Name: Karboksi Flöresein sukkinimidil ester (KAKE) Kullanarak İnsan Glioblastoma Yavaş-bölme Hücreleri Tanımlama ve İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Keşfedin, insan glioblastoma yavaş bölünen hücrelerini CFSE boyama ve akış sitometrisi kullanarak tanımlama ve izolasyon yöntemini. Bu teknik tümör heterojenliğini anlamak ve tedavi stratejileri geliştirmek için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Beyin Tümörü Araştırma, Beyin Tümörü Tedavi ve Sağlık Ulusal Enstitüsü (1R21CA141020-01) Preston A. Wells Jr Merkezi Florida Merkezi tarafından desteklenmiştir.

1. Glioblastoma Tek Hücre Süspansiyon hazırlanması <ol><li> Gliomasphere kültür kurulmuş ve daha önce anlatıldığı gibi 2,11,12 neurosphere tahlil (NSA) kullanılarak korunur. </li><li> Gliomaspheres pasajlanmasını için uygun bir zamanda, küre içeren orta boy bir uygun steril doku kültür tüpüne yerleştirilir, silinir, ve oda sıcaklığında 5 dakika için 800 rpm (110 g) santrifüj edilir. </li><li> Yüzer madde ayrılır ve topak küreler% 0.05 tripsin-EDTA, 1 ml içinde tekrar süspanse edilir ve 37 ° C&#39;de 3-5 dakika boyunca bir su banyosunda kuluçkaya bırakılır. </li><li> Soya fasulyesi tripsin inhibitörü eşit bir hacimde daha sonra tripsin aktivitesini durdurmak için kullanılır. </li><li> Hücre süspansiyonu yavaşça homojenlik ve tripsin aktivitesinin tam nötralizasyonu sağlamak için aşağı yukarı pipetle ve. </li><li> Hücre süspansiyonu yine 5 dakika için 800 rpm&#39;de santrifüje tabi tutulur. NeuroCult 1 ml içinde süpernatant kaldırılır ve hücreler yeniden süspanseMGK Bazal Orta. </li><li> Ve tek hücre süspansiyonu 10μl bir hücre sayımı gerçekleştirmek için tripan mavi 90μl ile karıştırılır. </li></ol> 2. Hücre Trace Carboxyfluorescein sukkinimidil ester (KAKE) Yeşil Floresan Boya ile Boyama <ol><li> Lekeli olmak için her 1 milyon hücre için, reaktif boyama 1 ml 5 uM bir nihai konsantrasyon vermek için boyama NeuroCult NSC Bazal Orta 1 ml ila 5 mm hücre izleme CFSE boyası (Molecular Probes, Invitrogen) ve 1 ul ilave edilmesi ile hazırlanır . </li><li> Hücrelerini içeren reaktif boyama homojenliği kadar iyice karıştırılır ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> İnkübasyon sırasında, buz NeuroCult MGK Bazal Orta soğutma çözümü olarak hazırlanmıştır. </li><li> Boyama işlemini sonlandırmak için buz-soğuk su verme çözelti yaklaşık 5-10 hacim CFSE ile yüklenmiş hücrelere ilave edilir. </li><li> Çözelti, daha sonra 5 dakika için 800 rpm&#39;de santrifüje tabi tutulur ve süpernatan atılır. </li><li> At thÖnemli olan, boyanma başarılı olduğunu gösteren bir renk arasında bir parlak yeşil bir renk tonu ile tüpün altına bir hücre peleti orada yer almalıdır. </li><li> Hücreler 5 dk atarak süpernatant için 800 rpm&#39;de santrifüj, taze NeuroCult MGK Bazal Orta 1-2 ml pelet resuspending tarafından yıkanır. Bu işlem üç yıkamadan bir toplam için tekrarlanır. </li><li> Üçüncü yıkamadan sonra, hücreler NeuroCult NSC bazal ortamı ve hücre sayımı yapılır 1 ml içinde tekrar süspanse edilir. </li><li> CFSE lekeli hücreler, daha sonra, uygun bir yoğunluk [50,000 hücre / ml] steril doku kültürü şişeleri içinde kaplanmış ve 37 ° C /% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içine yerleştirilir. </li></ol> 3. KAKE Yükleniyor Doğrulama <ol><li> NSA kültür kaplama Hücreler KAKE boyama doğrulamak için bir floresan mikroskop altında izlenebilir. Bu aşamada, bu hücrelerde parlak yeşil renk (Şekil 1) göstermektedir. Dan hücre süspansiyonu Alternatif olarak, bir damlaKAKE boyanan hücrelerin mikroskop lamı üzerine yerleştirilir ve floresan mikroskop altında hücreleri görselleştirmek için bir lamel ile kaplı olabilir. </li><li> Başarılı KAKE etiketleme fazla akım sitometri yöntemiyle onaylanır. Her gruptan gibi birçok 1-5 x 10 5 hücre KAKE boyanma doğrulama için yeterlidir. CFSE hücreleri ve yüksüz bir negatif kontrol hücreler 1 x PBS-ya da 500 ul toplam hacim için NeuroCult NSC bazal medyum içinde yeniden asıldı ve sırasıyla ayrı