Name: Endotel Colony Forming Hücrelerinin Fenotipik ve Fonksiyonel Karakterizasyonu İnsan Göbek Kordonu Kanı türetilen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 46 s
Description: Öğrenin, insan göbek kordonu kanından endotelyal koloni oluşturan hücrelerin (ECFC) türetilmesi ve karakterizasyonu için bu yöntemi. Tek hücreli proliferasyon potansiyeli ve in vivo damar oluşumu yeteneği değerlendirilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr Yoder EndGenitor Technologies, Inc için danışman ve Rimedion Technologies, Inc yönetim kurulu üyesidir

Reaktifler ve Çözümleri EMG-2 medya (Lonza, Kat. Cc-3162 EBM-2 bazal, orta ve EGM-2 SingleQuot kiti Takviyeler, ve büyüme faktörleri içeren) EBM-2 (Lonza, Cat No. Cc-3156), tüm SingleQuot kiti takviyesi ve büyüme faktörleri ile desteklenmiş (Lonza, Cat No. Cc-4176), 10% (v / v) sığır cenin serumu (FBS) ve 1% (v / v) penisilin (10.000 U / ml) / streptomisin (10,000 ug / ml) / amfoterisin (25 ug / ml). 4 ° C de 1 ay kadar saklayabilirsiniz Sürece ECFC kültür için kullanılması önerilir EGM-2 cilt, 500 ul / kuyu 24-iyi plakalar, 2 ml / 6-iyi plakaları, 5ml/25-cm 2 matara, ve 10 ml/75-cm 2 matara içindir Aksi protokolü belirtilen. Kollajen Ben çözüm Steril damıtık su 495 ml (0.02 N son konsantrasyon) buzlu asetik asit (17.4N) ile 0,575 ml seyreltilir. 0.22-mikron süpürge ile Steril filtre seyreltik asetik asitUUM filtreleme sistemi. 50 ug / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyona seyreltik asetik asit, 25 mg, fare kuyruk kolajeni I ekleyin. Kollajen miktarı kollajen stoku konsantrasyonuna bağlı olarak değişecektir eklendi. 4 ° C de bir ay kadar saklayın Kollajen I-kaplı doku kültür yüzey hazırlanması 6-sıra doku kültürü plakası (/ de 24-iyi plakaları, 3ml/25-cm 2 matara, ve 8 ml/75-cm 2 şişeler için 300 ul kullanın) her iyi kollajen I çözeltisi yerine 1 ml. 37 &#39;de bir gece için 1 saat inkübe ° C. Kollajen Ben çözümü çıkartın ve PBS (6-iyi plakaları, 5ml/25-cm 2 matara, ve 10 ml/75 için ul / kuyu 24-iyi plakalar, 2 ml / 500 kullanan yüzey iki kez, her zaman yıkayın -cm 2 şişe). Hücre kültürleri için hemen tabak kullanın. FACS boyama tamponu Salin (PBS) 2% (v / v) sığır cenin serumu (FBS) eklenmiş fosfat tamponlu. Mağaza u4 az 2 hafta p ° C A. ECFC akıbet, Klonlama ve Genişletme <ol><li> Oda sıcaklığında laboratuvara bir antikoagülan ve ulaşım gibi heparin (10 U heparin / ml kan) veya EDTA ile CB toplayın ve mononükleer hücre (MNC) izolasyonu için hemen (bebeğin teslim 2 saat içinde) sürecini örnek. </li><li> Tablet 15 Her 50 ml konik santrifüj tüpüne CB ml ve karıştırmak için CB ve pipeti birkaç kez her tüp için PBS 20 ml ekleyin. 20 ml bir şırınganın içine 15 ml Ficoll-Paque hazırlayın ve 20G iğne veya karıştırma kanül takın. Seyreltilmiş kan tüpün altında karıştırma kanülün ucu yerleştirin ve dikkatli bir şekilde 15 ml Ficoll-Pague altlık. Yavaşlama fren ayar olmadan, oda sıcaklığında, 740 x g&#39;de tüpler 30 dakika santrifüj edilir. </li><li> Bir transfer pipet kullanarak, Ficoll-Paque ve nispi plazma arasındaki kesişme noktasında bulunan düşük yoğunluklu ÇUŞ&#39;ların puslu katmanı kaldırın. 50 ml konik tüp devam içine ÇUŞ Dağıtma10 ml EGM-2 orta aining. Yüksek bir yavaşlama fren ayarı ile, oda sıcaklığında, 515 x g&#39;de 10 dakika santrifüje ÇUŞ&#39;lar. </li><li> Dikkatlice aspire ve supernatant atın. Iki kez EGM-2 (515 xg&#39;de 10 dk) ile pelet hücreleri yıkayın ve 1.25 x 10 7 hücre / ml EGM-2&#39;de çok uluslu şirketler yeniden askıya. Kollajen hazırlayın 1 ml sıçan kuyruğu kollajen tip I (50 mg / ml) eklenerek başına iyi ve geceleme plaka kuluçkaya I kaplı 6-sıra doku kültürü tabak. Pipetle 4 her oyuğuna Bu MNC süspansiyon 37 ml ve hücreler yerleştirmek ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübatöründe nemlendirilmiş. A.1.5) 24 saat sonra (1. gün), yavaş bir pipet yardımıyla kuyudan harcanan orta (gevşek yapışmış olan hücrelerin rahatsız etmeyin) çıkarın, yavaş yavaş iyi 4 ml EGM-2 ekleyin ve inkübatör için plaka dönüş . Gün 2, yenileme yavaş bir pipet yardımıyla kuyudan orta (gevşek yapışmış olan hücrelerin rahatsız etmeyin) kaldırılması ve 4 ml EGM-2, her kuyuya ekleyerek orta. Orta değişiklik günlük un tekrarlayınGün 7 ve her geçen gün til ECFC koloniler klonlama için görünür sonra kadar. Tipik olarak koloniler günde 5 ve gündüz 14 gün 7 (Şekil 1) arasında görünür. </li><li> Inverted mikroskop kullanarak arnavut morfolojisi ile tipik ECFC koloniler gözünüzde canlandırın (10x büyütme) ve her koloninin konumunu belirtmek için de alt tarafında bir işaretleyici ile koloni sınırları işaretleyin. </li><li> 14. günde, PBS ve klonlama silindir kullanılarak hasat bireysel koloniler ile bu birincil koloniler 2 kez yıkayın ve yeterli silindir içindeki hücreleri kapsayacak şekilde ifade TrypLE. PBS son yıkama aspire sonra, her koloni çevresinde steril jel kaplı klonlama silindir yerleştirin ve steril forseps kullanarak plaka karşı sıkıca bastırın. Silindir içindeki hücrelerin ayırmak alıncaya kadar 3-5 dakika, her klonlama silindir ve inkübe içine sıcak TrypLE ekspres 2-3 damla ekleyin. Silindirin merkezine yaklaşık 250 ul EGM-2 orta ekleyin ve g yukarı ve aşağı pipetlemetek bir hücre süspansiyonu enerate. Tek bir mikro-santrifüj tüpüne ayrı ayrı klonlama tüpten tek hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> Kalan tüm hücreleri toplamak ve ilgili mikro-santrifüj tüpüne her silindir gelen yıkama aktarmak için yaklaşık 250 ul EGM-2 orta silindirin içinde 2-3 kez yıkayın. 5 dakika santrifüj masa üzerinde yüksek hızda (≤ 300 xg) olarak hücreleri santrifüjleyin. </li><li> 1.5 ml taze EGM-2 orta süpernatantı ve yeniden askıya hücre pelletini. 