Name: Cinsel Gelişim ve askopor Deşarj Fusarium graminearum /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Öğrenin, Fusarium graminearum'da cinsel gelişimi indükleyerek parates gelişimi ve askospor deşarjını nasıl üreteceğinizi. Bu yöntemler, mutant taraması ve genetik analiz için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (FT için MCB-0.923.794) bir hibe ile desteklenmiştir.

1. Perithecia Üreten <ol><li> F. verimli bir suşu ile 6.0 cm çaplı Petri kabındaki Merkezi inokülasyon havuç agar 10 graminearum&#39;un (PH-1 Tavsiye). </li><li> Yeri oda sıcaklığında (18-24 ° C) parlak floresan ışıkları altında yemekler aşılanmış ve misel Petri (3-5 gün) dış kenarına ulaşana kadar büyümeye olanak sağlar. Ticari ev floresan ışıkları meyve vücutta oluşumu ve akıntı teşvik için sorunsuz çalışır. </li><li> Yavaşça steril bir kürdan ile havadan miselyumla kaldırın. </li><li> Steril bir cam hockeystick veya steril bir cam çubuğun yuvarlak ucu ile yüzeye 1.0 ml% 2.5 Tween 60 aq dağıtın. </li><li> Işığa plakalar dönün. Plakalara parafilm katmayın. </li><li> 24 saat sonra, plaka yüzeyi parlak bir görünüme sahip olmalıdır. Eğer miselyumla belirirse, kazıma yüzey ve yeniden başvuru Tween-60 çözüm. </li><li> Önümüzdeki hafta içinde perithecia gelişimi dikkate alınmalıdır. Bir ara aşamalarınperithecium geliştirme hafifçe RNA ekstraksiyonu (Şekil 1) dondurulmuş agar ve flaş yüzeyini kazıyarak hasat edilebilir. </li><li> Olgun sporlar Gün 7 ile plaka kapağında birikecektir. Başlangıçta bu sadece bir mikroskop altında görülebilir, ancak çıplak gözle olacak şekilde günde 9, onlar yeterli yoğunluğu birikmiş olacaktır. </li></ol> 2. Askopor Deşarj Tahlili <ol><li> 6. günde Tween çözüm uygulandıktan sonra, bir odun kurdu olan agar 1 cm çap daire kesip. Alternatif olarak, bir bisturi aynı büyüklükte bir bölümü kaldırmak için kullanılabilir. Daire yarısında dilimlenmiş ve her yarım bardak mikroskop lamı üzerine yerleştirilebilir. </li><li> Orient adet meyve gövdeleri içeren yüzey sürgünün yüzeyine dik olacak şekilde, ve sporların sürgünün uzunluğu aşağı ateşlenir. </li><li> Işıklar altında gece bir nem odasında slayt yerleştirin. Sporlar üzerinde birikecektirslayt ve çıplak gözle ertesi sabah (Şekil 2) görülebilir. </li><li> Biriken sporların su ile yıkanmış ve kapama istenirse belirtilebilir. </li><li> Potansiyel askopor deşarj inhibitörleri testin montaj sırasında agar bloğunun arkasına ekleyerek test edilebilir. Deşarj azaltmak bazı inhibitörleri daha önceden iyon kanalı bu teknik 15 ile test edilmiştir. </li></ol> 3. Rekombinant Döl üretimi <ol><li> F. iki suşları ile havuç agar aşılayarak çapraz Initiate graminearum (bir Nit + ve bir NIT-), Petri tabağı zıt tarafları üzerinde inokulasyon noktaları yerleştirilmesi. </li><li> Bir kez hif yüzey doldurdu, hava bölümünü kazıyarak ve yukarıda açıklandığı gibi Tween-60 çözümü uygulayın. Hif karşılamak Petri tarafında dikkat edilmesi gereken bir işareti kullanın. </li><li> Işık kültürler dönün ve perithecia geliştirdik kadar inkübe ve cirrhi olmak varsilahı iki kültür arasındaki kesişme boyunca perithecia gelen oluşturur. </li><li> Iki kültürün kesiştiği boyunca perithecia görüntülemek içine mikroskop altında getirmek. Bir böceğin iğne ucu ile, steril ve steril suya batırılmış, iğne ucuyla hafifçe Bu sınır boyunca bir cirrhus dokunun. Pin üzerindeki nem cirrhus pin ayrılmamak için izin vermelidir. </li><li> Sporlar yıkayın bir Eppendorf tüp içinde 200 ul steril su içinde üzerinde cirrhus ile pin ucu durulayın. </li><li> Alev pimi tekrar ıslatın ve başka bir cirrhus seçin. 