Name: Gelen Yumurta kullanma Schistosoma mansoni Bir şekilde In vivo Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Öğrenin Schistosoma mansoni yumurtaları kullanarak akciğer inflamasyonunu ve bağışıklık hücre yanıtlarını in vivo fare modelinde nasıl araştırılacağını. Bu yöntem helmint enfeksiyonlarındaki immün mekanizmaları anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Sağlık (NIH) AI091759 ve Crohn ve Amerika&#39;nın William ve Shelby Modell Aile Vakfı Araştırma Ödülü (MN) arasında Kolit Vakfı Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Şiştozom-enfekte farelerde NIAID şiştozom Kaynak Merkezi (NIAID Sözleşme N01 A130026) tarafından sağlandı.

1. Schistosoma mansoni Yumurta Arındırıcı <ol><li> Schistosoma yaşam döngüsü 8 bulaşıcı aşamasıdır şiştozom cercariae ile İsviçre-Webster fareler bulaştırmak. Alternatif olarak, NIAID Schistosomiasis Kaynak Merkezi (gelen şiştozom bulaşmış farelerde elde <a href="http://www.schisto-resource.org/" target="_blank">http://www.schisto-resource.org/~~V</a> ). Olduğu zaman noktası tarafından, yumurta karaciğer mevcut olan ve aşağıda açıklandığı gibi (bakınız Şek. 1) elde edilebilir, enfeksiyon sonrası 6-7 hafta boyunca fareler bırakın. </li><li> CO 2 fareler Euthanize, ve% 70 etanol ile ıslatın. Arka fare yerleştirin. Deri ve altındaki periton kesip künt forseps ve makas kullanın. Göğüs kafesi ve diyafram altında yer alan Özel Tüketim karaciğer,. </li><li> Ince karaciğerler kıyma ve kolajenaz / dispase (0.5 mg / mL), penisilin (100 U / ml) ve PBS içinde streptomisin (100 ug / ml) oluşan sindirim karışımının karaciğer başına 20 mL, ekleyin. Mikst koyun50 ml Falcon tüp ure ve 37 ° C shaker&#39;da gece inkübe edin. </li><li> 400 xg / 3 dakika / 20 ° C&#39;de karışım santrifüjleyin Nazikçe aşırı sıvı kapalı dökün ve PBS ile tüp doldurun. Tekrar santrifüj ve PBS yıkama tekrarlayın. Pastör pipetiyle pelet 25 ml PBS içinde, son santrifüj ardından. </li><li> Ince bir elekten (ince elekten karışımı itmek için 10 ml şırınga kullanmak yoluyla karışımı geçirerek takip standart bir mutfak metalik süzgeç (bir cam behere aracılığıyla lapa karaciğer parçaları için 50 ml şırınga pistonu kullanın) aracılığıyla yeniden süspanse pelet Gerinim İkinci bir cam behere). </li><li> 50 ml Falcon tüp içinde gergin karışımı koyun. 400 xg / 5 at Santrifüj min / 20 ° C Pelet kaybetmeden süpernatant dikkatlice dökmek. 3 ml PBS içinde Pastör pipetiyle pelet. </li><li> Bindirme% 20 Percoll üzerine nazikçe karıştırarak, 8 mL Percoll ve 32 mL 0.25M sukroz (FW = 342,3 böylece 8,56 g sucrose/100 mL H 2 0), 40 mL gradyanı. </li><li> 10 dakika / 800 xg / 20 ° C Santrifüj Bir off Pipetid karaciğer hücrelerinin jelatinimsi üst kat atın. Bir transfer pipetle altındaki yumurta pelet çıkarın ve 15 ml Falcon tüp içine yerleştirilmiş. </li><li> 10 ml PBS / 1 mM EDTA / 1 mM EGTA kullanılarak santrifüj ayarlarda yıkama pelet 3X: 3 dakika / xg 30/20 ° C. 500 uL PBS içinde süspanse edin. </li><li> 10 dakika / 800 xg / 20 ° C: yeni bir% 25 Percoll, santrifüj ayarları kullanarak 10 ml degrade (2.5 mL Percoll ve 7.5 mL 0.25M sakkaroz) üzerinde Yerleşimi mix </li><li> Santrifüj ayarları kullanarak 10 ml PBS içinde 3X yıkayın: 3 dak / 30 xg / 20 ° C </li><li> Son 10 ml yıkama olarak, yumurta saymak için 100 uL kaldırın. Yumurta hızlı bir şekilde çözmek, Falcon tüp örnek çıkarmadan önce iyice karıştırılmalıdır yüzden. 