500 uL sıçan-kuyruk kolajeni I (50 ug / ml) ile önceden kaplanmış bir 24-kuyucuklu doku kültürü plakası ve her birinin içine tüpten hücre süspansiyonu (bireysel koloniler bütün hücre içeren) aktarılır. </li><li> Medya ile genişleme için inkübatör içindeki yeri her geçen gün yapılan değişir. </li><li> Hücrelerin% 80-90 konfluense yaklaştığınızda, PBS ile hücreleri yıkayın daha sonra 2 kez harcanan aracı kaldırmak ve her kuyuya 500 mikrolitre TrypLE ekspres orta ekleyin24-kuyucuklu doku kültürü plakası. Hücreler kadar yuvarlak ve ayırmak alıncaya kadar 3-5 dakika süreyle inkübatör içinde plakası yerleştirin. Yıkama ile hücreleri toplamak ve 15 ml tüp aktarmak için her kuyuya EGM-2 1 ml (% 10 FBS tanımlanmış olarak) ekleyin. Kalan tüm hücreleri toplamak ve ilgili 15 ml tüp içine her kuyudan yıkama aktarmak için 1 ml EGM-2 orta ile iyi yıkayın. 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüje hücreleri. </li><li> 1 ml taze EGM-2 orta (% 10 tanımlanan FBS ile) orta çıkarın ve yeniden askıya hücre pelletini. Bir hemasitometre ve tripan mavi dışlama kullanarak Tümbölenin canlı hücre sayısını edinin. </li><li> Hücrelerin tekrar alt-kültüre önce konfluense% 80-90 yaklaşmak kadar medyada her gün değiştirmek ile EGM-2 medya Ben önceden kaplanmış doku kültürü yüzeyler kollajen üzerine yaklaşık 5000 hücre / cm 2 tohumlayarak hücreleri genişletin. </li></ol> ECFCs in vitro Fenotipik Karakterizasyonu B.: Endotel Hücre Yüzey Antijen İfade birklonal Proliferatif Potansiyel d Tek Hücre Testi <ol><li> Endotel hücre yüzey antijeni ifadesi için, ECFC klonlama ve genişleme için açıklanan yöntemleri kullanarak hücreleri toplamak için TrypLE ifade ile hücreleri ayırmak. </li><li> FACS boyama tamponu yeniden askıya hücreler (10 X 10 6 hücre / tampon boyama 1ml FACS) sonra FCR engelleme reaktifi (20 ul / 10 X 10 6 hücre) ekleyin, 10 dakika süreyle buz üzerinde nazikçe ve yerde karıştırın. </li><li> Her bir endotel yüzey antijeni ve izotip kontrolleri için mikro-santrifüj tüpündeki bu hücre süspansiyonu kısım 100 ul. . 1 X 10 6 hücre: endotel antijenleri (CD31, CD144, CD146 ve CD105) veya hematopoetik antijenleri (CD45, ve CD14) tanımak ve ışıktan koruyarak 30 dakika boyunca buz üzerinde terk florokrom etiketli insan monoklonal antikorlar uygun miktarda Dikkat ekle her bir test için gerekli değildir. Yazarlar genellikle 10 4 analiz 2 X elde etmek için 0.5 ile 1 X 10 5 hücre / tüp hazırlamakd olaylar. Ayrıca, her bir test için kullanılacak antikor miktarını için Üreticiler tavsiyesini izleyin. Bazı antikorlar uygun antikorun konsantrasyonunu belirlemek için titre gerektirebilir. Yazarlar gerçekleştirdiğinizi Tüm boyama tek renkli boyama vardır. </li><li> Buz üzerinde 30 dakika inkübasyondan sonra, 5 dakika süre ile, bir tezgah üstü santrifüj üzerinde yüksek hızda santrifüj tüpünün her biri daha sonra süpernatan kaldırmak ve FACS tampon içinde tekrar askıya hücre peleti. </li><li> Her bir antijen için olumlu veya olumsuz leke hücrelerin yüzdesi belirlemek için bir akış sitometresinde örnekleri analiz edin. ECFCs CD31, CD144 ve CD146 için eşit pozitif leke, ancak CD45 ve CD14 negatif ilgili izotip kontrollere göre. </li><li> Klonal bir proliferatif potansiyelini incelemek için tek bir hücre deneyi için, ECFC klonlama ve genişlemesi için tanımlanmış benzer yöntemler kullanarak hücreleri toplamak için TrypLE ifade ile erken geçişi (2-3) hücreleri ayırır. </li><li> Bu hücreleri enfektegelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) Lentivirüs 16 ifade ve floresan sitometri ile EGFP ifade hücreleri toplamak Dikkat:. lentivirüs çalışma ise çeker ve tüm biyo-güvenlik önlemlerine uyulmalıdır kabul edilir. </li><li> Kültür onları ECFC genişleme bölümünde kültür ECFC için nitelendirdi. </li><li> 50 ul sıçan kuyruğu kollajen tip I (50 mcg / ml) başına da ekleyerek Kolajen I kaplı 96-tabak hazırlayın ve geceleme plaka inkübe. TrypLE ifade kullanarak EGFP + ECFCs toplayın ve son konsantrasyonu ~ 10 6 hücre / ml ile EGM-2 orta onları tekrar süspansiyon. </li><li> Tek EGFP + ECFC başına iyi bir 96-plaka sıralamak ve EGM-2 ile başına iyi 200 ul nihai ses seviyesini ayarlamak için 20 hücre / saniyenin düşük debi ile FACS Vantage (Becton Dickson) veya diğer benzer sıralayıcı kullanın. Her iyi yalnızca bir hücre aldığınızdan emin olmak için ters bir floresan mikroskop kullanın. Alternatively, tek hücre FSC ve SSC ve koloniler hücre puanlama ve miktar tayini için kullanılan boyama Sytox nükleer boya göre sıralanabilir. </li><li> 5. gün ve 10. günde yapılan iki ortam değişiklikleri (200 ul EGM-2 ile çok kanallı pipetter) ile iki haftalık bir süre içinde plaka inkübe edin. Kültür 14. günde, 30 dakika için% 4 paraformaldehit 100 ul sahip hücrelerin sabitleme önce 100 ul PBS ile birlikte, her sıra yıkanır. EGFP ifade değildir ECFCs için, 4 ° C&#39;da paraformaldehit fiksasyon ve inkübe ardından Sytox reaktifi, yeşil floresan nükleer boya ekleyin. </li><li> 14 gün kültüre tek bir hücreden genişletilmiş endotel hücrelerinin sayısı ölçmek için, her sıra incelemek için flöresanlı bir mikroskop kullanabilir. Kantitatif analiz için, skoru pozitif olarak 2 veya daha fazla endotel hücreleri (silahlanma) ile kuyu ve floresan mikroskop ile görsel sayım toplam endotel hücre sayımı için onları biraz daha inceleyin. </li><li> T görüntülemek için2, 50, 51-2000, ve 2001 veya daha fazla olarak kabul edilir: O bir endotel hücre sayısı ile veri, kuyular elde edilen endotel hücre kümeleri, düşük proliferatif potansiyel (LPP)-ECFCs ve yüksek proliferatif potansiyel (HES) - sırasıyla ECFCs. ECFCs 14 gün boyunca tek bir hücre düzeyinde kültüre zaman endotel kümeleri, LPPS ve hidroelektrik santrallerde yol vererek klonal bir proliferatif potansiyeli tam hiyerarşisi sergilerler. 