Metisiline Dirençli Deneysel Endokardit Modeli

Bu prosedürün genel amacı, sıçanlarda deneysel bir enfektif endokardit modeli oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle aureus kültürlenerek ve enfeksiyon için cerrahi kateterler hazırlanarak gerçekleştirilir. Ardından, cerrahi alan hazırlanır ve hayvan anestezi altına alınır.

Hayvan anestezi altına alındıktan sonra, sağ karotis arteri üzerinden kalbe doğru bir kateter yerleştirilir. Son adım, kuyruk veni enjeksiyonu ile hayvanların aureus ile enfekte edilmesidir. Son olarak, hedef dokular diseke edilir ve kantitatif kültür için hazırlanır.

Bu tekniğin hızlı endokardit modeli gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kırmızı endokardit modelinin in vivo görüntüleme sistemi Ivus ile birlikte kullanılabilmesidir. Bu yöntem, antimikrobiyal ajanların virülensi ve etkinliği gibi oral patogenez alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu tekniği ilk kez kullanacak kişiler, cerrahi prosedürün zorlayıcı olması nedeniyle güçlük çekebilirler.

İlk olarak, dondurulmuş stoktan bir öze dolusu M SSA kültürünü koyun kanlı agar plakasına ekleyin. Kontaminasyon olmadığını kontrol ettikten sonra, kültürü 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Plaktan tek bir koloni seçin ve bunu 15 mL'lik snap kapaklı bir tüpteki 5 mL triptik soya soya broth'u eklemek için kullanın.

İnokülumu, sallamalı bir inkübatörde 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Kateterleri hazırlamak için hızı 200 RPM'e ayarlayın. Polietilen tüpleri 10 cm uzunluğunda kesin ve kateterleri cex dezenfektan çözeltisinde 30 dakika boyunca sterilize edin.

Ardından, sağ karotis arterinden geçip sol ventriküle ulaşacak ve kalp atışları sırasında endokardiyuma zarar verecek bir kateter oluşturmak için, steril bir tüpün bir ucunu ısıtılmış steril pens ile bastırarak eritin. Daha sonra, anestezik etki gösterene kadar sıçanı, bir bire bir izofluran-oksijen karışımı içeren bir hazneye yerleştirerek anestezi uygulayın. Kasların gevşediğini ve pedal reflekslerin kaybolduğunu kontrol ederek anestezinin gerçekleştiğini doğrulayın.

Gaz karışımına bağlı bir burun konisi kullanarak cerrahi işlem boyunca anestezi durumunu sürdürün. Cerrahi alanı, operasyon boyunca steril teknik kullanarak Betadine ve %70 etanol ile temizleyin. Sıçanı dorsal pozisyona getirin ve künt diseksiyon uygulayarak sternumun üzerindeki boyun deri tabakası boyunca dikey bir insizyon yapın.

Sağ karotis arterini açığa çıkarmak için fasyayı ayırın. Sağ karotis arter, köprücük kemiklerinin üzerinde, orta hattın hemen sağında yer alır. Arteri boyun boşluğundan dikkatlice yukarı çekin ve açığa çıkan sefalik ucundan bağlamak için arterin altına iki adet 10 santimetre uzunluğunda ipek sütür yerleştirin.

Ardından, kanamayı önlemek için artere bir klips takın. Pens kullanarak, kateter yerleştirici ile arterin üst kısmında küçük bir delik açın. Kateterin mühürlenmemiş ucunu arterdeki delikten içeri yerleştirin.

Klipsi çıkarın ve kateteri kalbe doğru itin. Uygun şekilde yerleştirildiğinde, dirençle karşılaşana kadar kateter arter içine dört ila beş santimetre uzanmalı ve sıçanın kalp atışıyla birlikte nabız vermelidir. Kateter yerleştirildikten sonra, arterin distal ucuna gevşek bir sütür bağlayın ve kateteri sabitleyin.

İpek sütür kullanarak fazla sütür ve kateter uçlarını kesin ve ardından uçları boyun derisinin altına yerleştirin. Deriyi deri klipsleri ile kapatın. Sıçanı temiz bir kafese yerleştirin ve anesteziden tamamen uyanana kadar sıcak bir yerde tutun.

Sıçana yiyecek ve su sağlayın ve hem iyileşme süreci boyunca hem de sonrasında sıçanı sık sık kontrol edin. Enfeksiyon işlemi cerrahiden bir ila yedi gün sonra gerçekleştirilebilir, ancak süre deneyler boyunca tutarlı tutulmalıdır. Sıçanın kuyruğunu %70 etanol ile temizleyin ve istenen hücreye 0,5 mililitre MRSA kültürü enjekte edin.

Kuyruk venine enjekte edin. 27 gauge yarım inçlik bir iğne kullanarak, sıçanı kafesine geri götürmeden önce kanama durana kadar enjeksiyon bölgesine baskı uygulayın. Sıçan sakrifiye edildikten sonra, göğüs bölgesini %70 etanol ile silin ve ardından sternumun altındaki göğüs bölgesine V şeklinde bir insizyon yapın.

Sternumun her iki yanındaki kaburga kıkırdaklarını kesin. Kalbi açığa çıkarmak için kalbi nazikçe yukarı çekin, aortaya yakın dokuyu klipsleyerek kesin ve kalbi serbest bırakmak için yukarı doğru diseke edin. Kalbi, 4x4 inçlik gazlı bez serilmiş steril bir petri kabına yerleştirin, ardından sol ventrikül iç duvarı boyunca bir kesi yaparak sol tarafındaki kamarayı açın.

Kateterin doğru yerleştirildiğini onaylayın ve ardından kateteri çıkarın. Kapakçık üzerindeki vegetasyonları makas ve pens yardımıyla inceleyip temizleyin. Ayrıca böbrekleri ve dalağı çıkarın; dokuları ve vegetasyonları tartıp homojenize ettikten sonra, kantitatif kültür için PBS içerisinde seri dilüsyonlar hazırlayın.

Burada, en soldaki okun gösterdiği gibi doğru konumlandırılmış bir kateter görülmektedir. Kateter, aort kapağını geçerek kalp boşluğunun sol tarafına uzanmaktadır ve orta ile sağdaki okların gösterdiği üzere aort kapaklarının etrafında çok sayıda vejetasyon görülmektedir. Bu tablo, sıçan endokardit modelinde bir ssus suşunun virülansına dair bir örnek sunmaktadır.

10⁵ ve 10⁶ CFU'luk inokülumla enfekte edilen tüm hayvanlarda, kalp vejetasyonlarının yanı sıra böbrek ve dalakta yüksek ssus yoğunlukları ile seyreden endokardit gelişmiştir. Bu cerrahi prosedür, uygun şekilde uygulandığında 10 dakika içinde tamamlanabilir.

Bu prosedür uygulanırken, cerrahi sırasında ve sonrasında hayvanın değerlendirilebilir bir durumda tutulmasının önemli olduğunu unutmamak gerekir. Antimikrobiyal ajanların etkinliğinin gerçek zamanlı izlenmesi ve gelişim sonrası in vivo gen ekspresyonu gibi ek soruları yanıtlamak için ivus gibi yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, stem orus ve fiction alanındaki araştırmacıların endovasküler enfeksiyondaki patojenik virülans faktörlerini keşfetmeleri için bir yol olabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, sıçanlarda deneysel endokardit modelinin nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. MRA ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken laboratuvar önlüğü ve eldiven giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.