900 uL PBS ile 100 uL örnek sulandırınız. Karışımı 100 uL bir diseksiyon mikroskobu (1:10 seyreltme) kullanarak bir mikroskop lamı üzerine damlacıklar olarak sayılmalıdır. Geniş çaplı iğne ucu kullanılmalıdır. </li><li> 50.000 yumurta / mL PBS içinde yumurta süspanse edin. Yumurta -80 ° C&#39;de birkaç ay depolanır ve bir veya TWIC çözülmüş olabilirkullanımı için e. Kullanmadan önce, yumurta (bkz. Şekil 1). Hala sağlam olduğundan emin olmak için mikroskop altında incelemek. </li></ol> 2. S. ile intraperitoneal Duyarlılık mansoni Yumurta: Günlük 0 <ol><li> 5 ml snapcap tüp içinde 5,000 eggs/100 uL PBS yumurta hazırlayın. Enjeksiyon için gerekli% 50 daha fazla yumurta tahmin ediyoruz. </li><li> Bir 23 gauge 3/4inch iğne ve fare başına yumurta süspansiyon 100 mcL ile 1 ml şırınga yükleyin. Yumurta kullanımdan hemen önce yumurta ile, bu nedenle yük iğne yerleşirler. </li><li> Önce her enjeksiyon için yumurtayı karıştırın ve fare başına süspansiyon intraperitoneal 100 uL enjekte etmek için ileri geri Kaya şırınga. </li></ol> 3. S. ile retroorbital İntravenöz Mücadelesi mansoni Yumurta: 14. Gün <ol><li> 5000 eggs/100 uL itibariyle yukarıda yumurta hazırlayın. </li><li> Ksilazin (10 mg / kg) ve ketamin (120 mg / kg) ile (% 4) izofluran veya intraperitonal olarak uzman odacık içinde farelerin uyuşturmak. Anest Derinliğihesia ayak yastığı çimdirilmesine ve herhangi bir fiziksel tepki sağlanması ile belirlenir. </li><li> Yumurta ile 1 ml şırınga ve 23 gauge 3/4inch iğne yüklemesini takiben, açı içine aşağı bakacak şekilde konik ile 90 ° açı ile iğne bükmek için forseps kullanabilir. Hiçbir kabarcıkları olduğundan emin olun. </li><li> Bir tarafta fare yerleştirin. Göz çıkıntı ve burun 45 ° açıyla gözün arkasındaki damarların içine 100 uL enjekte böylece cildin geri çekin. </li><li> Iğneyi çıkartınız ve kanama kontrolü için hafif basınç uygulayın. </li></ol> Tüm bu prosedürlerde dikkatli yapılmalıdır ve bunlar anestezi kurtarmak kadar farelerin izlenmesi gerekir. Bu protokoller Pennsylvania Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. 4. Deneysel Hasat: 22 Gün <ol><li> CO 2 ile fareler Euthanize. </li><li> Arka% 70 etanol ve yerine ıslak fare. </li><li> Künt Forc kullanmaeps, fare karın kavramak ve deride küçük bir kesi yapmak. Dikkatle makasla cilt kaldırmak ve göğüs kafesi ve karın zarı ortaya. </li><li> Periton açın kesin. Bir Pasteur pipeti ile kan kurtarmak için abdominal aort kesin. Buz üzerinde saklayın. </li><li> Diyafram maruz karaciğer aşağı hareket ettirin. Diyafram kesmek için ince makas kullanın. Dikkatle akciğer dokusunun açığa göğüs kafesinin açık kesti. </li><li> Ince forseps ile akciğer drenaj parathymic lenf düğümleri kurtarın. Bunlar timus 9 her iki tarafında, göğüs kafesinin altında sıkışmış vardır. 1mL steril ortam içinde buz üzerinde deposu (DMEM Invitrogen tüm% 10 ısı-inaktive edilmiş fetal buzağı serumu, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 2 mM L-glutamin, 50 uM 2-merkaptoetanol, takviye). </li><li> BAL kurtarmak ve histolojik analiz için akciğerlerini şişirmek için, zor entübasyon yapılmalıdır. Tarafına tükürük bezlerinin hareket ettirerek trakea Açığa ve placitrakea altında ng ince forseps. Ince makas kullanarak, trakeanın ortasında bir delik ve ciğerlerine tüp yerleştirin. Cerrahi iplik ile bağlayarak boru sabitleyin. </li><li> Boru için PBS dolu 1 ml şırınga takın ve 1 mL PBS ile akciğerlerini şişirmek. Dikkatle şırınga ile BAL yıkama almak. Buz üzerinde saklayın. </li><li> Boru için PBS dolu 1 ml şırınga içinde% 4 paraformaldehit (PFA) takın ve akciğerleri şişirmek. </li><li> Tüp çıkarın ve PFA sızmasını önlemek için cerrahi iplik sıkın. </li><li> Dikkatle 5 ml% 4 PFA ile 50 ml Falcon tüp akciğer dokusu ve yerde dışarı incelemek. </li></ol> 5.. Kurtarılan Dokular hazırlanması <ol><li> Serum: Kan pıhtılaşma için 30 dakika için 2 saat süreyle buz üzerinde aşağıdaki depolama, serumu (13000 x g / dak 10/4 ° C) santrifüjle kandan geri kazanılır. Serum -20 ° C&#39;de muhafaza edilir ve sitokin ELISA&#39;lar ya S. için