7 </li></ol> In vivo Gemi Oluşumu deneyi vaskülojenez için ECFC Potansiyeli inceleyin: ECFCs in vivo Fonksiyonel Karakterizasyonu C. <ol><li> FBS (10: 1 ml jel (ki daha sonra 2 implantlar oluşturmak üzere ikiye edilecektir) döküm için gerekli Aşağıdaki jel malzeme her birinin toplam hacmi (ml) (parantez içinde nihai konsantrasyon) ile hesaplayarak cellularized jel implantlar hazırlamak %), 2-EBM 10:01 (1 ml nihai hacme ayarlamak), sodyum bikarbonat (1.5 mg / ml), NaOH (7.4 pH ayarlama), HEPES (25 mM), fibronectin (100 ug / ml) ve kollajen I (1.5 mg / ml). </li><li> Jel malzeme hesaplama sonra, ECFC klonlama ve genişlemesi için tanımlanmış benzer yöntemler kullanarak hücreleri toplamak için TrypLE ifade ile hücreleri ayırmak. Bir hemasitometre ve tripan mavi kullanarak bir kısım bir canlı hücre sayısını edinin. Bir 50 ml-konik bir tüp ve pellet 515 x g, oda sıcaklığında, santrifüj yoluyla hücre içine 2.400.000 yaşayabilir hücrelerin transfer edin. Aynı zamanda, bir buz 50 ml konik tüp (listelendikleri aynı sırayla) hesaplanan HEPES hacimleri, sodyum bikarbonat, EBM-2 10:1, FBS, fibronektin ve kollajen ekleyerek jel matris solüsyon hazırlanır. İyice karıştırın ve buz üzerinde çözüm tutarken NaOH ile 7.4 &#39;e pH ayarlayın. </li><li> Santrifüjlemeden sonra hücreler arası Süpernatant atılır ve 360 ​​ul sıcak EGM-2 içinde tekrar askıya pelet ve buna pH jel implant 1 ml nihai hacme verme, jel matris solüsyon 840 ul ayarlanabilir eklemek. Kadar yavaş yavaş jel matris çözüm içine hücreleri karıştırınhücreleri iyice jeli çözeltisi içinde süspanse edilmektedir. </li><li> 12 iyi doku kültürü plakası ve 20-30 dakika süreyle inkübe jel polimerize kadar iyi biri bu 1 ml cellularized jel süspansiyon aktarın. Yavaşça 2 ml ılık EGM-2 ile jel kapağı ve bir gece inkübe edin. </li><li> Hemen implantasyon öncesi, iris makası kullanarak iki eşit parçaya gecede İnkübe jel ikiye ayırmak ve iyi EGM-2 içeren ortamda aynı kültüre jel adet döner. </li><li> Izoflurandan idare tarafından (5-6 haftalık NOD / SCID farelerinde) oturaklı hayvana hayvan cerrahi tesisi kullanın. Karnın alt kısmı Tıraş ve iyice alkol pedleri ve betadin veya diğer antiseptik ile cerrahi alan temizleyin. Sonra IACUC ve kurumsal düzenlemeler uyarınca perdeler alanı izole. </li><li> Deri ve karın kas arasındaki subkutan boşluk açığa karın alt kadranda yaklaşık 5 mm kesi yapmak için steril keskin iris makası kullanarak. Üst kadranda içine üstün giden 15-20 mm genişliğinde cep oluşturmak için karın kas deri katmanı sayesinde küt diseksiyon gerçekleştirin. Aynı fare karnın başka bir tarafı da benzer açık cep oluşturmak için benzer işlemi tekrarlayın. </li><li> Insizyon sadece kaudal dermal tabaka kaldırarak karın cebinden başka bir tarafı içine bir yarısı karın cebinden bir tarafı haline jel parçası ve jel bir yarım parça takın. </li><li> Jellerin yerleştirildikten sonra, bir kesim iğne 5-0 polipropilen sütür ile 2-3 dikiş ile her kesi kapatın. Uygun kafes kartları etiketlemek ve kurumsal ve protokol ihtiyaçlarına göre ameliyat sonrası izleme ve analjezi gerçekleştirmek ve bu implante jel hücreleri için 14 gün de novo damar oluşturmasını sağlar. </li><li> Son olarak, jel implantları hasadı genellikle fare euthanizing 14 gün sonra implantasyon sonra gerçekleştirilir. </li><li> Swab karın alkol ped ile alanı veorijinal kesi hattı kaudal karın cildi kesilir. Dikkatle, jel olası konum cilt kaudal bir flep eksize tarafından implantı incelemek. Sonra jel çevresinde çevresel çinko sabitleştirici yer (BD Biosciences, en iyi sonuçlar için üretici firmanın tavsiye izleyin) kesme ve oda sıcaklığında 1-2 saat düzeltmek için izin ile Özel Tüketim implant. </li><li> Histokimyasal standart protokolleri kullanarak parafine gömülü jeller hazırlayın ve hematoksilen ve eosin, jel içinde damarlarda görselleştirmek için anti-insan CD31 ya da anti-fare CD31 ile boyama gerçekleştirmek için cam slaytlar üzerinde 5 mm kesitler hazırlamak. ECFCs humanize gemileri üretmek için de novo vaskülojenez tabi cellularized jel implantlar 14 gün 4,8,11 için immün farelere içine yerleştirilir. </li></ol> D. Örnek Sonuçlar Birincil koloni formun bu ECFC türetme tekniği kullanarak Gözlemlediğimiz dışı büyüme5. gün (Şekil 1) gibi erken ation. Dışarı-büyüme ECFC koloniler tipik arnavut görünüm sergilendi ve klonlama tarafından koloni alma sonrası uzun dönemde genişlemesi üzerine,&gt; 40 nüfus çiftlenmeler doğurdu. Genişletilmiş koloniler endotelyal antijenleri ifade, ama (Şekil 2) hematopoetik antijenleri ifade vermedi. Önemlisi, bir tek hücre düzeyinde (Şekil 3) klonal bir proliferatif potansiyeli tam bir hiyerarşisi görüntülenir. Dahası, ECFCs immün fareler 4, 6, 8, 11 (Şekil 4) içine yerleştirildi zaman ana eritrositler ile perfüze edilmiştir hümanize kan damarlarının oluşmuştur. <img alt="Şekil 1.." src="/files/ftp_upload/3872/3872fig1.jpg" /> Şekil 1.. Endotel koloninin kordon kanı ve akıbet gelen mononükleer hücrelerinin izolasyonu (ÇUŞ) kordon kanı hücrelerinin Ficoll-Pague yoğunluk gradiyenti ayrılması sırasında kültürlü ÇUŞ. ÇUŞ formu buffy tabaka tabaka hücreleri (ECFCs) oluşturan. Sıçan kuyruğu kollajen kültür üzerindeki çok uluslu şirketler için buffy coat tabakasının Yalnızlık 5 ila 14 gün içinde ECFC koloninin akıbet kaplamalı plakalar sonuçları. Outgrowth ECFC koloni (ok başları ile gösterilir) arnavut morfolojisi 7 görüntülenir. <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3872/3872fig2.jpg" /> Şekil 2. Endotelyal ve hematopoetik hücre yüzey antijeni ifade vitro Temsilcisi fenotipik değerlendirmesi. Immünofeotipleme kordon kanından alınan ECFCs arasında ECFCs endotelyal antijenleri CD31, CD34, CD144, CD146, Flt-1, FLK-1, Flt-4 ve NRP2 ifade ama ortaya hematopoetik antijenler CD45, CD14, CD11b, cKit, CXCR4 veya AC133 7, 8 ifade vermedi. <img alt="Şekil 3." src="/files/ftp_upload/3872/3872fig3.jpg" /> Şekil 3. Clonogenic ve CB elde ECFCs proliferatif potansiyel in vitro ölçümde Temsilcisi. (A) kordon kanıKaynaklı ECFCs&gt; 2001 koloniler kadar 2-50 hücre kümeleri arasında değişen koloniler bir hiyerarşi ile klonal bir proliferatif potansiyeli gösterilecek. (B) koloniler (koloniler Sytox, daha kaliteli fotoğraf çekmek için yeşil floresan nükleer boya ile boyandı) hiyerarşisi Mikrografikleridir sonra elde edilen kordon kanı kaynaklı ECFCs 14 gün boyunca bir tek hücre düzeyinde kültüre edildi. Ölçek çubuğu 100μm 7, 8 temsil eder. <img alt="Şekil 4." src="/files/ftp_upload/3872/3872fig4.jpg" /> Şekil 4. Kordon kanından alınan ECFCs in vivo fonksiyonel karakterizasyonu Temsilcisi. Kord A) H &amp; E boyama kan kaynaklı cellularized jel implantları içeren ECFC mikrodamar (ana eritrositler ile dolu) implantasyonu 14 gün sonra kolajen-fibronektin jel oluşumu göstermiştir. B) Anti-insan CD31 boyama (kahverengi leke) daha bu gemilerin insan kaynaklı onaylar.