10-15 cirrhi çekme, ve su ile ayrı bir tüp içinde, her yerleştirin. </li><li> Kısaca vorteks tüpler cirrhi askıya içermesin. </li><li> 9 cm Petri kabındaki MMTS orta 1 bir pipet ve yer ile spor süspansiyon 60 ul çıkarın. Steril bir hokey sopası ile yayıldı. Geriye kalan spor süspansiyonu bir hafta için 4 ° C&#39;de saklandı ve gerekirse kaplandı edilebilir. </li><li> Inkübasyon3-5 gün oda sıcaklığında (gerekli değil ışık) az te çok küçük koloniler (Şekil 3) ortaya çıkıncaya kadar. Koloniler arasında fenotipleri iki tür olacak. Nit-koloniler Nit + koloniler daha sparser hif olacaktır. Rekombinant perithecia gelen Cirrhi yaklaşık olarak eşit oranda her iki koloni fenotipleri gösterecektir. Üzerlerinde tek bir fenotip koloniler ile plakaları atılır. Bazen ikiden fazla fenotip diğer faktörlere bağlı olarak segregasyon neden olduğunu not edin. </li><li> V8 veya depolama için havuç agar kolonileri taşıyın. Doğru fenotipi onaylamak için; Czapek Kullanıcı Dox Agar (nit suşlar Czapek Kullanıcı Dox üzerinde büyümek olmaz) ve Klorat (Nit + suşlar Klorat ile PDA üzerinde büyümek olmaz 0,5 M Potasyum Klorat) ile PDA Testi koloniler. İstenilen niteliklere için bu kolonilerin inceleyin. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Perithecia Üreten Amaç bir çim sahip olmaktırHerhangi bir misel veya belirgin sporlar olmadan perithecia. Kültür yüzey siyah kadife (Şekil 1) benzer bir görünümde olacaktır. 24 saat at Tween uygulandıktan sonra ağar yüzeyine hafif bir parlaklık sahip olmalıdır. Miseller yeniden takdirde, bord perithecium gelişimi indüklemek için yeteri kadar sıyrılmıştır edilmemiş olabilir. Askopor deşarj Her zaman yabani tip suşu sizin test agar birkaç blok sağlar. Bu ateş yoksa, sonra ya perithecia çok genç veya çok yaşlı. Onlar çok eski ise, o çok sayıda hif bir beyaz renk veren kültür yüzey üzerinde görünür. Bu durumda değilse, çok genç olabilir ve deney 24 saat içinde tekrar denenmelidir. Bazen, kültürler de deşarj yoktur ve deneyi tekrarladı gerekecektir. Eğer uygun ışık koşullarında test gerçekleştirmek emin olun. Rekombinant döl <p class="jove_content"&gt; Rekombinant perithecia iki suş arasındaki kesişme boyunca perithecia çoğunluğu kadar yapmak gerekir. Genellikle bir çapraz den 10 cirrhi işlemek ve bunlardan en az bir rekombinant 4-6 olmalıdır. Çok nadiren, bir mutasyon çiftleşme bir gerginlik engeller. Ebeveynlerden biri Aberan büyüme fenotipi varsa, en fazla 2 fenotipleri MMTS üzerinde koloniler arasında mevcut olabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig1.jpg" /> Şekil 1. Havuç agar perithecium gelişim aşamaları. Tween uygulamadan sonra Sol, 72 saat. Kırmızı pigment ve yüzeyde siyah taneleri gibi görünen çok genç perithecia unutmayın. Sağ, 144 saatte, olgun perithecia oluşturmuşlardır. Her iki kültürde de yüzeysel misel ve tama yakın olmadığına dikkat edin. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig2.jpg" /> Şekil 2. Deşarj testi. Turuncu havuç agar tapa odaklı böylece tha olduğunuzorla yüzeyinde olgun perithecia boşaltılan t sporların cam sürgünün yüzeyinde birikebilir. 15 saat birikimi zaman. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig3.jpg" /> Şekil 3. Nit + ve seçici MMTS ortamda nit-koloniler arasında büyüme farklar. Nit-koloniler (ok başları) daha küçüktür. Nit + koloniler (oklar) güçlü büyüme göstermektedir. Fotoğraf 7 gün sonra alınır.