FACS tüpler içine yerleştirilir yüklendi. </li><li> Flowsitometri ilgili parametreler için cihazın kullanım kılavuzunu talimatlarına göre ayarlanır. KAKE 492 nm ve 517 nm emisyon, maksimum dalga boyu uyarım maksimum vardır. </li><li> İlk olarak, yüksüz kontrol hücreleri çalıştırmak ve edinilen olayları ileri ve yana saçılım (FSC vs SSC) ve histogram araziler kaydedilir ve ana hücre popülasyonunu (Şekil 2A) işlenir. </li><li> Benzer şekilde, CFSE yüklü hücreler aynı parametre kullanılarak analiz edilirler kontrol hücreleri (Şekil 2B) için kullanılır. </li></ol> 4. Yavaş bölünmesi Floresan Aktif Hücre Ayırma (FACS) kullanarak Hücre Nüfus [yani KAKE İstinat] İzolasyonu <ol><li> Bölünmesi üzerine, CFSE şiddetinde azalma ve hGBM hücreleri yeşil floresan yoğunluğu farklı düzeylerde (Şekil 3) sergileyen hücreler oluşan gliomaspheres oluşturmak. Gliomaspheres çapı yaklaşık 150-200 mikron (yaklaşık 5 ila 10 gün hücre hattı büyüme hızına bağlı olarak yazılan KAKE yükleme) bir ortalama boyutu vardığınız zaman küre içeren orta uygun büyüklükte steril doku kültürü yerleştirilir, çıkarılır tüp, ve oda sıcaklığında 5 dakika için 800 rpm&#39;de santrifüjlenmiştir. </li><li> Önceki basamakta anlatılan ve hücrelerin mililitrede 10 7 hücreleri için bir yoğunluğu olan bir hücre süspansiyonu elde etmek için bir hücre sayımı için PBS içerisinde yeniden süspanse edilen bir tek hücre süspansiyonu hazırlanmıştır. </li><li> Kıçtaer PBS uygun bir hacim içinde hücreler resuspending, Propidium iyodür (PI, Sigma, 500 ug / ml), 1 ul / kriteri / akış sitometrisi ile analiz edildiğinde ölü hücreleri çıkarmak için hücre süspansiyonu ml &#39;lik bir konsantrasyonda ilave edilir. </li><li> Tam NeuroCult NSC Medium içeren 1 ml her biri iki adet 15 ml&#39;lik steril doku kültür tüpleri kriteri yavaş bölünen hücreler (CFSE tutucu hücreleri) ve hızla bölünen hücreler (CFSE seyreltilmesi hücreleri) toplamak için kullanılır. </li><li> İlk olarak, boş hücre gruptan hücre süspansiyonu akış sitometresi ile çalıştırılır. </li><li> Hücreleri (olaylar) hücrelerin çoğunluğu akışı arsa dahil edilir, böylece ayarlanır ileri saçılım (FSC) karşı yan dağılım (SSC) ve her iki parametre için gerilim parametreleri esas çizilir. </li><li> Ölü ya da hasarlı hücrelerin dışlamak için, hücreleri DGM karşı PI reaktivite dayalı çizilen ve tek canlı hücre popülasyonu (PI negatif) işlenir edilir. </li><li> Daha sonra, homojen bir hücre popülasyonu f esas alınarak belirlenirorward saçılım (FSC) karşı yan dağılım (SSC). </li><li> Homojen tek canlı hücre popülasyonu sonra logaritmik bir ölçekte belirlenen hücre Frekans karşı KAKE yoğunluğuna dayalı bir histogram çizilir. KAKE lazer yoğunluğu 0 ile 100 arasında negatif sinyal yerleştirmek için ayarlanır. </li><li> Aynı parametreleri ve benzer bir yolluk stratejiyi kullanarak, KAKE etiketli hücreleri akış sitometresinin aracılığıyla çalıştırılır ve (Şekil 4C) incelendi. </li><li> Daha sonra hücreler, ve genel nüfus yavaş bir bölme nüfus (daha hızlı bölünen hücreler) CFSE (sırasıyla CFSE yüksek top% 5 CFSE ile düşük alt% 85), tutma yeteneği temelinde belirlenir. </li><li> Bu farklı hücre popülasyonlarının sonra tam MGK orta 1ml içeren ayrı 15 ml steril doku kültürü tüpler halinde sıralanır. </li><li> Sıralama hücreler daha sonra 5 dakika için 800 rpm&#39;de santrifüjlenir. </li><li> Bir onaylama içinde Yüzer madde ayrılır ve topak yeniden süspansevasatı (izole olaylar ya da topak boyutu sayısına bağlı olarak) ve bir hücre sayımı sürülen uygun hacim gerçekleştirilir. </li><li> Farklı kriteri populasyonlardan Hücreler daha sonra, uygun bir steril doku kültürü şişesi içinde mililitre başına 50.000 hücre de kaplanmış ve seri olarak geçişli veya alt deneylerde kullanılmadan önce, 5-10 gün için, 37 ° C /% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içine yerleştirilir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Mikroskop (Şekil 1) altında görüntülendi olarak CFSE Yüklemeden sonra bütün hücreler yoğun bir yeşil floresan