<ol><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473, 298-307 (2011).</li>
<li>Asahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+putative+progenitor+endothelial+cells+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.</a> Science. 275, 964-967 (1997).</li>
<li>Urbich, C., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells%3A+characterization+and+role+in+vascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology.</a> Circ. Res. 95, 343-353 (2004).</li>
<li>Critser, P. J., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+and+defining+cells+to+engineer+human+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Prolif%22%5BJournal%5D)">Isolating and defining cells to engineer human blood vessels.</a> Cell. Prolif. 44, 15-21 (2011).</li>
<li>Matthias, M., David, N., Josef, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+bench+to+bedside%3A+what+physicians+need+to+know+about+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">From bench to bedside: what physicians need to know about endothelial progenitor cells.</a> Am. J. Med. 124, 489-4897 (2011).</li>
<li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+wall-derived+endothelial+cells+rapidly+proliferate+because+they+contain+a+complete+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells.</a> Blood. 105, 2783-276 (2005).</li>
<li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104, 2752-2760 (2004).</li>
<li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li>
<li>Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Animal+Serum+Free+Expansion+of+Human+Umbilical+Cord+Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+%28MSCs%29+and+Endothelial+Colony+Forming+Progenitor+Cells+%28ECFCs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs.</a> J. Vis. Exp. (32), e1525(2009).</li>
<li>Au, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+in+vivo+potential+of+endothelial+progenitor+cells+from+human+umbilical+cord+blood+and+adult+peripheral+blood+to+form+functional+long-lasting+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels.</a> Blood. 111, 1302-135 (2008).</li>
<li>Critser, P. J., Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+matrix+physical+properties+modulate+endothelial+colony+forming+cell-derived+vessels+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Collagen matrix physical properties modulate endothelial colony forming cell-derived vessels in vivo.</a> Microvasc. Res. 80, 23-30 (2010).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+robust+and+functional+vascular+networks+in+vivo+with+human+adult+and+cord+blood-derived+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells.</a> Circ. Res. 103, 194-202 (2008).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109, 4761-4768 (2007).</li>
<li>Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Large+Scale+Expansion+of+Adult+Human+Endothelial+Colony+Forming+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells.</a> J. Vis. Exp. (32), e1524(2009).</li>
<li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> J. Clin. Invest. 105, 71-77 (2000).</li>
<li>Witting, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Large+Volume+Lentiviral+Vector+Production+Using+Flow+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient Large Volume Lentiviral Vector Production Using Flow Electroporation.</a> Hum. Gene. Ther. , (2011).</li>
<li>Yoon, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+neovascularization+by+mixed+transplantation+of+early+endothelial+progenitor+cells+and+late+outgrowth+endothelial+cells%3A+the+role+of+angiogenic+cytokines+and+matrix+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Synergistic neovascularization by mixed transplantation of early endothelial progenitor cells and late outgrowth endothelial cells: the role of angiogenic cytokines and matrix metalloproteinases.</a> Circulation. , 112-1618 (2005).</li>
<li>Dubois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+progenitor+cell+populations+on+left+ventricular+remodeling+and+myocardial+neovascularization+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of progenitor cell populations on left ventricular remodeling and myocardial neovascularization after myocardial infarction.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 55, 2232-2243 (2010).</li>
<li>Medina, R. J., O'Neill, C. L., Humphreys, M. W., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outgrowth+endothelial+cells%3A+characterization+and+their+potential+for+reversing+ischemic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Outgrowth endothelial cells: characterization and their potential for reversing ischemic retinopathy.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5906-5913 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Endotelyal progenitör hücrelerin fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu klonal ve seri olarak yeniden kaplama kültüründe yeteneğine sahip iyi niyetli ECFCs belirlemek ve in vivo olarak dayanıklı ve fonksiyonel implante kan damarlarının neden önemlidir. İnsan göbek kordon kanı ECFCs ve yaşlanma veya hastalık 10 ile bu dolaşımdaki hücrelerin düşüşler konsantrasyonu ile zenginleştirilmiştir. Son çalışmalar ECFC damar yaralanması, miyokard enfarktüsü veya retinopati 17-19 durumlard...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Heparin Sodyum Enjeksiyon, USP </td><td> APP İlaç </td><td> 504031 </td></tr><tr><td> Ficoll-Pague </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> Karıştırma kanül </td><td> Maersk Tıp </td><td> 500.11.012 </td></tr><tr><td> EGM-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3162 </td></tr><tr><td> Tanımlı FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td> TrypLE ekspres </td><td> Gibco </td><td> 12605 </td></tr><tr><td> Sıçan tip I kollajen </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356234 </td></tr><tr><td> FCR Blok </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-059-901 </td></tr><tr><td> hCD31, FITC conjugated </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555445 </td></tr><tr><td> hCD45, FITC konjuge </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555482 </td></tr><tr><td> konjuge hCD14, FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555397 </td></tr><tr><td> hCD144, PE konjuge </td><td> eBioscience </td><td> 12-1449-80 </td></tr><tr><td> hCD146, PE konjuge </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550315 </td></tr><tr><td> hCD105, PE konjuge </td><td> Invitrogen </td><td> MHCD10504 </td></tr><tr><td> Ms IgG 1, k antikor, konjuge FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555748 </td></tr><tr><td> Ms IgG 1, k antikor, konjuge PE </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559320 </td></tr><tr><td> Ms IgG 2a, k antikor, konjuge FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555573 </td></tr><tr><td> Anti-insan CD31 </td><td> Dako </td><td> clone JC70 / A </td></tr><tr><td> Anti-mouse CD31 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553370 </td></tr><tr><td> 0.22-mikron vakum filtrasyon sistemi </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> Glasiyal asetik asit, 17.4N </td><td> Balıkçı </td><td> A38-500 </td></tr><tr><td> Antibiyotik-Antimikotik </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td></tr><tr><td> Fetal bovin serumu (FBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td> IHC Çinko Sabitleme </td><td> BD Biosciences </td><td> 550523 </td></tr><tr><td> Sytox yeşil reaktif </td><td> Invitrogen </td><td> S33025 </td></tr><tr><td> Steril Klonlama silindir, </td><td> Fisher Scientific </td><td> 07-907-10 </td></tr></tbody></table>