<ol><li>Bowden, R. L., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+recombination+in+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Sexual recombination in Gibberella zeae.</a> Phytopathology. 89, 182-188 (1999).</li>
<li>Buller, A. H. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuller%2C+AHR+%22Researches+on+Fungi%22">Researches on Fungi</a>. , Longmans, Green and Co. London, England. (1909).</li>
<li>Cavinder, B., Hamam, A., Lew, R. R., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid1%2C+a+mechanosensitive+calcium+ion+channel%2C+affects+growth%2C+development%2C+and+ascospore+discharge+in+the+filamentous+fungus+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mid1, a mechanosensitive calcium ion channel, affects growth, development, and ascospore discharge in the filamentous fungus Gibberella zeae.</a> Eukaryotic Cell. 10, 832-841 (2011).</li>
<li>Cuomo, C., Güldener, U., Xu, J. R., Trail, F., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fusarium+graminearum+genome+reveals+a+link+between+localized+polymorphism+and+pathogen+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Fusarium graminearum genome reveals a link between localized polymorphism and pathogen specialization.</a> Science. 317, 1400-1402 (2007).</li>
<li>Desjardins, A. E., Brown, D. W., Yun, S. -H., Proctor, R. H., Lee, T., Plattner, R. D., Lu, S. -W., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+and+complementation+of+the+mating+type+%28MAT%29+locus+of+the+wheat+head+blight+pathogen+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Deletion and complementation of the mating type (MAT) locus of the wheat head blight pathogen Gibberella zeae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70, 2437-2444 (2004).</li>
<li>Gueldener, U., Seong, K. -Y., Boddu, J., Cho, S., Trail, F., Xu, J. -R., Adam, G., Mewes, H. -W., Muehlbauer, G. J., Kistler, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Fusarium+graminearum+Affymetrix+GeneChip+For+profiling+fungal+gene+expression+in+vitro+and+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of a Fusarium graminearum Affymetrix GeneChip For profiling fungal gene expression in vitro and in planta.</a> Fungal Genetics and Biology. 43, 316-325 (2006).</li>
<li>Hallen, H., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L-Type+calcium+ion+channel+Cch1+affects+ascospore+discharge+and+mycelial+growth+in+the+filamentous+fungus+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">The L-Type calcium ion channel Cch1 affects ascospore discharge and mycelial growth in the filamentous fungus Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum).</a> Eukaryotic Cell. 7, 415-424 (2008).</li>
<li>Hallen, H., Huebner, M., Shiu, S. -H., Guldener, U., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+shifts+during+perithecium+development+in+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%29%2C+with+particular+emphasis+on+ion+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene expression shifts during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum), with particular emphasis on ion transport proteins.</a> Fungal Genetics and Biology. 44, 1146-1156 (2007).</li>
<li>Lee, J., Lee, T., Lee, Y. -W., Yun, S. -H., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shifting+fungal+reproductive+mode+by+manipulation+of+mating+type+genes%3A+obligatory+heterothallism+of+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Shifting fungal reproductive mode by manipulation of mating type genes: obligatory heterothallism of Gibberella zeae.</a> Molecular Microbiology. 50, 145-152 (2003).</li>
<li>Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrate+reduction+mutants+of+Fusarium+moniliforme+%28Gibberella+fujikuoi%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nitrate reduction mutants of Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuoi.</a> Genetics. 118, 417-423 (1988).</li>
<li>Min, K., Lee, J., Kim, J. -C., Kim, S. G., Kim, Y. H., Vogel, S., Trail, F., Lee, Y. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene%2C+ROA%2C+is+required+for+proper+morphogenesis+and+discharge+of+ascospores+in+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene, ROA, is required for proper morphogenesis and discharge of ascospores in Gibberella zeae.</a> Eukaryotic Cell. 9, 1495-1503 (2010).</li>
<li>Qi, W., Kwon, C., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+transcript+accumulation+during+perithecium+development+in+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of transcript accumulation during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum).</a> Molecular Genetics and Genomics. , 276-287 (2006).</li>
<li>Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+cannons%3A+explosive+spore+discharge+in+the+Ascomycota%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Fungal cannons: explosive spore discharge in the Ascomycota.</a> FEMS Microbiol. Lett. 276, 12-18 (2007).</li>
<li>Trail, F., Common, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perithecial+development+by+Gibberella+zeae%3A+a+light+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Perithecial development by Gibberella zeae: a light microscopy study.</a> Mycologia. 92, 130-138 (2000).</li>
<li>Trail, F., Xu, H., Loranger, R., Gadoury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+environmental+aspects+of+ascospore+discharge+in+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologica%22%5BJournal%5D)">Physiological and environmental aspects of ascospore discharge in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum.</a> Mycologica. 94, 181-189 (2002).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