kullanılabilir mansoni yumurta antijen spesifik IgG izotip ELISA&#39;larla <sup&gt; 6, 10. </li><li> Lenf düğümleri: Tek hücre süspansiyonları hazırlandı ve hücre sayımı, bağışıklık cevabı büyüklüğü değerlendirmek için kullanılmıştır. Th2&#39;nin kutuplaşma incelemek için, hücrelerin S. ile tekrar uyarılır 72 saat mansoni yumurta antijen. Intracellar sitokin boyama akış sitometresi ile incelendi edilebilir, ve süpernatanlar Th2 sitokinlerin ELISA (IL-4, IL-5, IL-13) 6 kurtarılmış ve -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> BAL: Hücreler (400 xg / 5 dak / 4 ° C) pelet vardır. BAL sıvısı ELISA ile Th2 sitokin analizi için iyileşti ve -20 ° C&#39;de saklanır. BAL hücre sayımı hava yolu iltihabı için bir gösterge olarak kullanılır. 10,000-100,000 hücreleri (500 devir / dk 5/4 ° C) arasında Cytocentrifuge preparatlar, Diffquik boyama takiben inflamatuar sayımı 4, 6 infiltrasyonu izin verir. Alternatif olarak, BAL hücreler flow sitometri 6 tarafından muayene edilebilir. </li><li> Akciğer dokusunun: Akciğer dokusunun stor olduğunu4 &#39;de bir gece ed ° C. Sabit doku parafine gömülü, kesitli ve histolojik ve immünfloresan analiz için kızaklar üzerinde monte edilebilir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Bu protokol detayları (i) in vivo kullanımı için Schistosoma mansoni yumurta (Şekil 1), (ii) duyarlı ve bu yumurta ile farelerin meydan saflaştırılmış ve (iii) akciğer inflamatuar yanıtın incelenmesi için organlarını kurtarmak hazırlamak için gerekli tüm adımları. Bu in vivo modelde tekrarlanabilir güçlü bir Th2 akciğer enflamatuvar yanıt yönlendirir. Bu gibi BAL hücre sayımı ve cytocentrifuge preparatları (Şekil 2) görselleştirilmiş hava yolu inflamasyonu ve eozinofili ile gösterilir. H &amp; E boyalı akciğer bölümleri yumurta bağlı granülomlar (Şekil 3a) için muayene ve akciğer bölümlerinin immünofloresan boyama alternatif aktive makrofajlar ve bu tür dirençler gibi Th2 sitokin kaynaklı genlerin görselleştirme sağlar edilebilirkalay gibi molekülü (AHLAK) α (Şekil 3b). Antijene spesifik CD4 Th2 sitokin yanıtı, IL-5 ELISA&#39;lar tarafından incelenmiştir, IL-4 ve antijen-uyarılmış parathymic lenf düğümü hücreleri IL-13 (Şekil 4). Edilir <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig1.jpg" /> Şekil 1 Schistosoma mansoni yumurta enjeksiyon modeli Temsilcisi yüksek S.mansoni-yumurta yüklerin karakteristik granülomatöz karaciğerinin resim, ve S.mansoni yumurta gösterilir -.. Ortalama büyüklüğü (L) (W) 50 mikron ile 120 mikron. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig2.jpg" /> Şekil 2. S. mansoni yumurta enjeksiyon hava yolu inflamasyonu sürücüler. A. Naif (N) veya S.mansoni (Sm) yumurta enjekte edilen farelerin BAL hücre sayıları (x10 5). * P &lt;0.05. BAL hücrelerinin B. Cytocentrifuge hazırlanması. Mac, MAKROFAJ; Eos, eozinofil; LENF, lenfosit. Bar, 10 mikron. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig3.jpg" /> Şekil 3. Pulmoner granülomlar ve S.mansoni yumurta çevresindeki alternatif aktive makrofajların görselleştirilmesi. A. Sm yumurta (siyah ok) çevreleyen Pulmoner granülom H &amp; E boyalı akciğer bölümlerde görüntülendi. RELMα B. immünofloresan boyaması (yeşil), mannoz reseptörü (kırmızı) ve DAPI (mavi) autofluorescent Sm yumurta (siyah ok) çevreleyen granüloma alternatif aktive makrofajlar (beyaz ok) açığa çıkarır. Bar, 50 mikron. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig4.jpg" /> Şekil 4. S.mansoni yumurta antijen spesifik Th2 sitokin yanıtı. Yumurta enjekte naif (N) veya Sm farelerden parathymic lenf hücrelerinin boşaltılması Sm ile uyarıldı &lt;/ Em IL-4, IL-5, IL-13 için süpernatan ELISA ardından 72 saat boyunca&gt; yumurta antijeni,. Ölçek, ng / ml. * P &lt;0.05.

