Karboksi Flöresein sukkinimidil ester (KAKE) Kullanarak İnsan Glioblastoma Yavaş-bölme Hücreleri Tanımlama ve İzolasyonu

Bu video protokolü, karboksi floresein sodyum esteri (CFSE) kullanılarak insan glioblastomundaki yavaş bölünen hücrelerin tanımlanmasını ve izole edilmesini göstermektedir. Glioblastom tümör hücreleri önce nörosfer analizi kullanılarak büyütülür. Ardından, elde edilen sferler tekil hücrelere ayrıştırılır ve CFSE ile boyanır.

CFSE yüklü hücreler tekrar ekilir. Nörosfer kültüründe, oluşan sferler tek hücrelere ayrıştırılır ve akış sitometrisi cihazından geçirilir. Yavaş ve hızlı bölünen hücreler, hücre bölünmesinin bir fonksiyonu olarak floresan yoğunluğuna göre tanımlanır ve ayrıştırılır.

Frekans Heterojenitesi, kanserde temel bir özelliktir. Bu heterojenite, tümör dayanıklılığını destekler ve tamamen etkili tedavilerin geliştirilmesinin önünde büyük bir engel teşkil eder. Bu nedenle, genetik, fenotipik ve fonksiyonel olarak tanımlanan bu heterojeniteyi incelemek ve anlamak için araçlar ve analizler geliştirmek kritik öneme sahiptir.

Bu video protokolünde, flues ve I-C-F-S-C kullanan standart bir yöntemi tanımlıyoruz. Bu teknik, farklı fonksiyonel özelliklere sahip insan glioblastoma türevli hücrelerin bir kültüründeki tekil alt popülasyonların akış sitometrisi ile tanımlanmasına ve ayrıştırılmasına olanak tanır. Bu tekniği, tümör başlatma ile ilişkili olduğu gösterilen fonksiyonel bir özellik olan yavaş bölünme hızı sergileyen bir tümör hücre popülasyonunu izole etmek ve karakterize etmek için kullandık. Glioma küre kültürü, ekranda belirtilen adresteki ayrı bir videoda açıklanan nörosfer deneyi kullanılarak kurulur ve sürdürülür.

Glioma küreleri 150 ila 200 mikron çapa ulaştığında, küreleri içeren ortam uzaklaştırılır, uygun boyuttaki steril bir doku kültürü tüpüne yerleştirilir ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 800 RPM veya 110 G'de santrifüj edilir. Ardından süpernatant atılır ve küre peleti bir ml önceden ısıtılmış tripsin EDTA içinde yeniden süspanse edilir ve bir su banyosunda 37 derecede üç ila beş dakika inkübe edilir. Daha sonra, küreleri ayrıştırmak için eşit hacimde tripsin inhibitörü eklenir ve nazikçe pipetle yukarı-aşağı çekilerek karıştırılır.

Hücre süspansiyonu tekrar santrifüj edilir. Süpernatan uzaklaştırılır ve hücreler 1 mL nöral kök hücre bazal medyumu içerisinde yeniden süspanse edilir. Tek hücre süspansiyonundan 10 µL alınarak 90 µL Trypan Blue ile iyice karıştırılır ve boyanacak her 1 milyon hücre için hücre sayımı gerçekleştirilir.

Beş milimolar CFSE boyasından bir mikrolitre, bir mil nöral kök hücre bazal besiyerine eklenerek beş mikromolar nihai boyama konsantrasyonu sağlayacak şekilde bir mil boyama reaktifi hazırlanır. Ardından boyama çözeltisi uygun şekilde karıştırılır. İstenen sayıdaki hücre ayrı bir tüpe aktarılır, santrifüj edilir ve süpernatan uzaklaştırılır.