F. graminearum özellikle iyi açıklamalı genomunun (kullanılabilirliği nedeniyle meyve vücut geliştirme çalışması uyarlanmıştır <a href="http://mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB/">mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB /</a> ; 4), ve kullanılabilirliğini Affymetrix- mikroarray 6 dayanır. Bu askopor deşarj 7,11,3 için önemli genlerin tanımlanması için yeteneği kolaylaştırmıştır. Burada sunulan yöntemler araştırmacı F. meyve organlarının genetik analiz için gelişim evreleri ve fonksiyonları ayrı bir set odaklanma sağlayacak graminearum&#39;un. Yöntemleri de kültüre meyve uyarılan edilebilir ilgili mantarlar kolayca adapte olan ve diğer mantar meyve vücut tiplerinde in geliştirilmesi için bir standart olarak kullanılabilir. Bir spor ateş fenotipi değerlendirmek için yeteneği sporlar görmek için küçük ve zor türler gibi ince olabilir <em&gt; F. graminearum&#39;un. Temiz bir slayt üzerinde sporların toplanması sporları slayt kapalı yıkanabilir ve nicelendirildi edilebileceği gibi, görsel değerlendirme ve niceliksel hem de kolaylaştırır. Bazı mantar türleri kendi spor ve spor durulanır edilemez çevreleyen bir zamk üretmek, ancak slayt üzerinde kalması mikroskobik sayılmalıdır. Biz Sclerotiniasclerotiorum gerçek olmak için bu bulduk.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Fusarium graminearum suşu PH-1 </td><td> Mantar Genetik Stok Merkezi, Kansas </td><td> FGSC 9075 </td></tr><tr><td> Tween 60 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1629 </td></tr><tr><td> Czapek en Dox Agar </td><td> Difco, Becton Dickinson </td><td> 233810 </td></tr><tr><td> Potasyum Klorat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 255572 </td></tr></tbody></table>