<ol><li>World Health Organization. Prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis: report of a WHO expert committee. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WHO+Technical+Report+Series+912%22">WHO Technical Report Series 912</a>. , Geneva. (2002).</li>
<li>Pearce, E. J., MacDonald, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunobiology+of+schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunobiology of schistosomiasis.</a> Nat. Rev. Immunol. 2, 499-511 (2002).</li>
<li>Sandler, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+profiles+during+acute+pathogen-induced+pulmonary+inflammation+reveal+divergent+roles+for+Th1+and+th2+responses+in+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Global gene expression profiles during acute pathogen-induced pulmonary inflammation reveal divergent roles for Th1 and th2 responses in tissue repair.</a> J. Immunol. 171, 3655-3667 (2003).</li>
<li>Perrigoue, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-31-IL-31R+interactions+negatively+regulate+type+2+inflammation+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">IL-31-IL-31R interactions negatively regulate type 2 inflammation in the lung.</a> J. Exp. Med. 204, 481-487 (2007).</li>
<li>Sandor, M., Weinstock, J. V., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulomas+in+schistosome+and+mycobacterial+infections%3A+a+model+of+local+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Granulomas in schistosome and mycobacterial infections: a model of local immune responses.</a> Trends Immunol. 24, 44-52 (2003).</li>
<li>Nair, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatively+activated+macrophage-derived+RELM-%7Balpha%7D+is+a+negative+regulator+of+type+2+inflammation+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Alternatively activated macrophage-derived RELM-{alpha} is a negative regulator of type 2 inflammation in the lung.</a> J. Exp. Med. 206, 937-952 (2009).</li>
<li>Dalton, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+isolation+of+schistosome+eggs+and+miracidia+free+of+contaminating+host+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">A method for the isolation of schistosome eggs and miracidia free of contaminating host tissues.</a> Parasitology. 115, 29-32 (1997).</li>
<li>Lewis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+laboratory+maintenance+of+Schistosoma+mansoni%2C+with+observations+on+three+schistosome%2Fsnail+host+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Large-scale laboratory maintenance of Schistosoma mansoni, with observations on three schistosome/snail host combinations.</a> J. Parasitol. 72, 813-829 (1986).</li>
<li>Tilney, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+lymphatic+drainage+in+the+adult+laboratory+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat.</a> J. Anat. 109 (Pt. 3), 369-383 (1971).</li>
<li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> Current protocols in immunology. Coligan, J. E. Chapter 19, Unit 19(2001).</li>
<li>Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th2+cells+are+required+for+the+Schistosoma+mansoni+egg-induced+granulomatous+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th2 cells are required for the Schistosoma mansoni egg-induced granulomatous response.</a> J. Immunol. 160, 1850-1856 (1998).</li>
<li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrotic+disease+and+the+T%28H%291%2FT%28H%292+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm.</a> Nat. Rev. Immunol. 4, 583-594 (2004).</li>
<li>Cheever, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+hepatic+fibrosis+and+granuloma+size+among+mouse+strains+infected+with+Schistosoma+mansoni%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Variation of hepatic fibrosis and granuloma size among mouse strains infected with Schistosoma mansoni.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 37, 85-97 (1987).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada, tip 2 akciğer iltihabı teşvik için Schistosoma mansoni yumurta kullanan bir model açıklanmıştır. Bu modelin karakteristik özellikleri güçlü Th2 immün yanıt, hava yolu inflamasyonu ve pulmoner granülom oluşumu vardır. Bu parametreler CD4 Th2 hücre yanıtlarının 11 bağımlı olmaları nedeniyle, bu Th2 hücre yanıtları protein özgü veya soy-spesifik delesyonlar etkilerini araştırmak için yararlı bir modeldir. Burada okuma antijen spesifik Th2 sitokinlerin ölçümü, hava yollarında hücre infiltrasyonu ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Boyutu / Açıklama </td><td> Şirket </td><td> # Kataloğa </td></tr><tr><td> Kollajenaz / Dispase </td><td> 500 mg </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11 097 113 001 </td></tr><tr><td> Diff Quik Hema 3 Leke </td><td> Paketlemek </td><td> Fisher Scientific Co LLC </td><td> 122-911 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sıvı </td><td> Gibco </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> Falcon 50mL </td><td> Paketlemek </td><td> Şahin </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> Intramedic PE Boru </td><td> 0.58 mm </td><td> Becton Dickinson and Co </td><td> 427410 </td></tr><tr><td> Izofluran </td><td> 250 mL </td><td> Abbot Hayvan Sağlığı </td><td> 52600405 </td></tr><tr><td> Ketamin </td><td> 100 mg / mL </td><td> Fort Dodge, Hayvan Sağlığı </td&gt; <td> N / A </td></tr><tr><td> Manoz alıcı antikorunu </td><td> Biotin </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA2235B </td></tr><tr><td> Metalik Süzgeç </td><td> Standart mutfak süzgeci </td><td> Hedef </td><td> Laurentiis </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> % 16 </td><td> Elektron Microsc. Bilimler </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> 100x </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> 1 Litre </td><td> GE Healthcare Biosciences </td><td> 17 01 0891 </td></tr><tr><td> RELMα antikoru </td><td> 50 mcg </td><td> Peprotech </td><td> 500-P214 </td></tr><tr><td> Cerrahi Konu </td><td> 2.0 USP 100 yds </td><td> Cerrahi Uzmanlıkları Corp </td><td> SP118 </td></tr><tr><td> Şırınga İğnesi </td><td> 23g, 3/4 inç </td><td> BD Vacutainer Lab. Med. </td><td>305143 </td></tr><tr><td> ABD Standart Test Elek </td><td> 150 um, 0,0059 &quot; </td><td> WS Tyler, Inc </td><td> ASTME-11, Spec. 100 sayılı </td></tr><tr><td> Ksilazin </td><td> 20 mg / ml </td><td> Baş uşak </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