Ardından CFSE boyama çözeltisi pelete eklenir, homojenlik sağlanana kadar nazikçe karıştırılır ve boyama işlemini durdurmak için oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. CFSE yüklü hücrelere, buz gibi soğuk nöral kök hücre bazal ortamından 5 ila 10 hacim eklenir ve iyice karıştırılır. Hücre süspansiyonu ardından santrifüj edilir ve süpernatan atılır.

Bu aşamada, tüpün dibinde boyamanın başarılı olduğunu gösteren yeşil renkli bir hücre tabakası görülmelidir. Fazla CFSE boyasını uzaklaştırmak için, peleti 1 mL nöro kök hücre bazal medyumu içinde yeniden süspande edip santrifüjleyerek süpernatantı uzaklaştırmak suretiyle iki ila üç yıkama işlemi gerçekleştirilir.

Üçüncü yıkamadan sonra, hücreler 1 ml nöro kök hücre bazal ortamında yeniden süspande edilir ve hücreleri ekmek için daha önce açıklandığı şekilde hücre sayımı gerçekleştirilir. Tam nöro kök hücre ortamı, final konsantrasyonu 20 ng/ml olacak şekilde EGF ile desteklenir. Ardından, CFSE yüklü ve yüksüz gruplardaki hücreler, final konsantrasyonu 50.000 hücre/ml olacak şekilde ilgili tüplere eklenir.

Ardından hücre süspansiyonları iyice karıştırılır ve steril doku kültürü flasklarına ekilir. Flasklar daha sonra etiketlenir. CFSE boyamasını doğrulamak için hücreler floresan mikroskobu altında izlenebilir ve ardından beş ila 10 gün boyunca 37 °C %5CO2 nemlendirilmiş inkübatöre yerleştirilebilir.

Akış sitometrisi kullanarak CFSE boyamasını doğrulamak için, CFSE yüklü ve yüklenmemiş negatif kontrol gruplarından 500, 000 hücre ayrı faks tüplerine aktarılır. Akış sitometresi, ilgili parametreler için kullanıcı kılavuzundaki talimatlara göre ayarlanır. İlk olarak, yüklenmemiş kontrol hücreleri çalıştırılır ve olaylar ileri ve yan saçılım özelliklerine göre kaydedilir; ardından, hücre frekansına karşı CFSE yoğunluğuna dayalı bir histogram grafiğinde, CFSE floresan yoğunluğu düzeyini doğrulamak için ana hücre popülasyonu kapılamayla seçilir (gate edilir).

Ardından, görüldüğü üzere, CFSE yüklü hücreler kontrol hücreleri için kullanılan parametrelerin aynısı kullanılarak analiz edilir. CFSE pozitif hücreler, kontrol hücrelerinden katbekat daha yüksek floresan yoğunluğu sergiler. Glioma küreleri yaklaşık 150 ila 200 mikron ortalama çapa ulaştığında.

Küreler pasajlanır ve daha önce açıklandığı üzere hem CFSE yüklü hem de yüksüz gruplardan tek hücre süspansiyonu hazırlanır. Ardından hücreler, uygun hacimdeki steril 1x PBS içerisinde yeniden süspanse edilir ve ölü veya hasarlı hücreleri dışlamak için hücre sayımı yapılır. Akış sitometrisi ile ayıklama yaparken, yavaş bölünen ve hızlı bölünen hücreleri toplamak için hücre süspansiyonunun ml'si başına bir mikrolitre konsantrasyonda propidyum iyodür eklenir.

Sıralama işlemi sırasında, her biri 1 ml tam nöral kök hücre medyumu içeren iki adet steril 15 ml doku kültürü tüpü hazırlanır. Ardından, hücreler akış sitometrisi tesisine nakledilirken buz üzerinde tutulur. İlk olarak, yüklenmemiş hücre grubundan alınan hücre süspansiyonu akış sitometresinden geçirilir.