endotel colony forming hücrelerinin fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu İnsan göbek kordonu kanı türetilen

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Anjiogenez, vaskülojenez ve arteriogenesis ile yeni kan damarları oluşumu uzun süredir kez son 1 gözden geçirilmiştir. Endotel progenitör hücreler (EPC) dolaşımdaki varlığı ilk Asahara ve arkadaşları tarafından yetişkin insan periferik kan tespit edilmiştir. 1997 2 vasküler yenilenme ve onarım için yeni hipotezler ve stratejilerin bir infüzyon getirmekte. EPC dolaşan kan nadir fakat normal bileşeni olduğu kan damarları oluşumu ya da vasküler yeniden şekillenme sitelerine ev ve hücreler 3 elde mevcut damar duvarının parakrin stimülasyon ile büyük ölçüde ya da doğum sonrası vaskülojenez, anjiyogenez veya arteriogenesis kolaylaştırmak. EPC tanımlamak için spesifik bir belirteç tespit ve alanın şu anda devlet proanjiyogenik hematopoetik kök ve progenitör hücreler dahil olmak üzere çok sayıda hücre tipleri anlamak, anjiogenik hücreleri, Tie2 + monosit, miyeloid progenitör cel dolaşan edilmiştirLs, tümör ilişkili makrofajlar, M2 ve aktive makrofajlar klinik öncesi hayvan modeli sistemlerinin çeşitli hastalık durumları ve çok sayıda 4, 5 in insan denekler içinde anjiyojenik işlemi uyararak katılabilir. Endotel koloni oluşturan hücreleri (ECFCs) sağlam klonal bir proliferatif potansiyeli, replating üzerine yeteneğini oluşturan ikincil ve üçüncül koloni ve bağışık yetmezliği olan farelere 6-8 içine nakli üzerine in vivo damarlarda intrinsik kurma yeteneği ile karakterize nadir dolaşan canlı endotel hücreleri vardır. ECFCs başarıyla sağlıklı erişkin birey, sağlıklı doğan bebeklerin göbek kordon kanı (CB), ve çok sayıda insan arteriyel ve venöz damarların 6-9 damar duvarının periferik kandan izole olmuş, CB ECFCs 7 en yüksek frekans sahip olduğu ekran en sağlam klonal bir proliferatif potansiyeli ve in vivo 8, 10-13 form dayanıklı ve fonksiyonel kan damarları. Iken derivasyonErişkin periferik kandan ECFC burada derivasyon için yöntemler tarif, 14, 15 sunulmuştur, klonlama, genişleme, ve in vitro hem de insan umbilikal CB ECFCs in vivo karakterizasyonu gibi.

