Endotel Colony Forming Hücrelerinin Fenotipik ve Fonksiyonel Karakterizasyonu İnsan Göbek Kordonu Kanı türetilen

Bu prosedürün genel amacı, insan göbek kordonu kanından endotelyal koloni oluşturucu hücrelerin veya eCFC'lerin nasıl elde edileceğini açıklamaktır. Bu işlem, öncelikle göbek kordonu kanındaki mononükleer hücrelerin ekilmesi ve ardından eCFC'lerin koloni çıkıntılarının klonlanması ve genişletilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, klonal proliferatif potansiyel için yeni bir tek hücre deneyi tekniği kullanılarak hücrelerin in vitro karakterizasyonunu yapmaktır.

Son olarak, nud farelere ECFC içeren jellerin üretilmesi ve implante edilmesi yoluyla, hücreler in vivo bir damar oluşum analizi ile karakterize edilir. Nihayetinde, de novo konakçı kanıyla dolu damarların in vivo oluşumu, ECFC içeren hücresel implantların h ve e boyaması ile değerlendirilebilir. Bu tekniklerin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, endotel hücrelerin proliferatif potansiyelinin tek hücre düzeyinde incelenmesine olanak tanımasıdır.

Bu tekniğin etkileri, hastanın endotel hücrelerinin proliferatif potansiyelini ve genik kapasitesini incelememize olanak tanıdığı için periferik arter hastalığı veya PAH gibi hastalıklar için tanısal ve terapötik araçlar bulmaya yönelik genişletilebilir. Prosedüre başlamadan önce, altı kuyucuklu bir doku kültürü plağının her kuyucuğuna bir mililitre tip 1 sıçan kuyruk kolajeni ekleyin ve ardından plağı gece boyunca inkübe edin; prosedür gününde kordon kanını 50 mililitrelik konik santrifüj tüplerine 15 mililitrelik porsiyonlar halinde paylaştırın. Daha sonra her tüpe 20 mililitre PBS ekleyin ve karışımı pipetle birkaç kez yukarı aşağı çekerek karıştırın.

Ardından, bir pipete 15 mililitre Ficoll-PA çekin, pipet ucunu dilüe edilmiş kan tüpünün tabanına yerleştirin ve Ficoll'ü dikkatlice altına ekleyin; tüpleri oda sıcaklığında, yavaşlama freni ayarı olmadan, 740 xg'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Hücre ayrımından sonra, Ficoll tabakası ile dilüe plazma arasındaki arayüzde bulunan düşük yoğunluklu mononükleer hücrelerin bulanık tabakasını almak için bir transfer pipeti kullanın. Toplanan hücreleri, 10 mililitre EGM-2 medyum içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve mononükleer hücreleri oda sıcaklığında, yüksek yavaşlama freni ayarıyla, 515 xg'de 10 dakika boyunca çöktürün; ardından süpernatanı dikkatlice aspire ederek atın.

Ardından, peletlenmiş hücreleri iki kez EGM two ile yıkadıktan sonra, mononükleer hücreleri 1,25 × 10⁷ hücre/mL konsantrasyonunda EGM two içinde süspanse edin. Şimdi, mononükleer hücre süspansiyonundan her bir kuyucuğa 4 mL pipetleyin ve hücreleri, ilk gün koloniler oluşana kadar inkübe edin. İnkübasyon sonrası, gevşek yapışmış hücreleri rahatsız etmeden, tükenmiş medyumu kuyucuklardan bir pipet yardımıyla yavaşça uzaklaştırın.

Ardından kuyucuklara dikkatlice dört mililitre E GM two ekleyin ve plakayı inkübatöre geri yerleştirin. Koloniler genellikle prosedürden önceki gün, beş ile 14. günler arasında görülür. 50 mikrolitre sıçan kuyruk kolajeni.

Daha önce yapıldığı gibi, 96 kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna bir tane ekleyin ve prosedür gününde plakayı gece boyunca inkübe edin. Sadece iki ila üç kez pasajlanmış hücreleri iki kez PBS ile yıkayarak başlayın. Son PBS yıkamasını aspire ettikten sonra, her koloninin etrafına steril jel kaplı bir klonlama silindiri yerleştirin ve steril pens kullanarak her silindiri plakaya sıkıca bastırın.

