasyon verimliliği düşük olabilir ve hücre hasat zamanı kritik öneme sahiptir.Bu yöntem fikri ilk olarak David Drew ve ekibinin laboratuvarımıza yaptığı bir ziyaret sırasında ortaya çıktı. Bu ekip, söz konusu sistemi kullanarak mayadan eksprese ettikleri ve saflaştırdıkları membran proteinleri üzerinde yapısal çalışmalar yürütmekteydi. Hücre transformasyonu, indüksiyon sonrası hücre büyümesi ve mikrozom izolasyonu zor süreçler olduğundan ve bir yayın bir reaktifin piyasaya sürülmesine bağlı olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır.Video, farklı laboratuvarların sonuçlarını karşılaştırabilmesi için protokolün standardize edilmesine de yardımcı olacaktır. Bu prosedürü, laboratuvarımızdaki lisansüstü öğrenciler olan Tracy Remington ve Natasha Kant gösterecektir. Makalenin diğer ortak yazarı olan Liam o Ryan, şu anda Yeni Zelanda'da olduğu için demonstrasyonda yer alamamıştır. C-F-T-R-G-F-P eight hiss genini kodlayan bir maya plazmidi ile s visi suşu FGY 2 1 7'yi transforme ettikten sonra, bir transformasyon plakasından iyi ayrılmış beş ila 10 koloni seçin.Her bir koloniyi, dokuz mililitre maya azot bazlı veya YNB besiyeri ile bir mililitre glikoz içeren ayrı bir steril 50 mililitrelik Falcon tüpüne aktarın. Taranan kolonilerin her biri için gliserol stokları oluşturmak amacıyla, kültürleri orbital çalkalamalı inkübatörde 250 RPM ve 30 °C'de 16 saat boyunca gece boyu büyütün. Gece boyu büyütülmüş kültürlerden 0.8 mililitreyi, etiketlenmiş vidalı kapaklı şişelerdeki 0.2 mililitre steril gliserole aseptik olarak ekleyin.Kısaca vorteksleyin ve -80 °C'de saklayın; geri kalan gece boyu kültürlerini, 250 µL glukoz ortamı içeren YMB içinde 50 mL nihai hacme seyreltin. Kültürleri, orbital çalkalamalı inkübatörde, 250 RPM ve 30 °C'de OD 600 değeri 0,7 ila 0,8 olana kadar etiketli 250 mL'lik kanallı erlenmeyer flasklarda büyütün. Her bir flaska 5 mL galaktoz ortamı ekleyerek kültürleri indükleyin. İnkübatör sıcaklığını 25 °C'ye düşürün ve 16 saat boyunca gece boyu büyütün.Kültürleri 50 milliliter Falcon tüplerine aktarın. Santrifüj çalışırken, hücreleri bir masaüstü santrifüjde dört degrees Celsius'ta 10 dakika boyunca 3, 500 times G'de santrifüj ederek hasat edin. Yaklaşık 300 microliters asitle yıkanmış cam boncuk içeren iki milliliter vidalı kapaklı mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın ve buz üzerine yerleştirin.Süpernatantları atın ve her bir peleti 800 µL buz gibi soğuk hücre resüspansiyon tamponu veya proteaz inhibitörleri içeren CRB içinde yeniden süspande edin. Süspansiyonları mikro santrifüj tüplerine aktarın ve buz üzerinde tutun. Hücreleri mini boncuklu parçalayıcıya (bead beater) yükleyin ve üç dakika boyunca çalıştırın.Tüpleri bir masaüstü mikrosantrifüje yerleştirin ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 3,500 ×g'de santrifüjleyin. Membranları içeren süpernatanları temiz mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve buz üzerine koyun. Ham membranları, bir masaüstü mikrosantrifüjde 4 °C'de iki saat boyunca maksimum hızda santrifüjleyerek toplayın.Süpernatanı uzaklaştırın ve her bir peleti temiz mikro santrifüj tüplerindeki 50 µL buz gibi soğuk CFTR tamponu ile yeniden süspanse edin. Her bir süspansiyondan 15 µL'yi, 15 µL 2x yükleme boyası ile pipetleme yoluyla karıştırın.