Endotel koloni oluşturan hücreleri (ECFCs) intrensek göstermeyen sağlam klonal bir proliferatif potansiyeli olan endotel hücreleri dolaşıyor<em&gt; In vivo</em&gt; Gemi yeteneği oluşturulması. CB türetilen outgrowth endotelyal hücreler fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu tanımlamak ve izole etmek için önemlidir<emNiyetli&gt; bona</em&gt; Hasarlı dokuların tamiri ve potansiyel klinik uygulama için ECFCs.

Endotel Colony Forming Hücrelerinin Fenotipik ve Fonksiyonel Karakterizasyonu İnsan Göbek Kordonu Kanı türetilen

Anjiyogenez, vaskülogenez ve arteriyogenez yoluyla yeni kan damarı oluşumuna ilişkin uzun süreli görüşler yakın zamanda gözden geçirilmiştir1. ... varlığı

Bu prosedürün genel amacı, insan göbek kordonu kanından endotelyal koloni oluşturucu hücrelerin veya eCFC'lerin nasıl elde edileceğini açıklamaktır. Bu işlem, öncelikle göbek kordonu kanındaki mononükleer hücrelerin ekilmesi ve ardından eCFC'lerin koloni çıkıntılarının klonlanması ve genişletilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, klonal proliferatif potansiyel için yeni bir tek hücre deneyi tekniği kullanılarak hücrelerin in vitro karakterizasyonunu yapmaktır.Son olarak, nud farelere ECFC içeren jellerin üretilmesi ve implante edilmesi yoluyla, hücreler in vivo bir damar oluşum analizi ile karakterize edilir. Nihayetinde, de novo konakçı kanıyla dolu damarların in vivo oluşumu, ECFC içeren hücresel implantların h ve e boyaması ile değerlendirilebilir. Bu tekniklerin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, endotel hücrelerin proliferatif potansiyelinin tek hücre düzeyinde incelenmesine olanak tanımasıdır.Bu tekniğin etkileri, hastanın endotel hücrelerinin proliferatif potansiyelini ve genik kapasitesini incelememize olanak tanıdığı için periferik arter hastalığı veya PAH gibi hastalıklar için tanısal ve terapötik araçlar bulmaya yönelik genişletilebilir. Prosedüre başlamadan önce, altı kuyucuklu bir doku kültürü plağının her kuyucuğuna bir mililitre tip 1 sıçan kuyruk kolajeni ekleyin ve ardından plağı gece boyunca inkübe edin; prosedür gününde kordon kanını 50 mililitrelik konik santrifüj tüplerine 15 mililitrelik porsiyonlar halinde paylaştırın. Daha sonra her tüpe 20 mililitre PBS ekleyin ve karışımı pipetle birkaç kez yukarı aşağı çekerek karıştırın.Ardından, bir pipete 15 mililitre Ficoll-PA çekin, pipet ucunu dilüe edilmiş kan tüpünün tabanına yerleştirin ve Ficoll'ü dikkatlice altına ekleyin; tüpleri oda sıcaklığında, yavaşlama freni ayarı olmadan, 740 xg'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Hücre ayrımından sonra, Ficoll tabakası ile dilüe plazma arasındaki arayüzde bulunan düşük yoğunluklu mononükleer hücrelerin bulanık tabakasını almak için bir transfer pipeti kullanın. Toplanan hücreleri, 10 mililitre EGM-2 medyum içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve mononükleer hücreleri oda sıcaklığında, yüksek yavaşlama freni ayarıyla, 515 xg'de 10 dakika boyunca çöktürün; ardından süpernatanı dikkatlice aspire ederek atın.Ardından, peletlenmiş hücreleri iki kez EGM two ile yıkadıktan sonra, mononükleer hücreleri 1,25 × 10⁷ hücre/mL konsantrasyonunda EGM two içinde süspanse edin. Şimdi, mononükleer hücre süspansiyonundan her bir kuyucuğa 4 mL pipetleyin ve hücreleri, ilk gün koloniler oluşana kadar inkübe edin. İnkübasyon sonrası, gevşek yapışmış hücreleri rahatsız etmeden, tükenmiş medyumu kuyucuklardan bir pipet yardımıyla yavaşça uzaklaştırın.Ardından kuyucuklara dikkatlice dört mililitre E GM two ekleyin ve plakayı inkübatöre geri yerleştirin. Koloniler genellikle prosedürden önceki gün, beş ile 14. günler arasında görülür. 50 mikrolitre sıçan kuyruk kolajeni.Daha önce yapıldığı gibi, 96 kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna bir tane ekleyin ve prosedür gününde plakayı gece boyunca inkübe edin. Sadece iki ila üç kez pasajlanmış hücreleri iki kez PBS ile yıkayarak başlayın. Son PBS yıkamasını aspire ettikten sonra, her koloninin etrafına steril jel kaplı bir klonlama silindiri yerleştirin ve steril pens kullanarak her silindiri plakaya sıkıca bastırın.Her bir klonlama silindirine iki ila üç damla ılık Triple E Express ekleyin ve hücreler ayrılmaya başlayana kadar silindirleri üç ila beş dakika inkübe edin. Hücreler ayrılmaya başladıktan sonra, silindirin merkezine yaklaşık 250 µL EGM-2 medyumu ekleyin ve tek hücre süspansiyonu oluşturmak için pipetle yukarı-aşağı çekme işlemi yapın. Ardından, her bir klonlama silindirindeki tek hücre süspansiyonunu ayrı ayrı bireysel mikro santrifüj tüplerine aktarın.Altı kuyucuklu plakadaki hücreleri EGFP eksprese eden lentivirüslerle enfekte edin ve EGFP eksprese eden hücreleri floresan sitometri ile toplayın. Ardından, EGFP pozitif hücreleri ve EGM-2 ortamını kolajen kaplı plakalarda inkübe edin. E-CFC'ler hazır olduğunda, az önce gösterildiği gibi TrypLE Express kullanarak onları toplayın; hücreleri ve EGM-2 ortamını yaklaşık 10⁶ hücre/mL nihai konsantrasyona gelecek şekilde yeniden süspande edin.Ardından, saniyede 20 hücrelik düşük bir akış hızıyla bir akış ayıklayıcı (flow sorter) kullanarak, önceden hazırlanmış kolajen kaplı 96 kuyucuklu plakadaki her kuyucuğa tek bir EGP pozitif ECFC ayıklayın ve her kuyucuğun final hacmini EGM-2 ile yaklaşık 200 µL olacak şekilde ayarlayın. Daha sonra, her kuyucuğun yalnızca tek bir hücre içerdiğinden emin olmak için ters floresan mikroskobu kullanın. Plakayı, kültürün 14. gününde iki kez besiyeri değişimi