Her bir klonlama silindirine iki ila üç damla ılık Triple E Express ekleyin ve hücreler ayrılmaya başlayana kadar silindirleri üç ila beş dakika inkübe edin. Hücreler ayrılmaya başladıktan sonra, silindirin merkezine yaklaşık 250 µL EGM-2 medyumu ekleyin ve tek hücre süspansiyonu oluşturmak için pipetle yukarı-aşağı çekme işlemi yapın. Ardından, her bir klonlama silindirindeki tek hücre süspansiyonunu ayrı ayrı bireysel mikro santrifüj tüplerine aktarın.

Altı kuyucuklu plakadaki hücreleri EGFP eksprese eden lentivirüslerle enfekte edin ve EGFP eksprese eden hücreleri floresan sitometri ile toplayın. Ardından, EGFP pozitif hücreleri ve EGM-2 ortamını kolajen kaplı plakalarda inkübe edin. E-CFC'ler hazır olduğunda, az önce gösterildiği gibi TrypLE Express kullanarak onları toplayın; hücreleri ve EGM-2 ortamını yaklaşık 10⁶ hücre/mL nihai konsantrasyona gelecek şekilde yeniden süspande edin.

Ardından, saniyede 20 hücrelik düşük bir akış hızıyla bir akış ayıklayıcı (flow sorter) kullanarak, önceden hazırlanmış kolajen kaplı 96 kuyucuklu plakadaki her kuyucuğa tek bir EGP pozitif ECFC ayıklayın ve her kuyucuğun final hacmini EGM-2 ile yaklaşık 200 µL olacak şekilde ayarlayın. Daha sonra, her kuyucuğun yalnızca tek bir hücre içerdiğinden emin olmak için ters floresan mikroskobu kullanın. Plakayı, kültürün 14. gününde iki kez besiyeri değişimi yaparak iki hafta boyunca inkübe edin.

Hücreleri 30 dakika boyunca 100 µL %4 paraformaldehit ile fikse etmeden önce her kuyucuğu 100 µL PBS ile yıkayın. EGFP eksprese etmeyen CFC'ler için, paraformaldehit fiksasyonunu takiben sit reaktifi (yeşil floresan bir nükleer boya) ekleyin ve dört °C'de gece boyunca inkübe edin. Genişlemiş endotel hücrelerinin sayısını görünür şekilde nicelleştirmek için bir floresan mikroskobu kullanın; burada gösterildiği gibi, endotel hücre sayısı 2 ila 50 olan kuyucuklar endotel hücre kümeleri olarak kabul edilir.

51 ila 2000 hücre içeren kuyucuklar düşük proliferatif potansiyelli e CFC'ler, 2001 veya daha fazla hücre içerenler ise yüksek proliferatif potansiyelli e CFC'ler olarak kabul edilir. Hücreleri daha önce olduğu gibi triple E express ile ayırdıktan sonra, hemositometre ve tripan mavisi kullanarak hücre kültürünün canlı hücre sayısını belirleyin. 2,4 milyon canlı hücreyi 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve ardından hücreler çöktürülürken santrifüj ile pelet haline getirin.

Jel matrisi bileşenlerini iyice karıştırın ve ardından çözeltiyi buz üzerinde tutarak sodyum hidroksit ile pH değerini 7,4'e ayarlayın. Süpernatantı attıktan sonra peleti 360 µL ılık e GM two içinde yeniden süspanse edin. Ardından hücrelere 840 µL jel matrisi çözeltisi ekleyin ve hücreler jel içinde tamamen süspanse olana kadar çözeltiyi dikkatlice karıştırın. Bu 1 mL hücresel jel süspansiyonunu 12 kuyucuklu bir doku kültürü plağının bir kuyucuğuna aktarın ve jel polimerleşene kadar plağı inkübe edin.

Ardından, gece boyunca inkübasyona bırakmadan önce jeli iki mililitre ılık EGM two ile nazikçe kaplayın; ertesi gün ve implantasyondan hemen önce, jeli iris makası kullanarak iki eşit parçaya bölün ve jel parçalarını EGM two besiyeri içeren aynı kültür kuyucuğuna geri yerleştirin. Ayak parmağı sıkıştırma yöntemiyle sedasyonun onaylanmasının ardından, anestezi uygulanmış beş ila altı haftalık dişi nüd, skid farenin alt abdomenini tıraşlayın ve cerrahi bölgeyi alkol ve betadin pedlerini dairesel hareketlerle kullanarak iyice temizleyin.