Ölü veya hasarlı hücreleri dışlamak için olaylar, ileri saçılım (forward scatter) ile yan saçılım (side scatter) temelinde grafiğe dökülür. Hücreler, yan saçılım ile PI reaktivitesi temelinde grafiğe dökülür ve tek bir canlı hücre popülasyonu birinci popülasyon olarak kapılaştırılır (gated). Ardından, birinci popülasyondan ileri ve yan saçılım özelliklerine göre homojen bir hücre popülasyonu seçilir ve ikinci popülasyon olarak kapılaştırılır. Sonrasında ikinci popülasyon, aynı parametreler ve kapılama stratejisi kullanılarak, logaritmik ölçekte ayarlanmış hücre frekansına karşı CFSE yoğunluğu temelinde bir histogramda grafiğe dökülür.

CFSE ile işaretlenmiş hücreler akış sitometresinden geçirilerek analiz edilir. Ardından, hücrelerin en alttaki %85'i hızlı bölünen, en üstteki %5'i ise yavaş bölünen hücreler olarak kapılandırmasına (gate) tabi tutulur. İlgilenilen bu farklı hücre popülasyonları seçilerek, içerisinde 1 ml komple nöral kök hücre besiyeri bulunan ayrı 15 ml'lik steril doku kültürü tüplerine sort edilir.

Sıralama eşik hızı, saniyede 2.500 olayı geçmeyecek şekilde ayarlanmalıdır. Sıralama işlemi tamamlandıktan sonra hücreler santrifüj edilir, süpernatan atılır ve pelet uygun hacimde besiyerinde yeniden süspanse edilerek hücre sayımı gerçekleştirilir. Ardından, farklı sıralanmış popülasyonlardan elde edilen hücreler, ml başına 50.000 hücre yoğunluğunda ekim yapılır.

20 ng/mL EGF ile desteklenmiş tam nöral kök hücre ortamında, hücreler küreler oluşturmaları için beş ila 10 gün boyunca inkübe edilir. Bu, hücrelere bir örnektir. CFSE boyasıyla yüklendikten kısa bir süre sonra, floresan mikroskobunda gözlemlendiği üzere, tüm hücreler yoğun bir yeşil floresan sergiler.

Bu, ekimden altı gün sonra A-C-F-S-E yüklü hücrelerden türetilmiş temsili bir gliom küresinin görüntüsüdür. Bazı hücrelerin hala çok parlak CFSE boyanmasına sahip olduğuna dikkat edin. Bu, CFSE yoğunluğunun zamanla azaldığını gösteren bir akış sitometrisi histogramı örneğidir.

Mavi, CFSE ile yeni yüklenmiş hücreleri ve bunların floresan yoğunluğunu temsil etmektedir. Bu yoğunluk, kırmızıyla gösterilen yüklenmemiş hücrelerden kat kat daha yüksektir. Yeşil ise hücrelerin bölünmesi nedeniyle, CFSE ile yüklemeden sonraki altı günlük süre boyunca azalan floresan yoğunluğunu temsil etmektedir.

Bunlar, hızlı ve yavaş bölünen popülasyonlar izole edildikten yedi gün sonra büyütülmüş temsili kürelerdir. Küre oluşturma frekansları iki grup arasında farklılık göstermemektedir, ancak CFSC tutan hücreler, CFSC seyrelten hücrelere kıyasla daha yavaş büyür ve daha küçük kürelerle sonuçlanır. Hücre bölünme hızına dayanarak bir hücre alt popülasyonunu tanımlamak ve izole etmek için CFSC'nin kullanılması, sonraki deneyler ve daha ileri karakterizasyonlar için bir başlangıç noktasıdır.

Bu protokol, insan gliyom türevli kültürlerde yavaş bölünen hücrelerin belirlenmesi için bir örnek sunmuştur; ancak diğer tümör hücre tiplerine veya kanserli olmayan sistemlere de uygulanabilir. İzlediğiniz için teşekkür ederiz, bu protokolün araştırmalarınız için faydalı olduğunu umuyoruz.