cinsel gelişim ve askopor deşarj fusarium graminearum</em

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Fusarium graminearum filamentöz mantarların gelişmesi ve patojenite çalışmaları için bir model sistem haline gelmiştir. F. graminearum&#39;un en kolay havuç agar, perithecia adlandırılan meyve organları, üretir. Perithecia perithecium gelişim aşamasında üretilen belirli sayıda doku grupları, içerirler. Bunlar, (sırasına göre) perithecium baş (ascogenous hifler ortaya çıkmasına neden olan), dış cidar, paraphyses (asci geliştirmek kadar perithecium merkezi işgal steril Miseller), asci ve ascospores oluşumunu içeren asci 14 içinde. Bu dokuların her birinin gelişimi yaklaşık 24 saat ile ayrılır ve cinsel gelişimi sırasında 12,8 transkriptomik çalışmalara göre olmuştur. Her aşamanın fotoğrafları da dahil olmak üzere gelişme daha ayrıntılı bir açıklama için, Hallen ve ark. (2007) bakın. Burada, senkron üretim ve hasat için yöntemler sunmakly gen düzenlenmesi, geliştirilmesi ve fizyolojik süreçlerin zamansal çalışmaları için perithecia arasında çimler gelişmekte. Bu yöntemler F. ile kullanılmak için özel olarak yazılmış rağmen graminearum, meyva verme teknikleri kültüründe uyarılan edilebilir olması koşuluyla, diğer mantarlara çeşitli için kullanılır ve gelişme için bazı senkronize vardır edilebilir. Biz son zamanlarda F. cinsel gelişimi incelemek için bu protokolü adapte olması verticillioides. Perithecia gelişen bir çim uyarılabilir çünkü bireysel perithecia, bu türün ele alınmak zorunda olsa da, süreç geliştirme (Sikhakolli ve Trail, yayınlanmamış) çalışmak için iyi çalıştı. Mantar meyve organlarının en önemli fonksiyonu sporların yayılmasını olduğunu. Ascomycota (TSKB mantar üreten) türlerin çoğunda, sporlar yoluyla (ve epiplasmic sıvı) sporların ejeksiyon sürüş, TSKB içinde turgor basıncı nesil nedeniyle, TSKB gelen çekilirTSKB ucu 2,7 gözenek. Zorla askopor deşarj çalışmalarımız bu süreçte mutasyonların taranması için kullanabileceğiniz bir &quot;spor deşarj assay&quot;, geliştirilmesi sonuçlandı. Burada Bu testin ayrıntıları sunulmaktadır. F. graminearum homothallic, ve böylece, uyumlu bir ortak yokluğunda meyve gövdeleri oluşturabilirler. Homothallism bir avantajı, bu geçiş, belli bir özelliği, bu tür 14,7 cinsel gelişme çalışma kolaylaştırmıştır bir yönü için yavru homozigot üretmek için gerekli değildir. Bununla birlikte, heterothallic suşları 5,9 geçiş için kullanılabileceği oluşturulan edilmiştir. Bu, bir suş 1 birkaç genleri için mutantları elde etmek homothallic suşları çapraz da mümkündür. Bu, 2 suşları ile bir Petri tabağına coinoculating yapılır. Buluşma noktası boyunca perithecia çoğunluğu (ana türlerden biri bir mutasyon sağlanan inhibe etmez rekombinant olacak) döllenmedir. Perithecia yaşına gelince, onlar zorla boşaltarak onların yerine ascospores topluca terlemek. Çıkan spor eksuda (a cirrhus denir) perithecium ucunda oturur ve kolayca bireysel sporların kurtarma için kaldırılabilir. Burada rekombinant perithecia ve rekombinant ahfadının kurtarma kimlik kolaylaştırmak için bir protokol mevcut.

Cinsel haçlar ve rekombinant döl izolasyonu, ipliksi mantar için önemli araştırma araçlarıdır<em&gt; Fusarium graminearum</em&gt;, Gerekli teknikleri başarıyla bu süreçlerin sunulmaktadır yürütmek.

Cinsel Gelişim ve askopor Deşarj Fusarium graminearum</em

Fusarium graminearum, filamanlı fungusların gelişimi ve patojenite çalışmaları için bir model sistem haline gelmiştir. F. graminearum en kolay şekilde ... üretir.