Ardından, deri ile karın kası arasındaki subkutan alanı açığa çıkarmak için steril ve keskin iris makası kullanarak karnın alt kadranında yaklaşık beş milimetrelik bir insizyon yapın. Karın bölgesinin iki farklı alanında dermal tabakayı karın kasından künt diseksiyonla ayırarak, biri üst karın kadranına doğru ve diğeri karnın başka bir bölgesine doğru uzanan 15 ila 20 milimetre genişliğinde cepler oluşturun. Daha sonra, insizyonun hemen yanındaki dermal tabakayı kaldırın.

Jelin bir yarısını bir abdominal cebe, jelin diğer yarısını ise diğer abdominal cebe yerleştirin. Jeller yerleştirildikten sonra, kesici iğne üzerindeki 5-0 polipropilen sütürleri kullanarak her bir insizyonu iki ila üç dikişle kapatın. Kafes kartlarını etiketleyin; kurumsal ve protokol gerekliliklerine uygun olarak cerrahi sonrası izleme ve analjezi işlemlerini gerçekleştirin.

İmplantasyonun 14. gününde hayvan sakrifiye edildikten sonra, farenin karnını alkollü pedlerle silin ve deriyi orijinal insizyon hattına paralel olacak şekilde kesin. Ardından, jellerin muhtemel konumlarına paralel deri flepleri eksize edin. Her bir implantı çıkarmak için jellerin çevresini dairesel olarak kesin ve ardından eksize edilen implantları çinko tespit çözeltisine yerleştirin.

Bu ECFC türetme tekniğini kullanarak, beşinci gün kadar erken bir dönemde primer koloni oluşumunun büyümesini gözlemledik. Ok uçlarıyla belirtilen bu beşinci gün ECFC kültürlerinin kaldırım taşı morfolojisine dikkat ediniz. Genişlemiş koloniler endotel antijenlerini eksprese eder, ancak hematopoetik antijenleri eksprese etmez.

Endotel ve hematopoetik hücrelerin bu temsili in vitro fenotipik değerlendirmesinde görüldüğü üzere, immünofenotipleme, e CFC'lerin CD 31, CD 34, CD 1 44, CD 1 46, FL one, flick one, flip four ve NRP two gibi endotel antijenlerini eksprese ettiğini, ancak hematopoetik antijenler olan CD 45, CD 14, CD 11, BC Kit, CXCR four veya CD 1 33'ü eksprese etmediğini ortaya koymuştur. Önemli bir nokta olarak, bu sütun grafiğinde temsil edildiği üzere, genişletilmiş koloniler, iki ila 50 hücrelik kümelerden 200'den fazla hücre içeren kolonilere kadar, tek hücre düzeyinde klonal proliferatif potansiyelin tam bir hiyerarşisini sergilemektedir. Yeşil floresan bir nükleer boya olan cyt ile boyanmış kolonilere ait bu mikrograflar, kordon kanından türetilen E CFC'lerin tek hücre düzeyinde 14 gün boyunca kültüre edilmesiyle elde edilmiştir.

Ayrıca, e CFC'ler immün yetmezliği olan farelere implante edildiklerinde, konakçı eritrositleri ile perfüze olan insanlaştırılmış kan damarları oluştururlar. Kordon kanı kaynaklı ECFC içeren CELLULARIZE jel implantlarının bu H ve E boyamasında, implantasyonun 14. gününden sonra kolajen fibronektin jel içinde oluşan ve konakçı eritrositleri ile dolu mikrodamarlar gözlemlenebilir. Burada, kahverengi renkteki anti-insan CD 31 boyaması, bu damarların insan kökenli olduğunu ayrıca doğrulamaktadır.

Bu videoyu izledikten sonra, insan göbek kordonu kanından ECFC'lerin nasıl türetileceği ve geliştirme sonrası ECFC kolonilerinin nasıl klonlanacağı, genişletileceği ve fonksiyonelliğinin nasıl karakterize edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu teknik, vasküler endotel alanındaki araştırmacıların, çoklu kaynaklardan elde edilen endotel hücrelerinin endotel klonal proliferatif potansiyelini ve genik kapasitesini keşfetmelerinin yolunu açmıştır.