gelen yumurta kullanma<em&gt; schistosoma mansoni</em&gt; bir şekilde<em&gt; in vivo</emhelmint bağlı akciğer iltihabı ve&gt; model

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parazitleri dünyada tahminen 200 milyon kişi 1 enfekte kan kurtları vardır. Schistosoma, karaciğer fibroz ve splenomegali de dahil olmak üzere ciddi patoloji, kronik enfeksiyon oldukça parazitin kendisini 2 den parazit yumurtaları için bağışıklık yanıtı kaynaklanır. Parazit yumurtaları, IL-4 üretimini, IL-5, IL-13, makrofaj alternatif aktivasyonu ve eozinofillerin alımı ile karakterize edilen, Th2 tepkisinin uyarılmasından. Burada, parazit özgü akciğer Th2 sitokin yanıtları ve lenf düğümleri, yumurta çevreleyen pulmoner granuloma oluşumu ve hava yolu inflamasyonu incelemek için bir model olarak Schistosoma mansoni yumurta enjeksiyonu açıklar. Intraperitoneal hassasiyete ve intravenöz meydan, S. ardından mansoni yumurta onlar akciğer parankimi içinde sıkışıp kalırlar pulmoner arterler yoluyla akciğere taşınırlenfositler, eozinofiller ve alternatif aktive makrofajlar 3-6 oluşan granülomlarlakarakterize. Bronko-alveolar alanlarda granülom oluşumu, inflamasyon ile ilişkili, lenf düğümleri ve CD4 genişleme T hücre aktivasyonu görülebilir. Burada ayrıntı, enfekte ciğeri (7 değiştirilerek) den Schistosoma mansoni yumurta tecrit fareler hassasiyet ve zorlu ve analizi için organların (bronko-alveolar lavaj (BAL), akciğer ve lenf düğümleri) kurtarmak için protokol. Biz de temsilcisi histolojik ve ek immünolojik analizi için immünolojik veriler ve öneriler içerir. Genel olarak, bu yöntem, in vivo modelde, bir parazit enfeksiyonu, fibrotik hastalıkları, alerjik enflamasyon ve astım da dahil olmak üzere Th2 enflamatuar hastalıkların çalışması için genel olarak uygulanabilir olan, akciğer parazit kaynaklı immünolojik yanıtları araştırmak için sağlamaktadır. Tipik bir çalışma için, bu modelde avantajlarıAkciğer e 2 iltihabı akciğer güçlü bir Th2 inflamatuvar yanıt tekrarlanabilirlik ve lenf düğümleri, yumurta çevreleyen granülomların histolojik inceleme ile inflamasyonun değerlendirilmesi kolaylığı ve parazit uzun süreli depolama için potansiyel bulunmaktadır yumurta.

Schistosoma mansoni yumurta T hücre tip 2 (Th2) immün yanıt, parazit enfeksiyonu karakteristik, astım ve allerjik inflamasyonun güçlü uyarıcılar vardır. Bu protokol S. kullanır CD4 Th2 sitokin bağlı inflamatuar yumurtanın etrafında akciğer granülom oluşumu ile karakterize, akciğerin yanıt, eozinofili ve makrofaj aktivasyonu alternatif oluşturmak için mansoni yumurta enjeksiyon.

Gelen Yumurta kullanma<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Bir şekilde<em&gt; In vivo</emHelmint bağlı Akciğer iltihabı ve&gt; Model