Bu prosedürün genel amacı, kültürde parathesia gelişimini ve APO boşalımını nasıl oluşturulacağını ve manipüle edileceğini öğrenmektir. Bu işlem, öncelikle cinsel gelişimi başlatmak için kültürün indüklenmesi ve aktif olarak büyütülmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, aktif spor boşalımı için analiz yapılır ve ardından rekombinant parathesia'lar üretilir.Son adım, rekombinasyonun gerçekleşip gerçekleşmediğini belirten fenotipler açısından dölün değerlendirilmesidir. Nihayetinde sonuçlar, cinsel gelişimdeki mutantların taranması veya tek bir suş içinde çoklu mutasyonlar oluşturmak için kullanılabilir. Adımların tarif edilmesi zor olduğundan bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir; adımlar basit olsa da, optimal spor boşalımı ve tutarlı parathesia üretimi elde etmek için kesin bir şekilde uygulanmalıdır.Havuç dilimini, f gramine'nin fertil bir suşu ile altı santimetrelik bir Petri kabının merkezine inoküle ederek başlayın. İnoküle edilen kapları, oda sıcaklığında standart ticari parlak floresan aydınlatma altında inkübe edin.Miselyum petri kabının dış kenarına ulaşana kadar mantarları üç ila beş gün boyunca büyümeye bırakın. Laminar akışlı kabin altında, hava miselyumlarını uzaklaştırmak için kültürün yüzeyini steril kürdanla nazikçe sıyırın.Ardından, burguya bir mililitre sürfaktan uygulayın ve steril bir cam çubuğun eğimli veya yuvarlak ucuyla yüzeye sürün. Perfil uygulamayın. Plakaları tekrar ışıkların altına yerleştirin.24 saat sonra, plakların yüzeyi parlak bir görünüme sahip olmalıdır. Miselyumlar yeniden ortaya çıkarsa yüzeyi kazıyın, tween 60 çözeltisini tekrar uygulayın ve plakları ek 24 saat boyunca ışık altında tutun. Şimdi, paratezyaların gelişimini bir hafta boyunca gözlemleyin.Genç paratezyalar, burgu yüzeyinde siyah tanecikler şeklinde görülür. Olgun paratezyalar ile karşılaştırıldığında, neredeyse hiç yüzeysel miselyum bulunmamalıdır.Yedinci güne gelindiğinde, plaka kapağında olgun sporlar birikir ve dokuzuncu güne gelindiğinde sporlar, büyütme olmadan görülebilecek kadar yoğunlaşır. Ara aşamayı hasat etmek için, parathesia yüzeyi bir skalpel yardımıyla nazikçe kazınır ve parathesia bir kriyotüpe aktarılır. Tüp daha sonra, sürfaktan uygulamasından altı gün sonra RNA ekstraksiyonu için hızlı dondurma işlemine tabi tutulabilir.Bir ahşap matkabı, panç veya neşter yardımıyla auger üzerinden bir santimetre çapında daire şeklinde bir parça kesin. Daireyi ortadan ikiye bölün ve parçaları bir cam mikroskop lamı üzerine yerleştirin; parçaları, meyve gövdelerini içeren yüzey lamın yüzeyine dik olacak ve sporlar lamın uzunluğu boyunca aşağıya doğru yönelecek şekilde konumlandırın. Bu aşamada, eğer bir akro spor inhibitörü isteniyorsa, bunu auger bloğunun arka kısmına uygulayın.Bu teknik, boşaltma inhibitörleri için kimyasalları taramak ve spor fırlatma yeteneği kaybı için genetik mutantları taramak amacıyla kullanılabilir; her iki işlemi de başarıyla gerçekleştirdik. Şimdi, lamı basit bir aydınlatılmış, oda sıcaklığındaki nemlendirilmiş bölmede gece boyunca inkübe edin. Meyve gövdeleri patladığında, sporlar lam üzerinde birikir ve sabah orada görünür hale gelir.Birikmiş sporlar artık lamdan yıkanarak temiz bir kaba toplanabilir ve miktarları belirlenebilir. İki farklı *F. graminearum* suşu arasında genetik bir çaprazlama oluşturmak için, bu suşları bir havuç matkabı petri kabının zıt taraflarına inoküle ederek işleme başlayın. Daha önce açıklandığı üzere, hifler yüzeyi tamamen kaplayana kadar