yaparak iki hafta boyunca inkübe edin.Hücreleri 30 dakika boyunca 100 µL %4 paraformaldehit ile fikse etmeden önce her kuyucuğu 100 µL PBS ile yıkayın. EGFP eksprese etmeyen CFC'ler için, paraformaldehit fiksasyonunu takiben sit reaktifi (yeşil floresan bir nükleer boya) ekleyin ve dört °C'de gece boyunca inkübe edin. Genişlemiş endotel hücrelerinin sayısını görünür şekilde nicelleştirmek için bir floresan mikroskobu kullanın; burada gösterildiği gibi, endotel hücre sayısı 2 ila 50 olan kuyucuklar endotel hücre kümeleri olarak kabul edilir.51 ila 2000 hücre içeren kuyucuklar düşük proliferatif potansiyelli e CFC'ler, 2001 veya daha fazla hücre içerenler ise yüksek proliferatif potansiyelli e CFC'ler olarak kabul edilir. Hücreleri daha önce olduğu gibi triple E express ile ayırdıktan sonra, hemositometre ve tripan mavisi kullanarak hücre kültürünün canlı hücre sayısını belirleyin. 2,4 milyon canlı hücreyi 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve ardından hücreler çöktürülürken santrifüj ile pelet haline getirin.Jel matrisi bileşenlerini iyice karıştırın ve ardından çözeltiyi buz üzerinde tutarak sodyum hidroksit ile pH değerini 7,4'e ayarlayın. Süpernatantı attıktan sonra peleti 360 µL ılık e GM two içinde yeniden süspanse edin. Ardından hücrelere 840 µL jel matrisi çözeltisi ekleyin ve hücreler jel içinde tamamen süspanse olana kadar çözeltiyi dikkatlice karıştırın. Bu 1 mL hücresel jel süspansiyonunu 12 kuyucuklu bir doku kültürü plağının bir kuyucuğuna aktarın ve jel polimerleşene kadar plağı inkübe edin.Ardından, gece boyunca inkübasyona bırakmadan önce jeli iki mililitre ılık EGM two ile nazikçe kaplayın; ertesi gün ve implantasyondan hemen önce, jeli iris makası kullanarak iki eşit parçaya bölün ve jel parçalarını EGM two besiyeri içeren aynı kültür kuyucuğuna geri yerleştirin. Ayak parmağı sıkıştırma yöntemiyle sedasyonun onaylanmasının ardından, anestezi uygulanmış beş ila altı haftalık dişi nüd, skid farenin alt abdomenini tıraşlayın ve cerrahi bölgeyi alkol ve betadin pedlerini dairesel hareketlerle kullanarak iyice temizleyin.Ardından, deri ile karın kası arasındaki subkutan alanı açığa çıkarmak için steril ve keskin iris makası kullanarak karnın alt kadranında yaklaşık beş milimetrelik bir insizyon yapın. Karın bölgesinin iki farklı alanında dermal tabakayı karın kasından künt diseksiyonla ayırarak, biri üst karın kadranına doğru ve diğeri karnın başka bir bölgesine doğru uzanan 15 ila 20 milimetre genişliğinde cepler oluşturun. Daha sonra, insizyonun hemen yanındaki dermal tabakayı kaldırın.Jelin bir yarısını bir abdominal cebe, jelin diğer yarısını ise diğer abdominal cebe yerleştirin. Jeller yerleştirildikten sonra, kesici iğne üzerindeki 5-0 polipropilen sütürleri kullanarak her bir insizyonu iki ila üç dikişle kapatın. Kafes kartlarını etiketleyin; kurumsal ve protokol gerekliliklerine uygun olarak cerrahi sonrası izleme ve analjezi işlemlerini gerçekleştirin.İmplantasyonun 14. gününde hayvan sakrifiye edildikten sonra, farenin karnını alkollü pedlerle silin ve deriyi orijinal insizyon hattına paralel olacak şekilde kesin. Ardından, jellerin muhtemel konumlarına paralel deri flepleri eksize edin. Her bir implantı çıkarmak için jellerin çevresini dairesel olarak kesin ve ardından eksize edilen implantları çinko tespit çözeltisine yerleştirin.Bu ECFC türetme tekniğini kullanarak, beşinci gün kadar erken bir dönemde primer koloni oluşumunun büyümesini gözlemledik. Ok uçlarıyla belirtilen bu beşinci gün ECFC kültürlerinin kaldırım taşı morfolojisine dikkat ediniz. Genişlemiş koloniler endotel antijenlerini eksprese eder, ancak hematopoetik antijenleri eksprese etmez.Endotel ve hematopoetik hücrelerin bu temsili in vitro fenotipik değerlendirmesinde görüldüğü üzere, immünofenotipleme, e CFC'lerin CD 31, CD 34, CD 1 44, CD 1 46, FL one, flick one, flip four ve NRP two gibi endotel antijenlerini eksprese ettiğini, ancak hematopoetik antijenler olan CD 45, CD 14, CD 11, BC Kit, CXCR four veya CD 1 33'ü eksprese etmediğini ortaya koymuştur. Önemli bir nokta olarak, bu sütun grafiğinde temsil edildiği üzere, genişletilmiş koloniler, iki ila 50 hücrelik kümelerden 200'den fazla hücre içeren kolonilere kadar, tek hücre düzeyinde klonal proliferatif potansiyelin tam bir hiyerarşisini sergilemektedir. Yeşil floresan bir nükleer boya olan cyt ile boyanmış kolonilere ait bu mikrograflar, kordon kanından türetilen E CFC'lerin tek hücre düzeyinde 14 gün boyunca kültüre edilmesiyle elde edilmiştir.Ayrıca, e CFC'ler immün yetmezliği olan farelere implante edildiklerinde, konakçı eritrositleri ile perfüze olan insanlaştırılmış kan damarları oluştururlar. Kordon kanı kaynaklı ECFC içeren CELLULARIZE jel implantlarının bu H ve E boyamasında, implantasyonun 14. gününden sonra kolajen fibronektin jel içinde oluşan ve konakçı eritrositleri ile dolu mikrodamarlar gözlemlenebilir. Burada, kahverengi renkteki anti-insan CD 31 boyaması, bu damarların insan kökenli olduğunu ayrıca doğrulamaktadır.Bu videoyu izledikten sonra, insan göbek kordonu kanından ECFC'lerin nasıl türetileceği ve geliştirme sonrası ECFC kolonilerinin nasıl klonlanacağı, genişletileceği ve fonksiyonelliğinin nasıl karakterize edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu teknik, vasküler endotel alanındaki araştırmacıların, çoklu kaynaklardan elde edilen endotel hücrelerinin endotel klonal proliferatif potansiyelini ve genik kapasitesini keşfetmelerinin yolunu açmıştır.

