Fareler ve Merkezi Sinir Sisteminde Kök Hücre İmplantasyonu Multimodal Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, fare beynine nakledilen kök hücrelerin in vivo davranışında standart bir takip elde etmektir. Bu, ilk olarak, EGFP ve lusiferazı floresan mikron boyutlu demir oksit parçacıkları ile birlikte eksprese eden kemik iliğinden türetilmiş stromal hücrelerin etiketlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, MPIO işaretli BMC'leri fare beyin dokusuna uygun şekilde enjekte etmektir.

Daha sonra, hücre greftlerinin sağkalımı ve lokalizasyonu, biyolüminesans görüntüleme ve manyetik rezonans görüntüleme kullanılarak non-invaziv olarak takip edilir. Son adım, postmortem histolojik analiz kullanarak in vivo görüntüleme sonuçlarını doğrulamaktır. Bu yöntemler, fare beynine nakledildikten sonra kök hücrelerin davranışı hakkında fikir verebilir, ancak model organizmalar ve bir hastalığın çalışmaları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

İntravenöz ve intraserebral enjeksiyonların gerçekleştirilmesi zor olduğundan ve hayvanların hayatta kalması için belirli riskler içerdiğinden, hayvan işleme adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Bu prosedüre başlamak için, altı buzul mavisi mikron boyutlu demir oksit parçacıklarına 75 kez 10 ekleyin. Endositoz yoluyla partikül alımına izin vermek için 16 saat daha inkübe edin, ardından kalan partikülleri yıkayın.

Hücre koakıcılığı, akıcılığı ve G-B-M-P-I-O'nun homojen dağılımını elde etmek için hücrelerin 24 saat daha büyümesine izin verin. Bundan sonra, EGFP pozitif ve G-B-M-P-I-O pozitif hücrelerin toplam EGFP pozitif hücre miktarına oranını hesaplayarak partikül alımını görsel olarak doğrulamak için floresan mikroskobu kullanın. Daha sonra, BMSC lusiferaz EGFP hücreleri etiketli G-B-M-P-I-O'yu 10 mililitre ile iki kez yıkayın.

PBS, hücreleri tripsin EDTA ile tedavi eder ve daha sonra hasat eder. Ödül daha sonra hücreleri yıkayın ve PBS'de mililitre başına 133 kez 10 ila altıncı hücre nihai konsantrasyonda yeniden süspanse edin. Son olarak, hücreleri nakil olana kadar buz üzerinde tutun.

Bu prosedürde, fareyi kilogram başına 80 miligram ketamin ve kilogram başına 16 miligram ksilazin karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun. Farenin uykuya dalması için beş dakika bekleyin, ardından steril manipülasyonlara izin vermek için başını tıraş edin. Daha sonra fareyi stereotaktik bir çerçeveye yerleştirin, cildi alkolle dezenfekte edin.

Bundan sonra, gözlerine merhem sürün Dehidrasyonu önlemek için. Hipokampusu hedeflemek için kafatasını ortaya çıkarmak için orta hat kafa derisi kesisi yapın. Bir diş matkabı çapağı kullanarak kafatasında iki milimetre arkada ve iki milimetre yanal olarak bir delik açın.

Bu noktada, hücre süspansiyonunu kısaca girdaplayın, ardından hücre süspansiyonunu şırıngada aspire edin. Daha sonra iğne şırıngasını dura altında 2,5 milimetre derinliğe indirin ve bir dakika boyunca basınç dengesine izin verin. Bir dakika sonra, iğneyi duranın altında iki milimetrelik bir konuma geri çekin.

Ardından, dakikada 0.70 mikrolitre hızında otomatik bir mikro enjeksiyon pompası kullanarak üç mikrolitre hücre süspansiyonu enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, enjekte edilen hücre süspansiyonunun geri akışını önlemek için beş dakika daha bekleyin. Ardından, iğneyi yavaşça geri çekin.

Daha sonra cilt sınırlarını dezenfekte edin, ardından cildi dikin. Dehidrasyonu önlemek için deri altına 300 mikrolitre% 0.9 sodyum klorür çözeltisi enjekte edin. Sonunda, biyolüminesans görüntüleme yapmak için anesteziden iyileşmeye izin vermek için fareyi bir ısıtma lambasının altına yerleştirin.