mantarları büyütün.Hava kısımlarını sıyırın ve %60'lık T çözeltisi uygulayın. Bu senaryoda, hiflerin birleştiği plakayı işaretleyin. Kültürleri ışığa geri döndürün ve paratezyumlar gelişip kültürler arasındaki kesişim boyunca paratezyumlardan Siri oluşmaya başladığında yaklaşık yedi gün boyunca inkübe edin.Bu teknik, birden fazla mutasyonu tek bir suşta birleştirmek için kullanılabilir. Ayrıca, bu durumu oldukça kullanışlı bir seçilebilir markör haline getiren knit plus ve knit minus'ın her ikisinin de seçilebileceğini belirtmekte fayda vardır. Diseksiyon mikroskobu altında, iki kültürün kesişme noktası boyunca yer alan parathesiaları görüş alanına getirin.Ardından arama gözünü bulun. Şimdi sterilize edilmiş bir böcek iğnesini steril suya batırın ve iğneyi kültürler arasındaki sınırda oluşmuş bir seruma dokundurun. SRI'lar iğnenin nemine yapışmalıdır.Ardından, pimin ucunu 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpü içerisindeki 200 µL steril su ile durulayın. Pimi alevle sterilize edin, tekrar nemlendirin ve bir başka sru alın. Üç ila beş arasında Siri seçin ve hepsini kendi tüplerine aktarın.Şimdi kısaca vorteksleyin. Süspanse edilmiş Siri içeren her tüp için; 60 µL spor süspansiyonunu dokuz milimetrelik bir Petri kabına yayın.Plakları MMTS besiyeri ile ışıklı veya ışıksız olarak oda sıcaklığında inkübe edin ve kalan spor süspansiyonunu bir haftaya kadar 4 °C'de saklayın. Üç ila beş gün sonra, plak üzerinde çok küçük koloniler belirir. Bir fenotip mikroskop altında değerlendirilebilir.Knit negatif kolonlar, knit pozitif kolonlara göre daha seyrek hiflere sahip olacaktır. Yalnızca tek bir fenotipe sahip olan plakaları atın. Rekombinant parateziden elde edilen Siri'ler, her iki koloni fenotipine de yaklaşık olarak eşit oranda sahiptir.Bu plakaları saklayın. Bazen, saklama amacıyla, knit pozitif ve knit negatif arasında ara formlar olan koloniler gibi diğer faktörlerin ayrışması nedeniyle başka fenotipler ortaya çıkabilir; diğer fenotipleri inceleyerek çalışmaya devam etmek için rekombinant plakalardaki kolonileri V eight veya havuç agar plakasına aktarın, kolonileri Chap X dock's agar ve klorat içeren PDA plakalarına ekimleyin. Parathesia, herhangi bir misel veya spor olmaksızın siyah kadifemsi bir çim şeklinde büyümüştür.Tween uygulamasından 24 saat sonra, auger yüzeyinde hafif bir parlaklık oluşmuştu. Eğer miselyumlar yeniden ortaya çıkmışsa, paratezi gelişimini tetiklemek için plaka yeterince kazınmamış olabilir. Yabani tip bir suştan meyve gövdelerine sahip birkaç auger bloğu, sporların salınımını gözlemlemek amacıyla lamlar üzerine yerleştirildi.Uygun aydınlatma düzenekleri hazırlandı. Çok genç veya çok yaşlı olan paratezyalar genellikle ateşleme yapmadı. Çok yaşlı olduklarında, kültür yüzeyinde çok sayıda hif ortaya çıkarak kültüre beyazımsı bir renk verdi.Meyve gövdeleri çok genç olduğunda gelişme gerçekleşmedi ve deney tekrarlandı. 24 saat sonra, bir çaprazlamadan 10 Siri toplandığında, knit negatif ve knit pozitif fenotiplerinin bir karışımıyla değerlendirildiğinde genellikle en az altısı rekombinanttı. Çok nadiren bir mutasyon, bir suşun çiftleşmesini engelledi.Ebeveynlerden birinde belirgin bir büyüme fenotipi varsa, MMTS üzerindeki koloniler arasında ikiden fazla fenotip mevcuttu. Bu prosedür uygulanırken, zaman içinde art arda aktarılmamış ve iyi korunmuş bir kültürle başlanması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Her zaman stabil bir dondurucu stoktan büyütülmüş bir kültürle başlayın.

