Endotel Colony Forming Hücrelerinin Fenotipik ve Fonksiyonel Karakterizasyonu İnsan Göbek Kordonu Kanı türetilen

Bu prosedürün genel amacı, insan göbek kordonu kanından endotelyal koloni oluşturan hücrelerin veya e CFC'lerin nasıl türetileceğini açıklamaktır. Bu, önce göbek kordonu kanından mononükleer hücrelerin kaplanması ve daha sonra E CFC'lerin koloni büyümelerinin klonlanması ve genişletilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, klonal proliferatif potansiyel için yeni bir tek hücre tahlil tekniği kullanarak hücreleri in vitro olarak karakterize etmektir.

Son olarak, hücreler, nod skid farelerinde E CFC'leri içeren jellerin üretimi ve implantasyonu yoluyla in vivo bir damar oluşturma testinde karakterize edilir. Sonuç olarak, de novo konak kanı dolu damarların in vivo oluşumu, hücresel implantlar içeren ECFC'nin h ve e boyaması ile değerlendirilebilir. Bu tekniklerin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bu yöntemlerin endotel hücrelerinin proliferatif potansiyelinin tek hücre düzeyinde incelenmesine olanak sağlamasıdır.

Bu tekniğin sonuçları, feral arter hastalığı veya PAH gibi hastalıklar için tanı ve tedavi araçları bulmaya doğru genişletilebilir, çünkü bu teknik, bir hastanın endotel hücrelerinin proliferatif potansiyelini ve genetik kapasitesini incelememize izin verir. Prosedüre başlamadan önce, bir mililitre sıçan kuyruğu kollajeni ekleyin, altı kuyucuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğuna bir tane yazın ve daha sonra plakayı işlem günü gece boyunca inkübe edin, kordon kanını 15 mililitrelik birimler halinde 50 mililitrelik konik santrifüj tüplerine ayırın. Daha sonra her tüpe 20 mililitre PBS ekleyin ve karışımı birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.

Daha sonra, 15 mililitre fial PA'yı bir pipete çekin, pipetin ucunu seyreltilmiş kan tüpünün dibine yerleştirin ve alpakın altına dikkatlice yerleştirin, tüpleri 30 dakika boyunca oda sıcaklığında 740 kez G'de 740 dakika santrifüjleyin, yavaşlama freni ayarı olmadan. Hücre ayrılmasından sonra, fial tepe noktası ile seyreltilmiş plazma arasındaki arayüzde bulunan düşük yoğunluklu mononükleer hücrelerin puslu tabakasını çıkarmak için bir transfer pipeti kullanın. Toplanan hücreleri 10 mililitre E GM iki ortam içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe dağıtın ve mononükleer hücreleri yüksek yavaşlama fren ayarı ile oda sıcaklığında 515 kez G'de 10 dakika boyunca peletleyin, süpernatanı dikkatlice aspire edin ve atın.

Daha sonra peletlenmiş hücreleri EGM ile iki kez resus ile yıkadıktan sonra, bunları askıya alın EGM ikide mononükleer hücreler 1.25 çarpı 10 ila mililitre başına yedinci hücreler. Şimdi, kollajen kaplı plakanın her bir oyuğuna dört mililitre mononükleer hücre süspansiyonu pipetleyin ve hücreleri ilk gün koloniler oluşana kadar inkübe edin. İnkübe ettikten sonra, gevşek bir şekilde yapışan hücreleri rahatsız etmeden, harcanan ortamı bir pipetle kuyulardan yavaşça çıkarın.

Daha sonra dikkatlice dört mililitre E GM, iki tanesini kuyucuklara ekleyin ve plakayı inkübatöre geri koyun. Koloniler tipik olarak işlemden bir gün önce beş ila 14. günler arasında ortaya çıkar. 50 mikrolitre sıçan kuyruğu kollajeninde.

Daha önce olduğu gibi 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bir tane yazın ve plakayı işlem günü gece boyunca inkübe edin. PBS ile sadece iki ila üç kez geçirilen hücreleri iki kez yıkayarak başlayın. PBS'nin son yıkamasını aspire ettikten sonra, her koloninin etrafına steril jel kaplı bir klonlama silindiri yerleştirin ve her silindiri steril forseps kullanarak plakaya sıkıca bastırın.