Schistosoma parazitleri, dünya çapında tahminen 200 milyon insanı enfekte eden kan fluke'larıdır 1. Kronik Schistosoma enfeksiyonunda, şiddetli ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, akciğer inflamasyonunu ve bağışıklık hücresi yanıtlarını incelemektir. Bu, shta enfekte karaciğerlerden helmint yumurtalarının saflaştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, fareler saflaştırılmış yumurtalarla immunize edilir ve maruz bırakılır; bu işlem, güçlü bir akciğer inflamatuar yanıtı oluşturur.Ardından, kaska karşı verilen inflamatuar yanıtın büyüklüğünü değerlendirmek amacıyla farelerin akciğerleri ve drenaj yapan lenfoid organları izole edilir. Elde edilen sonuçlar, akciğere inflamatuar hücrelerin göçü ve yumurtanın tetiklediği akciğer patolojisinin gözlemlenmesine dayanarak, hel kaynaklı güçlü bir akciğer inflamasyonu olduğunu göstermektedir. Genel olarak, bu tekniğe yeni başlayan kişiler, yumurtaların enjeksiyonunun yanı sıra akciğer ve lenf nodlarının diseksiyonu için gereken hassasiyet ve dikkat nedeniyle biraz zorlanabilirler.Bununla birlikte, bu tekniği mükemmelleştirmek, helmint yumurtalarına karşı gelişen güçlü inflamatuar akciğer yanıtının görselleştirilmesine olanak tanıdığı için ödüllendiricidir. Tekniği göstermektedirler; Nyer ve Greenberg laboratuvarındaki teknisyenler Karen ve will, Schistosoma circ ile enfekte edilmiş ve ötanize edilmiş bir fareyi sırtüstü yatırıp peritonu açığa çıkarmak için deri üzerinden bir insizyon yaparlar, göğüs kafesi ve diyaframın altında bulunan karaciğeri çıkarırlar, karaciğerleri ince ince kıyarlar ve karaciğer başına, PBS içinde kollajenaz, dys, baz, penisilin ve streptomisin içeren 20 mililitre sindirim karışımı eklerler. Bu karışımı 50 mililitrelik bir Falcon tüpüne yerleştirip 37 °C'deki bir çalkalayıcıda gece boyunca inkübe ederler.Ertesi gün. Karışımı santrifüjleyin. Fazla sıvıyı dökün, tüpü PBS ile doldurup tekrar santrifüjleyin ve son santrifüjlemeden sonra PBS yıkama işlemini tekrarlayın.Pelleti 25 mililitre PBS içinde yeniden süspande edin. Ardından, yeniden süspande edilen pelleti metal bir süzgeçten geçirin ve devamında bir elekten geçirin. Bu süzülmüş karışımı 50 mililitrelik bir Falcon tüpüne yerleştirin ve santrifüjleyin.Süpernatantı dökün ve yeniden süspande edin. Pelleti üç mililitre PBS içinde süspande edin. Karışıma nazikçe; her bir tüp başına sekiz mililitre ve 32 mililitre 0,25 molar sakrozdan oluşan 40 mililitrelik bir gradyan üzerine ekleyin ve 20 °C'de 800 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Ardından, transfer pipeti kullanarak karaciğer hücrelerinin üst tabakasını uzaklaştırın. Alttaki yumurta peletini çıkarın ve 50 mililitrelik bir falcon tüpe yerleştirin. Peleti, EDTA ve EGTA içeren 10 mililitrelik PBS içinde üç kez yıkayın ve santrifüjleyin.Çökeltiyi 500 µL PBS içinde yeniden süspanse edin. Bu karışımı, 2,5 mL Percoll ve 7,5 mL 0,25 M sükroz içeren yeni bir 10 mL gradyanın üzerine ekleyin ve santrifüjleyin. Çökeltiyi üç kez 10 mL içinde yıkayın.PBS ve santrifüj. Falcon tüpünün iyice karıştırıldığından emin olun ve son yıkamadan 50 µL alın. Yumurtaları saymak için 50 µL'yi seyreltin.450 µL PBS ile karıştırın ve damlacıkları saymak için bir diseksiyon mikroskobu sahnesindeki cam lama bu karışımdan 100 µL ekleyin; yumurtaları PBS içinde mililitre başına 50.000 yumurta olacak şekilde yeniden süspande edin. Yumurtalar -80 °C'de birkaç ay boyunca saklanabilir ve kullanım için bir veya iki kez çözdürülebilir. Kullanmadan önce, beş mililitrelik snap kapaklı bir tüp içindeki yumurtaların hala sağlam olduğunu doğrulamak için mikroskop altında inceleyin.Enjeksiyon için yumurtaları 100 µL PBS başına 5.000 yumurta olacak şekilde hazırlayın. Gereken miktardan %50 daha fazla yumurta hesaplayın. 