sexual-development-and-ascospore-discharge-in-fusarium-graminearum

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Steril koşullar altında toplanması için bir prosedür Gibberella zeae ascospores gelişim süreçleri incelemek için en üst düzeyde protokol açıklamasına bilgi üretmek için filme. Bu deney, çok önemli bir yönü tam genom ekspresyon profil testleri uygulanmaktadır tekrarlanabilirlik kolaylaştırmak gerekir.

Gibberella zeae Ascospore Üretim ve Tahsilat Mikroarray deneyler için.

Tohum bulaşmasını mantarlar tarafından tahılların yıkım daha iyi bitki-patojen etkileşimleri anlamak için sayısız araştırma çabaları açtı. Bir laboratuvar ortamında tohum-mantar etkileşimleri çalışmak için, mantar üretimi, biyokütle, ve çekirdek biyoanalizlerin kullanarak mikotoksin kontaminasyonu ölçümü için sağlam bir yöntem geliştirdi.

Çekirdek biyoanalizlerin kullanarak Fungal Kolonizasyon, Sporogenesis ve Mikotoksin Üretimi Kantitasyonu

Fisyon mayası cinsel yaşam döngüsünün uzun süreli mikroskobu için tekrarlanabilir bir temel yöntem sunuyoruz. Açıklanan küçük ayarlamalarla, sunulan protokol, araştırmanın üreme sürecinin farklı adımlarına odaklanmasına izin verir.

Bölünme Maya Cinsel Yaşam Döngüsü Mikroskopi

Taramalı elektron mikroskobu gözlemi için biyolojik örneklerin işlenmesindeki sorunlar arasında hücre çökmesi, ıslak mikro ortamlardan alınan örneklerin işlenmesi ve hücre tahribatı yer alır. Çiçek meristemleri, oomycete kistleri ve mantarlar (Agaricales) gibi zorlu numunelerin hazırlanması için uygun düşük maliyetli ve nispeten hızlı protokoller burada derlenmiş ve detaylandırılmıştır.

Sorunlu Tesisi, Oomiçet ve fungal Örnekleri için Elektron Mikroskobu (SEM) Protokoller tarayarak

Burada, toprak örneklerinden entomopatojenik mantarların (EPF) izole edilmesi ve seçilmesi için kullanılan yemek kurdu (Tenebrio molitor)-yem sistemine dayanan bir protokol sunuyoruz. Sahada zararlı mikrobiyal kontrolü için fizyolojik özelliklere göre yüksek strese dayanıklı EPF seçmek için etkili bir konidia sayısı (ECN) formülü kullanılır.

Toprak Örneklerinden İntomopatojenik Mantarların İzolasyonu ve Seçimi ve Böcek Zararlılarına Karşı Mantar Virülansının Değerlendirilmesi

Bu protokol, mayaların ve küf Aspergillus fumigatus'un 7 gün gibi kısa bir sürede büyük toprak numunelerinden kültürlenmesi için etkili ve hızlı bir yöntemdir. Yöntemler, deneyler için gerektiğinde bir dizi inkübasyon ortamına ve sıcaklığına uyum sağlamak için kolayca değiştirilebilir.

Mantar Popülasyon Yapısını Araştırmak için Kültürlenebilir Maya ve Küflerin Topraklardan İzolasyonu

Bu makale, mantar bitki patojenleri ile mısır etkileşimlerinin tekrarlanabilir sitolojik, fizyolojik ve moleküler çalışmaları için ayrılmış mısır yaprağı kılıflarını kullanan optimize edilmiş bir aşılama protokolünü detaylandırmaktadır. Yaprak kılıfları, sabitlenmemiş dokularda canlı bitki ve mantar arasındaki hücresel etkileşimlerin gerçek zamanlı gözlemini kolaylaştırır.

Mantar yaprakları mısır patojenlerinin neden olduğu enfeksiyonun canlı hücre görüntülemesi için müstakil mısır kılıfları

Burada, P. blakesleeanus çiftleşmesinin indüksiyonu için temel bir protokol sunuyoruz.

Mucoromycete Phycomyces blakesleeanus ile Cinsel Haçlar

Lusiferaz ifade Meme tümör hücrelerini farelerde subkütan implant ve uzunlamasına bir çalışmada non-invaziv tümör büyümesini ve gelişimini izlemek için optik görüntüleme ile görüntülendi.

Meme Tümörleri IVIS Spektrum kullanarak in vivo Bioluminescent Görüntüleme

Larva ve yetişkin kalpte görüntülenmesi için gerekli...

Dayak Kalp görselleştirme Drosophila</em

Öğrenin, Fusarium graminearum'da cinsel gelişimi indükleyerek parates gelişimi ve askospor deşarjını nasıl üreteceğinizi. Bu yöntemler, mutant taraması ve genetik analiz için kritik öneme sahiptir.

Cinsel Gelişim ve askopor Deşarj Fusarium graminearum

Daha fazla video keşfet