Her klonlama silindirine iki ila üç damla ılık üçlü E ekspresi ekleyin ve hücreler ayrılmaya başlayana kadar silindirleri üç ila beş dakika inkübe edin. Hücreler yaklaşık 250 mikrolitre EGM'de ayrılmaya başladıktan sonra, silindirin merkezine iki ortam yerleştirilir ve tek hücre süspansiyonu oluşturmak için yukarı ve aşağı pipetlenir. Şimdi tek hücreli süspansiyonu her bir klonlama silindirinden ayrı ayrı ayrı ayrı bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Hücreleri altı oyuklu bir plakada EGFP eksprese eden lentivirüslerle enfekte edin ve EGFP'yi eksprese eden hücreleri floresan sitometri ile toplayın. Daha sonra EEG FP pozitif hücreleri ve EGM ikisini kollajen kaplı plakalarda inkübe edin. E CFC'ler hazır olduğunda, az önce gösterildiği gibi trip E ekspresini kullanarak toplayın ve hücreleri ve e GM'yi iki ortamı mililitre başına yaklaşık 10 ila altıncı hücrelik bir nihai konsantrasyona kadar askıya alın.

Daha sonra, saniyede 20 hücrelik düşük akış hızına sahip bir akış sıralayıcı kullanarak, önceden hazırlanmış kollajen kaplı 96 oyuklu plakaya kuyucuk başına tek bir EGP pozitif ECFC'yi sıralayın, her bir oyuğun nihai hacmini EGM ile kuyu başına iki ila yaklaşık 200 mikrolitre olarak ayarlayın. Ardından, her bir oyuğun yalnızca bir hücre içerdiğinden emin olmak için ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanın. Kültürün 14. gününde iki medya değişikliği ile tabağı iki haftalık bir süre boyunca inkübe edin.

Hücreleri 30 dakika boyunca 100 mikrolitre% 4 paraform aldehit ile sabitlemeden önce her bir kuyuyu 100 mikrolitre PBS ile yıkayın. EGFP'yi ifade etmeyen e CFC'ler için, para formaldehit fiksasyonunu takiben yeşil bir floresan nükleer boya olan cyt reaktifi ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Burada gösterildiği gibi genişlemiş endotel hücrelerinin sayısını gözle görülür şekilde ölçmek için bir floresan mikroskobu kullanın: endotel hücre sayısı iki ila 50 arasında olan kuyucuklar endotel hücre kümeleri olarak kabul edilir.

51 ila 2000 hücreli kuyular düşük proliferatif potansiyele sahip e CFC'lerdir ve 2001 veya daha fazla hücreye sahip kuyular yüksek proliferatif potansiyele e CFC'ler olarak kabul edilir. Hücreleri daha önce olduğu gibi üçlü E ekspresyonu ile ayırdıktan sonra, hemo, sitometre ve trian mavisi ile hücre kültürünün canlı bir hücre sayımını elde edin. 2,4 milyon canlı hücreyi 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve daha sonra hücreler döndürülürken hücreleri santrifüjleme ile peletleyin.

Jel matrisi bileşenlerini iyice karıştırın ve ardından çözeltiyi buz üzerinde tutarken pH'ı sodyum hidroksit ile 7.4'e ayarlayın. Süpernatanı attıktan sonra, peleti 360 mikrolitre ılık e GM ikide yeniden süspanse edin. Daha sonra hücrelere 840 mikrolitre jel matris çözeltisi ekleyin ve hücreler jel içinde iyice süspanse olana kadar çözeltiyi dikkatlice karıştırın Bu bir mililitre hücreselleştirici jel süspansiyonunu 12 oyuklu bir doku kültürü plakasının bir kuyucuğuna aktarın ve jel polimerize olana kadar plakayı inkübe edin.

Daha sonra gece boyunca inkübe etmeden önce, jeli ertesi gün ve implantasyondan hemen önce iki mililitre ılık EGM ile nazikçe örtün. Jeli iki eşit parçaya ayırmak için iris makası kullanın ve jel parçalarını e GM iki ortam içeren aynı kültür kuyusuna geri koyun. Ayak parmağı çimdikleme ile sedasyonu onayladıktan sonra, beş ila altı haftalık anestezi uygulanmış bir başını sallayın, fareyi kaydırın ve alkol ve betadin pedlerini döndürerek cerrahi bölgeyi iyice temizleyin.