23 gauge, 5/8 inçlik bir iğneyi ve 1 mL'lik bir şırıngayı, fare başına 100 µL yumurta süspansiyonu ile doldurun.Her enjeksiyondan önce yumurtaları karıştırmak için şırıngayı ileri geri sallayın ve sensitisasyondan 14 gün sonra her fareye intraperitonal olarak 100 µL süspansiyon enjekte edin. Yumurtaları daha önce olduğu gibi 100 µL'de 5.000 yumurta olacak şekilde hazırlayın ve bir mililitrelik şırıngaya 23 gauge iğne ile birlikte yumurtaları doldurun. İğneyi 90 derecelik bir açıyla bükmek için pens kullanın ve hiç hava kabarcığı kalmadığından emin olun.Fareyi anestezi edin ve yan tarafı üzerine yerleştirin. Süspansiyonun 100 µL'sini, buruna 45 derecelik bir açıyla göz arkasındaki damarlara enjekte edin. İntravenöz uygulama sonrası sekiz gün geçtikten sonra fareyi ötanize edin ve abdomen derisinde küçük bir insizyon yapın.Peritonu kesin ve abdominal aortayı bulun. Kanı bir pastör pipeti ile toplamak için aortayı kesin ve bunu buz üzerinde saklayın. Diyaframı açığa çıkarmak için karaciğeri aşağıya doğru hareket ettirin.Diyaframı kesmek için ince makas kullanın ve dikkatlice kesin. Akciğer dokusunu açığa çıkarmak için göğüs kafesini açın. Paratiymik lenf düğümleri, göğüs kafesinin altında, akciğerlerin üzerinde ve timusun her iki yanında yer alır.Lenf nodlarını ince pensle geri kazanın ve bir mililitre steril besiyeri içerisinde buz üzerinde saklayın. Entübasyon prosedürüne başlamak için, trakeyi açığa çıkarmak amacıyla tükürük bezlerini yana kaydırın. Trakeanın altına ince bir pens yerleştirin ve ince makas kullanarak işlemi gerçekleştirin.Trakenin ortasında bir delik açın ve tüpleri akciğerlere yerleştirin. Tüpleri cerrahi iplikle bağlayarak sabitleyin. Şimdi, tübe PBS ile doldurulmuş bir mililitrelik bir şırınga takın ve akciğerleri bir mililitre PBS ile şişirin.BAL yıkama sıvısını şırınga ile dikkatlice geri çekin ve buz üzerinde saklayın. Ardından, PBS içinde %4 paraformaldehit içeren bir mililitrelik bir şırıngayı tüpe bağlayın ve akciğerleri şişirin. Daha sonra, PFA sızıntısını önlemek için tüpü çıkarın ve cerrahi ipi sıkılaştırın.Son olarak, akciğer dokusunu dikkatlice diseke edin ve PBS içinde %4 PFA içeren beş mililitrelik bir 50 mililitrelik falcon tüpüne yerleştirin. Buz üzerinde 0,5 ila iki saatlik inkübasyonun ardından, serum tabakasını ayırmak için toplanan kanı santrifüjleyin; serum, S. mansoni yumurta antijeniye özgü IgG izotip ELISA'ları için kullanılabilir. Eksize edilen paraik lenf düğümleri, antijene özgü TH2 sitokinlerini analiz etmek için S. mansoni yumurta antijeni ile yeniden stimüle edilebilir. Santrifüjleme ve hücreleri pelitleme işlemlerinin ardından, ELISA ile TH2 sitokinlerinin analizi için BAL sıvısını geri kazanın. BAL hücreleri, sitosantrifüj preparasyonu için geri kazanılır.Histolojik ve immünofloresan liz için gece boyunca fikse edilmiş akciğer dokusu; burada yüksek Schistosoma mansoni yumurta yükünün karakteristik özelliği olan granülomatöz karaciğerlerin resimleri gösterilmektedir. Ayrıca S. mansoni yumurtaları da resmedilmiştir. Bu şekil, S. mansoni yumurtalarının enjeksiyonu ile tetiklenen hava yolu inflamasyonunu temsil etmektedir.Soldaki grafik, BAL hücre sayılarının s mansoni yumurtası enjekte edilen farelerde, naif farelerle karşılaştırıldığında çok daha yüksek olduğunu göstermektedir. Soldaki görüntüler temsili sitosantrifüj hazırlıklarıdır. BAL hücreleri ile makrofajlar, eozinofiller ve lenfositlerden oluşan inflamatuar infiltrat burada net bir şekilde gözlemlenebilir.Esson yumurtasını çevreleyen pulmoner bir granülom, H ve E boyalı bir akciğer kesitinde gösterilmiştir. Bu görüntü, yeşil renkte gösterilen realm alpha için immünofloresan boyamayı betimlemektedir. Kırmızı renkte gösterilen mano reseptörü ve mavi renkte gösterilen DPI boyası, beyaz okla belirtilen alternatif olarak aktive olmuş makrofajları ortaya çıkarmaktadır.S. mansoni yumurta antijenine özgü TH2 sitokin yanıtları, naif ve S. mansoni enjekte edilmiş farelerin paraik lenf nodlarında burada gösterilmiştir. Her gruptan alınan lenf nodu hücreleri, 72 saat boyunca S. mansoni yumurta antijeni ile stimüle edilmiştir. Ardından, süpernatantın IL-4, IL-5 ve IL-13 için ELISA'sı gerçekleştirilmiştir.Üç inflamatuar sitokinin konsantrasyonları, esman enjekte edilen farelerde gelişimden sonra çok daha yüksekti. Bu teknik, alerji ve helmint enfeksiyonu alanındaki araştırmacıların, bir fare model organizmasında paraziter helmint enfeksiyonu ve alerjiye yanıt olarak çağrılan bağışıklık hücrelerini incelemeleri için kolay bir yol sunmaktadır.