phenotypic-functional-characterization-endothelial-colony-forming

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Endotel progenitör hücrelerin koloni oluşturan (ECFCs) vasküler homeostazı ve onarım çalışması için bir gelecek vaat eden bir araçtır.

İzolasyon ve Büyük Ölçekli Genişleme Yetişkin İnsan Endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler

Bu protokol deneysel nakli amaçlı otolog yaratmanız serum hayvan kullanmadan mezenkimal stromal hücreleri ve endotel koloni oluşturan hücrelerin izolasyonu ve sonraki genişleme açıklamaktadır.

İnsan Göbek kordonu İzolasyon ve Hayvan Serum Genişleme Mezenkimal stromal hücreler (MKH) ve endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler (ECFCs) Türetilmiş

Koloni oluşturan hücre (CFC) tayini hematopoetik atalarıdır yarı-katı ortamda koloniler oluşturur in vitro testtir. Koloni morfolojisi, hücre morfolojisi ve akış sitometri bir arada, farklı hematopoetik soy boyunca çoğalırlar ve ayırt atalarıdır yeteneklerini değerlendirmek için kullanılır.

Koloni Oluşturan İnsan Hematopoetik Hücreler Hücre (CFC) Testi

Bu protokol, küçük bir yetişkin periferik kan hacminden kan büyümesi endotel hücrelerinin (BOEC'ler) güvenilir bir şekilde oluşturulmasına ve karakterizasyonuna izin verir. BOEC'ler, vasküler bozuklukları olan hastalardan alınan endotel hücreleri için bir vekil olarak ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin üretimi için bir substrat olarak kullanılabilir.

İnsan çevresel kanından üretilmesi ve kültür Blood üremesi Endotel Hücreleri

Hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC) henüz küçük bazı endotel hücreleri kan yapıcı olmaya belirtmek hangi işlemi hakkında bilinen, gelişim sırasında uzman (hemogenic) endotel hücreleri kaynaklanıyor. Bu fare embriyonik dokulardan hemogenic endotel hücreleri ve HSPC eşzamanlı izolasyonu sağlayan bir akış-sitometri göre bir yöntem ortaya koymaktadır.

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

Bu iletişim kuralının amacı göbek kordon kanı endotelyal progenitor hücrelerini izole etmektir. Bazı uygulamalar bu hücreler bir biyomarker hastaların kardiyovasküler riski ile iskemik hastalıklar, tedavi tanımlamak için kullanmayı içerir ve oluşturma doku Mühendisliği vasküler ve kalp kapak oluşturur.

Yalıtım endotelyal Progenitor Hücre insan göbek kordon kanı

Burada, bir besleyici ve Xeno-ücretsiz durumda insan pluripotent kök hücrelerinden hemogenik endotelyum tam olarak oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem hastalık modelleme ve terapötik bileşikler için tarama geniş uygulamalara sahip olacaktır.

Bir besleyici içinde ınsan pluripotent kök hücrelerinden hemogenik endotelyum farklılaşma-ve Xeno-ücretsiz tanımlı koşul

Burada, dört miyeloid soya immünotipik karakterizasyon ve sitokin kaynaklı cd34+ hematopoetik kök ve ataat hücrelerinin farklılaşması için bir protokol sıyoruz. Bu protokolün uygulamaları cd34+ hücrelerin miyeloid farklılaşması üzerinde miyeloid hastalık mutasyonları veya küçük moleküllerin etkisi üzerine araştırmalar içerir.

İnsan Kordon Kanı Kaynaklı CD34 Pan-miyeloid Farklılaşması+ Hematopoetik Kök ve Progenitor Hücreleri

Üç boyutlu eş-kültür spheroid anjiyogenez tsay sistemi fizyolojik anjiyogenezi taklit etmek için tasarlanmıştır. Co-kültür sheroidler iki insan vasküler hücre öncüleri, ECFCs ve MSCs oluşur ve kollajen jel gömülü. Yeni sistem anjiyojenik modülatörlerin değerlendirilmesinde etkilidir ve in vivo çalışmaya daha uygun bilgiler sağlar.

Endotel Kolonisi Oluşturan Hücreler ve Mezenkimal Kök Hücreler tarafından Oluşturulan Eş Kültür Sfaoidler Kullanılarak Üç Boyutlu Anjiyogenez Tsay Sistemi

Burada hemojenik endotel hücrelerinin insan pluripotent kök hücrelerinden yaklaşık 1 hafta içinde yönlendirilmiş farklılaşması için basit bir protokol sunulmaktadır.

Hemojenik Endotel Hücrelerinin İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Yönlendirilmiş Farklılaşması

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

Domuz Periferik Kanından Kan Büyümesi Endotel Hücrelerinin (BOEC) Karakterizasyonu

Öğrenin, insan göbek kordonu kanından endotelyal koloni oluşturan hücrelerin (ECFC) türetilmesi ve karakterizasyonu için bu yöntemi. Tek hücreli proliferasyon potansiyeli ve in vivo damar oluşumu yeteneği değerlendirilir.

Endotel Colony Forming Hücrelerinin Fenotipik ve Fonksiyonel Karakterizasyonu İnsan Göbek Kordonu Kanı türetilen

Daha fazla video keşfet