Örnekleri kaynatmayın; çünkü bu durum CFTR ve diğer membran proteinlerinin SDS'de çözünmeyen agregatlar oluşturmasına neden olur ve ayrıca GFP etiketini denatüre eder. Örnekleri ve önceden boyanmış bir protein standardını %4 ila 20'lik bir disk glisin gradyan jeline yükleyin ve 150 volt'ta 40 dakika boyunca çalıştırın. En yüksek ekspresyonu gösteren hücreleri belirlemek için jel içi floresan analizi yaptıktan ve ekspresyonu Coomassie boyaması ile doğruladıktan sonra, en yüksek ekspresyonu gösteren hücre hattını gliserol stokundan taze bir YNBA plakasına ekin ve 30 °C'de iki ila üç gün inkübe edin.Fermantör için ön kültürler hazırlamak amacıyla plakayı dört derece Celsius'ta iki haftaya kadar saklayın. A-Y-N-B-A plakasından bir santimetrekarelik bir hücre alanını kazımak için steril bir öze kullanın ve yaklaşık 0.1 OD 600 değeri elde etmek için 45 mililitre YMB ve beş mililitre glikoz besiyerine ekleyin. Kültürleri, OD 600 değeri bir olana kadar orbital çalkalamalı inkübatörde 250 RPM ve 30 derece Celsius'ta büyütün.Kültürü, her biri 450 mililitre YMB besiyeri ve 25 mililitre glukoz içeren iki adet iki litrelik kanatlı erlenmeyer flaskına paylaştırın. Besiyerini, OD 600 değeri 1.2'ye ulaşana kadar bir orbital çalkalamalı inkübatörde 30 °C'de ve 250 RPM'de gece boyunca büyütün. Fermentörü hazırlamak için 11.2 litre YNB hazırlayın ve indüksiyon sırasında gliserol eklemesini telafi etmek için ek olarak 8.28 gram YNB ve 0.95 gram dropout takviyesi ekleyin.Ardından aseptik koşullarda, 11,2 litre YNB ve 75 mililitre glukoz besiyerini steril 20 litrelik bir fermentör kabına ekleyin ve çalışma sıcaklığını 30 °C olarak ayarlayın. Daha sonra aseptik olarak, ön kültürleri fermentöre ekleyin. Karıştırma hızını yaklaşık 800 RPM'e ayarlayın ve sıkıştırılmış hava akışını dakikada yaklaşık 15 dm³ olacak şekilde düzenleyin.Kültür OD 600 değeri 1,2'ye ulaştığında, aseptik olarak 1,5 litre galaktoz besiyeri ve 1,2 litre gliserol ekleyerek indüksiyonu gerçekleştirin. Sıcaklığı 25 °C'ye düşürün ve bir peristaltik pompa kullanarak kültürün 16 saat boyunca büyümesini sağlayın. Kültürü buz üzerinde soğutulmuş bir litrelik santrifüj tüplerine aktarın.Hücreleri 4 °C'de 3.500 ×g'de 30 dakika santrifüj ederek hasat edin. Hücreleri, proteaz inhibitörleri ve 1 mM DTT içeren 150 mL buz gibi soğuk micro zone Resus suspension buffer veya MRB içerisinde yeniden süspande edin. Bu noktadan itibaren tüm işlemleri 4 °C'de gerçekleştirin. Hücreleri parçalamak için bir hücre parçalayıcı kullanın.Ardından lizatları 50 mililitrelik falcon tüplerine aktarın ve hücre kalıntılarını 3.500 ×g kuvvetinde, 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjleyerek çöktürün. Mitokondrileri uzaklaştırmak için süpernatantı soğutulmuş santrifüj tüplerine aktarın ve 14.000 ×g kuvvetinde, 4 °C'de 30 dakika boyunca döndürün. Son olarak mikrozomları toplamak için süpernatantı soğutulmuş ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve 200.000 ×g kuvvetinde, 4 °C'de 90 dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatanı dikkatlice dekante edip atın ve her tüpe proteaz inhibitörleri ve 1 mM DTT içeren 2 mL buz soğukluğunda CFTR tamponu ekleyin. Peletleri bir resim fırçası kullanarak nazikçe yeniden süspande edin. Ardından, her tüpü CFTR tamponu ile tamamlayın ve vorteksleyin. Süspansiyonu 4 °C'de 60 dakika boyunca 100.000 ×g'de santrifüjleyin.