Daha sonra, karnın alt çeyreğinde yaklaşık beş milimetrelik bir kesi yapmak için steril keskin iris makası kullanın ve cilt ile karın kası arasındaki deri altı boşluğunu açığa çıkarın. Kör. 15 ila 20 milimetre genişliğinde cepler oluşturmak için karın kasından dermal tabakayı karın kasından diseksiyon yapın, biri üst karın kadranına ve diğeri karnın başka bir bölgesine çıkar. Sonra dermal tabakayı kaldırarak, sadece insizyona sarın.

Jelin bir yarım parçasını bir karın cebine, diğer yarım jel parçasını diğer karın cebine yerleştirin. Jeller yerleştirildikten sonra, bir kesme iğnesi üzerinde beş oh polipropilen sütür kullanarak her kesiyi iki ila üç dikişle kapatın. Kafes kartlarını etiketleyin ve kurumsal ve protokol gerekliliklerine göre cerrahi sonrası izleme ve analjezi gerçekleştirin.

İmplantasyonun 14. gününde hayvanı kurban ettikten sonra, farenin karnını alkollü pedlerle temizleyin ve cildi orijinal kesi hattına sıkıca kesin. Daha sonra, jellerin olası konumuna yapışan deri fleplerini çıkarın. Her bir implantı çıkarmak için jellerin etrafını dairesel olarak keser ve ardından eksize edilen implantları çinko fiksatife yerleştirir.

Bu ECFC türetme tekniğini kullanarak, beşinci gün gibi erken bir tarihte birincil koloni oluşumunun büyümesini gözlemledik. Ok uçlarıyla gösterildiği gibi bu beş ECFC kültürünün parke taşı morfolojisine dikkat edin. Genişlemiş koloniler endotelyal antijenleri eksprese eder, ancak hematopoietik antijenleri eksprese etmez.

Endotelyal ve hematopoietik hücrelerin bu temsili in vitro fenotipik değerlendirmesinde gösterildiği gibi, immünofenotipleme, e CFC'lerin CD 31, CD 34, CD 1 44, CD 1 46, FL bir, flick one, flip four ve NRP iki gibi endotelyal antijenleri eksprese ettiğini, ancak hematopoietik antijenleri, CD 45, CD 14, CD 11, BC Kit CXCR dört veya CD 1 33'ü eksprese etmediğini ortaya koymuştur. Daha da önemlisi, bu çubuk grafikte temsil edildiği gibi, genişletilmiş koloniler, tek hücre düzeyinde, iki ila 50 hücreli kümelerden 2001'den büyük kolonilere kadar değişen tam bir klonal proliferatif potansiyel hiyerarşisi sergiler. Yeşil floresan bir nükleer boya olan cyt ile boyanan kolonilerin bu mikrografları, kordon kanından türetilen E CFC'lerin 14 gün boyunca tek hücre düzeyinde kültürlenmesinden sonra elde edildi.

Ayrıca, e CFC'ler, immün yetmezliği olan farelere implante edildiğinde konakçı kırmızı kan hücreleri ile perfüze edilen insanlaştırılmış kan damarları oluşturur. Bu h ve e lekelenmesinde, CELLULARIZE jel implantlar içeren kordon kanı türevi ECFC, implantasyondan 14 gün sonra kollajen fibronektin jeli içinde oluşan konak kırmızı kan hücreleri ile dolu mikro damarlar gözlenebilir. Burada, kahverengi renkteki anti-insan CD 31 boyaması, bu damarların insan kökenini daha da doğrulamaktadır.

Bu videoyu izledikten sonra, insan göbek kordonu kanından e CFC'lerin nasıl türetileceği ve geliştirildikten sonra ECFC kolonilerinin işlevselliğinin nasıl klonlanacağı, genişletileceği ve karakterize edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu teknik, vasküler endotel araştırmacılarının birden fazla kaynaktan elde edilen endotel hücrelerinin endotelyal klonal proliferatif potansiyelini ve genetik kapasitesini keşfetmelerinin yolunu açtı.