using-eggs-from-schistosoma-mansoni-as-an-vivo-model-helminth-induced

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Trichuris muris enfeksiyon dayanıklı farelerde koruyucu bir Th2 yanıtı oluşturmak ve duyarlı fareler patolojik bir Th1 yanıtı Th2 dokunulmazlık bağırsak modelidir.

Trichuris muris Enfeksiyon: Gut Tip 2 Bağışıklık ve İnflamasyon Bir Model

Cercarial Dönüşüm ve In vitro Yetiştiriciliği Schistosoma mansoni Schistosomules

Heligmosomoides polygyrus yakından yüksek yaygın insan helmint enfeksiyonu benzeyen güçlü bağışıklık yetenekleri ile bir kemirgen nematod olduğunu. Burada H. uzun vadeli bakım için bir protokol tarif polygyrus yaşam döngüsü.

Yetiştirme<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; Bir immunsupresif Nematodu Parazit ve Salgılanmış Ürünleri

Bu makalede büyük ölçekli axenic yalıtım ve insan kan fluke Schistosoma mansoni free-swimming miracidia toplanması için bir protokol ve onların sonraki işlem vitro kültür içine giriş için.

Kitle yalıtım ve Intramolluscan insan kan Fluke Schistosoma Mansoni aşamalarında Vitro ekimi

Burada kriket yumurtaları enjekte etmek için bir protokol salıyoruz, kriketteki birçok deneyde temel bir yöntem olarak hizmet veren bir teknik, RNA paraziti ve genomik manipülasyon dahil, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere.

Enjekte Gryllus bimaculatus Yumurta

Burada, sporozoitler veya ikinci nesil merozoitler nükleofekting tavuk Eimeria parazitlerin kararlı transfeksiyon elde etmek için bir yöntem sağladı. Heterolog antijenik genleri ifade eden genetiği değiştirilmiş eimerian parazitler aşı dağıtım aracı olarak kullanılabilir.

Tavuk Eimeria Parazitlerinin Nükleofeksiyon uyup In Vivo Propagation

Caenorhabditis elegans'ın mikrosporidian parazit Nematocida parisii tarafından enfeksiyonu, solucanların aynı patojene karşı oldukça dirençli yavrular üretmesini sağlar. Bu, kötü anlaşılmış bir epigenetik fenomen olan kalıtsal bağışıklığın bir örneğidir. Mevcut protokol, genetik olarak izlenebilir bir solucan modelinde kalıtsal bağışıklığın incelenmesini açıklamaktadır.

Caenorhabditis elegans Mikrosporidia Enfeksiyonu Modelinde Kalıtsal Bağışıklığın İncelenmesi

IL-9 eksprese eden T ve ILC2 hücreleri, N. brasiliensis enfeksiyonu sırasında indüklenir, ancak düşük frekansları ve diferansiyel kinetik olmaları nedeniyle enfekte bağırsakta karakterizasyonları büyük ölçüde göz ardı edilmiştir. Bu protokol, bu hücrelerin farklı hedef organlardan izole edilmesini ve farklı enfeksiyon aşamalarında akış sitometrisi yoluyla kimliklerinin doğrulanmasını açıklar.

Nippostrongylus brasiliensis Enfeksiyon Modelinde IL-9 Üreten Lenfoid Hücrelerin İncelenmesi İçin Bir Strateji

Strongyloides ratti , laboratuvar farelerinde geçici enfeksiyonlara neden olan, doku göçü ve bağırsak yaşam evrelerini gösteren parazitik bir nematoddur. Burada, sıçanlarda parazit döngüsünün sürdürülmesi ve kafa, akciğer ve bağırsakta parazit miktar tayini dahil olmak üzere farelerin deneysel enfeksiyonu için bir protokol sunuyoruz.

Farelerin Parazitik Nematod Strongyloides ratti ile Deneysel Enfeksiyonu

Burada, Echinococcus granulosus'tan in vitro kültür koşullarını, izolasyonu ve hücre dışı veziküllerin (EV'ler) artan oluşumunu açıklıyoruz. Küçük EV'ler, dinamik ışık saçılımı ve transmisyon elektron mikroskobu ile karakterize edildi. Kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerin tutulumu ve fenotipik modülasyonları, konfokal mikroskopi ve akış sitometrisi kullanılarak incelendi.

Echinococcus granulosus'tan Küçük Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Dendritik Hücre Alımı

Bu çalışmada, Tithonia diversifolia ekstraktlarının biyolojik aktiviteleri, küçük ruminantlarda gastrointestinal nematodlar üzerindeki etkilerini değerlendirmek için radikal bazlı yöntemler ve in vitro yumurta kuluçka testi (EHA) kullanılarak değerlendirilmiştir. Metodoloji ve temel bulgular açıklanmakta ve bu ekstraktların parazitleri kontrol etme potansiyeli vurgulanmaktadır.

Tithonia diversifolia Ekstraktlarının Gastrointestinal Nematod Yumurtalarına Karşı Antioksidan ve Antelmintik Özelliklerinin İn Vitro Deneyler Kullanılarak Değerlendirilmesi

Öğrenin Schistosoma mansoni yumurtaları kullanarak akciğer inflamasyonunu ve bağışıklık hücre yanıtlarını in vivo fare modelinde nasıl araştırılacağını. Bu yöntem helmint enfeksiyonlarındaki immün mekanizmaları anlamak için değerlidir.

Gelen Yumurta kullanma

Daha fazla video keşfet