Fareyi %3 izo, flor ve oksijen karışımı ile uyuşturun. Ardından fareyi foton görüntüleyiciye yerleştirin. Flor isofini% 1.5'e ayarlayarak anestezi seviyesini azaltınArdından, vücut ağırlığının kilogramı başına 150 miligram intravenöz olarak d Lucifer enjekte edin.

Foto görme yazılımını kullanarak beş dakika boyunca görüntü elde edin. Bundan sonra, M three vision yazılımını kullanarak görüntü işleme gerçekleştirin ve sabit ilgi alanlarını kullanarak gözlemlenen sinyali ölçün. Manyetik rezonans görüntüleme yapmak için, fareyi oksijen ve nitrik oksit karışımı içinde %3 ISO flor ile uyuşturun.

Ardından fareyi yatay bir 9.4 Tesla MR sisteminin sınırına yerleştirin. Flor izini %1'e ayarlayarak anestezi seviyesini azaltınArdından, dehidrasyonu önlemek için farenin gözlerine merhem sürün. Bundan sonra, vücut ısısını izlemek için bir rektal prob kullanın.

Ardından, solunum hızını izlemek için farenin göbeğinin altına bir sensör yerleştirin. Solunum hızını dakikada 110 artı veya eksi 10 kez koruyun ve vücut ısısını 37 artı veya eksi 0,5 santigrat derece gibi dar bir aralıkta sabit tutun. Ardından yüzey RF bobinini fare kafasının üzerine yerleştirin.

Fareyi mıknatısın ortasına yerleştirin. Ardından, ParaVision 5.1'i açın: Dizi parametrelerini ekteki el yazmasına göre ayarlayın. Daha sonra, spesifik anatomik bilgi elde etmek için 10 koronal T iki ağırlıklı spin yankı görüntüsünden oluşan bir set elde edin.

NT, kök hücre göçünü incelemek için 70 mikrometre karelik düz bir çözünürlükle iki yıldız ağırlıklı gradyan yankı görüntüleri. Bu adımda, fareyi feda edin ve beyni çıkarın. Beyin dokusunu oda sıcaklığında PBS'de% 4 paraldehitte iki saat boyunca sabitleyin.

İki saat sonra. Beyin dokusunu dört santigrat derecede farklı sakaroz gradyanlarına yerleştirerek kurutun. Ertesi gün, beyin dokusunu sıvı nitrojen kullanarak dondurun ve dokuyu hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Beyin dokusunu bir kriyostat kullanarak 10 mikrometre kalınlığında bölümlere ayırın. Daha sonra, bir floresan mikroskobu altında, G-B-M-P-I-O parçacıklarından mavi floresan ve EGFP eksprese eden hücrelerden yeşil floresan için boyanmamış kriyo bölümlerini tarayın. Ardından, enflamatuar hücrelerden yeşil kırmızı arka plan floresansı için boyanmamış kriyo bölümlerini tarayın.

Açıklanan buzul mavisi MPIO etiketleme prosedürü, floresan mikroskobu ile kolayca doğrulanabilen BMSC, lusiferaz EGFP hücrelerinin yüksek verimli etiketlenmesi ile sonuçlanır. Daha sonra, farelerin CNS'sinde BMSC etiketli G-B-M-P-I-O, lusiferaz EGFP hücrelerinin aşılanması üzerine, hücresel greftin sağkalımı, lusiferaz aktivitesine dayalı in vivo biyolüminesans görüntüleme ile izlenebilir. Ek olarak, aşılanmış hücrelerin tam lokalizasyonu, buzul mavisi MPIO'nun demir içeriğine dayalı olarak in vivo manyetik rezonans görüntüleme ile izlenebilir.

Son olarak, histolojik analiz, biyolüminesans görüntüleme ve manyetik rezonans görüntüleme ile elde edilen sonuçların geçerliliğini gösterir. Stabil sağkalım, geliştirilmesinden sonra zaman içinde stabil bir EGFP ekspresyonu ile doğrulandı. Bu teknik, moleküler görüntüleme alanındaki araştırmacıların, nörodejeneratif hastalıklar için farklı hayvan modellerinde kök hücre nakli sonrası hücresel ve moleküler olayları keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, moleküler görüntülemenin nasıl yapılacağını, biyolüminesans ve manyetik rezonans görüntülemenin nasıl uygulanacağını iyi anlamalı ve postmortem histolojik değerlendirmeyi kullanarak in vivo sonuçları yeterince doğrulamalısınız.