Üst fazı atın ve buz gibi soğuk, proteaz inhibitörleri ve 1 mM DTT içeren 2 mL CFTR tamponunda resüspansiyon işlemini tekrarlamak için bir fırça kullanın. Resüspande edilen mikrozomları çekin, ardından nihai hacmi CFTR tamponu ile 50 mL'ye tamamlayın ve iyice karıştırın. SDS-PAGE için 1 mL'lik bir alikot ayırın ve mikrozomları, mikrozomlardan CFTR ekstre edilene kadar -80 °C'de saklayın.Yazılı protokole bakınız. Maya hücrelerinin CFTR içeren plazmit ile transformasyonu %100 verimli değildir. Bir transformasyon deneyinden seçilen kolonilerde CFTR ekspresyonuna yönelik temsilci bir küçük ölçekli tarama, yaklaşık her dört koloniden birinin gösterilen proteini ekspres ettiğini ortaya koyacaktır.Burada, bir plakadan seçilen beş kolonun tarama sonuçları yer almaktadır. Bir kolon, C-F-T-R-G-F-P füzyon proteininin güçlü bir ekspresyon seviyesi göstermektedir. C-F-T-R-G-F-P floresan seviyeleri deneyler arasında önemli ölçüde farklılık gösterecek olup, dördüncü kolon yaklaşık 70 kilodaltondaki içsel floresan bandından en az 10 kat daha fazla floresan göstermektedir.Solda gösterildiği gibi C-F-T-R-G-F-P'nin yüksek ekspresyon seviyelerinde bile, sağda görüldüğü üzere C-F-T-R-G-F-P bandının hücre ekstraktında kumasi boyaması ile ayırt edilebilmesi düşük bir olasılıktır. Bu şekil, mikrozomlar içerisinde C-F-T-R-G-F-P varlığını göstermektedir. Bu deneyin sonuçları, yalnızca ekspresyon indüksiyonunun verimliliğini değerlendirmek için değil, aynı zamanda mikrozomların dikkatle hazırlandığını ve proteolizin minimize edildiğini kontrol etmek için de önemlidir.Burada gösterildiği üzere, hücrelerin 16 saatin üzerinde büyütülmesi CFTR ekspresyonunda azalmaya yol açacaktır. Bu durum muhtemelen proteinin döngüsünden, belki de maya protein kalite kontrol mekanizmasının yukarı regülasyonundan kaynaklanmaktadır.Bu nedenle, indüksiyon sonrası CFTR ekspresyon seviyelerinin jel floresansı ve floresan görüntüleme kullanılarak izlenmesi önerilir. Bu prosedür uygulanırken, OD 600 ölçümleri kullanılarak hücre büyümesinin takip edilmesi önemlidir. Ölçeği büyütmeden önce her şeyi önce küçük ölçekte deneyiniz ve protein ekspresyonunu zamanın bir fonksiyonu olarak kontrol ediniz. Hücreleri toplamak için gereken optimal süre laboratuvardan laboratuvara farklılık gösterebileceğinden, bu işlem indüksiyondan sonra yapılmalıdır.Bu videoyu izledikten sonra, CFTR proteininin miligram miktarlarda Scro Visier mayasında nasıl eksprese edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürün ardından CFTR proteini, daha ileri biyokimyasal ve biyofiziksel karakterizasyon için maya mikrozomlarından saflaştırılabilir. David Drew ve çalışma arkadaşları tarafından geliştirilmesinin ardından bu teknik, ökaryotik membran proteinlerinin daha iyi ekspresyonunun yolunu açmıştır.Dünya çapındaki laboratuvarların ucuz ve kolay bir ekspresyon sistemi kullanarak CFTR üretmelerine olanak tanıyarak, bu çalışmanın kistik fibrozis araştırmaları üzerinde bir etki yaratacağını umuyoruz. Bu çalışma, Kistik Fibrozis Vakfı'nın ve elbette CFTR üç boyutlu Yapı Konsorsiyumu'ndaki meslektaşlarımızın desteği olmadan mümkün olmazdı. Herhangi bir rekombinant organizma ile çalışmanın sıkı denetimlere tabi olduğunu ve herhangi bir çalışmaya başlanmadan önce taşıma ve imha prosedürlerinin uygun düzenleyici kurum tarafından onaylanması gerektiğini unutmayın.

expression-purification-cystic-fibrosis-transmembrane-conductance

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kistik fibrozis transmembran kondüktans regülatörü (CFTR), epitelyal bir klor kanalı, çeşitli proteinler ile etkileşim ve önemli hücre süreçlerini düzenleyen bildirilmiştir; aralarında CFTR PDZ motifi aracılı etkileşimleri de belgelenmiştir. Bu protokol bizim karmaşık bir sinyal PDZ bağımlı CFTR makromoleküler birleştirmek için geliştirilen yöntemler...

PDZ bağımlı CFTR makromoleküler Sinyal Kompleksleri İn Vitro Analizi

Yüksek kaliteli maya hücre ekstrelerinin hazırlanması bireysel proteinler veya tüm proteomlarda analizinde gerekli bir ilk adımdır. Burada protein fonksiyonları, etkileşimleri ve translasyon sonrası modifikasyonlar korumak için optimize edilmiştir tomurcuklanan maya hücreleri için, hızlı, verimli ve güvenilir homojenizasyon protokol açıklar.

Fonksiyon Çalışma, Etkileşimler, ve Post-translasyonel değişiklikler için tomurcuklanan Maya Protein Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Heterolog ifade ve kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) saflaştırılması önemli sorunlar ve kistik fibrozis için ilaç tedavilerinin gelişiminde sınırlayıcı faktörler. Bu protokol, yapısal ve işlevsel çalışmalar için uygun CFTR miligram miktarları izolasyonu için iki yöntem açıklanır.

Olarak ifade edilmiştir kistik fibroz transmembran kondüktans regülatörü Protein Saflaştırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Burada anlatılan Kistik Fibrozis kusurlu olan bu klorür kanalı, etkinliğini korur saflaştırılmış yabani tip ve mutant CFTR proteininin fonksiyonel yeniden bir hızlı ve etkili bir yöntemdir. CFTR aracılık ettiği yeniden proteoliposomes gelen iyodür akış kanalı aktivitesinin çalışmaları ve küçük moleküllerin etkilerini sağlar.

Saf Yabanitip ve Mutant CFTR Protein Fonksiyonel Sulandırma ve Kanal Aktivite Ölçümleri

Protein etkileşimleri bir hücrenin işlevi merkezinde yer alıyor. Kalorimetre ve spektroskopik teknikleri yaygın onları karakterize etmek için kullanılır. Burada Shwachman-Diamond Sendromu (SBD'ler) mutasyona uğramış protein ve Uzama faktörü benzeri 1 GTPaz (EFL1) arasındaki etkileşimi incelemek için bir araç olarak floresan anizotropi açıklar.

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

Bu iletişim kuralı tarafından cryo-elektron mikroskobu, verimli bir şekilde en az çaba ve toksisite, protein ayıklama, arıtma ile memeli hücrelerinde genlerin ifade etmek için kullanılan bir baculovirus sistemi de dahil olmak üzere iyon kanal yapılarını belirlemek için kullanılan teknikler açıklanır, ve kalite kontrol, örnek kılavuz hazırlık ve tarama, hem de veri toplama ve işleme.

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Burada hızlı, solubilize ve birçok ökaryotik Bor taşıyıcılar homoloji Maya kullanarak SLC4 taşıyıcı ailesi ile arındırmak için bir protokol mevcut. Ayrıca saf homomeric protein multimeric derleme için değerlendirmek için bir kimyasal cross-linking tahlil açıklar. Bu protokoller için zorlu diğer membran proteinlerinin adapte edilebilir.

İfade, Solubilization ve ökaryotik Bor taşıyıcılar arıtma

Bu makalede, her iki S. cerevisiae ve HEK293T hücrelerinde protein kendinden montajı ölçmek için fret tabanlı akış sitometri Protokolü açıklanır.

Algılama ve ölçme protein Self-montaj In vivo tarafından akış sitometri

Önceden oluşturulmuş nanodisklere birlikte translasyonel yerleştirme, tanımlanmış lipit ortamlarında deterjanlarla temas etmeden hücresiz sentezlenmiş membran proteinlerinin incelenmesini mümkün kılar. Bu protokol, temel sistem bileşenlerinin hazırlanmasını ve ifade verimliliğini ve numune kalitesini artırmak için kritik parametreleri açıklar.

Membran Proteinlerinin Önceden Oluşturulmuş Nanodisklere Ko-Translasyonel Olarak Yerleştirilmesi

Bu makalede, Saccharomyces cerevisiae'de aşırı ifade edilen Candida albicans ABC (ATP bağlayıcı kaset) protein Cdr1'in karakterizasyonu için küçük ölçekli bir plazma membran izolasyon protokolü sunulmaktadır. Cdr1 ile etiket arasında 16 kalıntılı bağlayıcı bulunan proteaz-bölünebilir C-terminal mGFPHis çift etiket, Cdr1'in saflaştırılmasını ve deterjan taramasını kolaylaştırmak için tasarlanmıştır.

Candida albicans Cdr1-mGFPHis Analizi için Küçük Ölçekli Plazma Membran Hazırlama

İnsan zarı taşıyıcılarının yapısal ve biyokimyasal çalışmaları, miligram miktarlarda kararlı, sağlam ve homojen protein gerektirir. Burada, kodon için optimize edilmiş genleri kullanarak insan çözünen taşıyıcı taşıyıcıları taramak, eksprese etmek ve saflaştırmak için ölçeklenebilir yöntemleri açıklıyoruz.

Yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için insan çözünen taşıyıcılarının yüksek verimli ekspresyonu ve saflaştırılması

Keşfedin, kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatörü proteininin Saccharomyces cerevisiae'de miligram düzeyinde ifadesi ve arıtılması için GFP etiketli yöntem. Bu teknik, ilaç tarama ve yapısal çalışmalar için temel oluşturur.

Yılında Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü Protein İfadesi ve Arıtma Saccharomyces cerevisiae

Daha fazla video keşfet