sunulmuştur. Bu yeşil renkli renk bile çıplak gözle (videoyu görmek) görülebilir. Akım sitometri ile bu hücrelerin incelenmesi de kontrol hücreleri (Şekil 2) ile karşılaştırıldığında oldukça yoğun yeşil floresans gösterir. Neurosphere kültür kaplama KAKE yüklü hücreler üzerine, bu hücreler çoğalmaya başlar ve 5-10 gün içinde 150-200 mikron gliomaspheres oluştururlar. Hücreler, t çoğaldıkça<html> O floresan boya eşit her hücre bölünmesi ile floresans şiddetinin ikiye bölme neden bölünmeler üzerine kızı hücreleri arasında dağıtılır. Glioblastomalar işlevsel olarak heterojen olan ve farklı zaman skalası üzerinde çoğalan hücrelerin oluşmaktadır. Bu protokolde tarif edilen yöntem, sırasıyla, seyreltik CFSE ya da tutma yeteneğini (Şekil 3, aynı zamanda video) sayesinde hızlı ve yavaş bölünen hücreleri tanımlamak ve izole etmek için bir olanak sağlar. Yüksüz hücrelere göre CFSE ile yüklenmiş hücreler elde ayrılmış gliomaspheres akış sitometri analizi çeşitli CFSE tutma özellikleri (Şekil 4) göstermektedir. Hızlı bölünen hücreler (alt% 85) veya yavaş bölünen hücreleri (üst% 5 - KAKE yüksek) neurosphere test koşulları (Şekil 5) kültüre zaman yeteneği oluşturan sergi gliomapshere. Güre 1 &quot;/&gt; Şekil 1. Hemen KAKE boya ile yükledikten sonra Disosiye tümör hücreleri. Hücreler başarılı etiketleme gösteren parlak yeşil renk sergilerler. Orijinal büyütme; 10 x. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> Şekil 2. Akım sitometri kullanarak KAKE yükleme onay. A) Unloaded hücreleri, B) KAKE yüklenen karşı boş hücrelerde KAKE floresans şiddetinin karşılaştırılması) hücreler ve C yüklenir. Etiketli ve etiketsiz hücreleri arasındaki floresans yoğunluğu büyüklük farkı birkaç emir olduğunu unutmayın. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3,. 6 gün sonra kaplama bir CFSE-yüklü hücre türetilmiş bir temsilci gliomasphere. Bazı hücreler çok parlak KAKE boyanması sergilerler. Orijinal büyütme; 63 x. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/3918/3918fig4.jpg&quot; alt = &quot;Şekil 4&quot; /&gt; Şekil 4. Örnek flow sitometri araziler / 6 gün KAKE boyandıktan sonra hızlı ve yavaş bölünen hücrelerin izolasyonu için histogramlar. Ölü veya zarar görmüş hücreleri çıkarmak için bir bütün hücre popülasyonunu göstermek için) FSC vs SSC B) SSC vs PI reaktivitesi, C) Geçide FSC vs SSC homojen bir canlı hücre popülasyonu, D) 6 gün negatif kontrol ile karşılaştırıldığında büyük bir floresan yoğunluğu ile kanıtlandığı gibi KAKE etiketleme sonra KAKE istinat hücrelerinin varlığını gösterir. Histogram da KAKE yoğunluğu) zaman. E içindeki KAKE istinat hücreleri (üst% 5) ve KAKE sulandırarak hücreleri (alt% 85) tespit etmek yolluk strateji görüntüleniyor Histogram çürümüş olduğunu gösterir. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig5.jpg" alt="Şekil 5," /> Elde edilen Şekil 5,. Örnek gliomaspheres <strong&gt; A) hızlı bölünen hücreleri (KAKE düşük) ve B) yavaş bölünen hücreleri (KAKE yüksek). Orijinal büyütme:. Sırasıyla 10x ve ​​20x C) Örnek hücre sayımı pasaj zaman hızlı veya yavaş bölünmesi hücre kaynaklı kültürü elde. P &lt;0.05, t-testi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3918/3918fig5large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol><li>Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+of+cancer+robustness+and+evolvability%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">The origins of cancer robustness and evolvability.</a> Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).</li>
<li>Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+label-retaining+tumour-initiating+cells+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma.</a> Brain. 134 (Pt. 5), 1331-1343 (2011).</li>
<li>Krishnamurthy, K., Wang, G., Rokhfeld, D., Bieberich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxycholate+promotes+survival+of+breast+cancer+cells+by+reducing+the+level+of+pro-apoptotic+ceramide%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide.</a> Breast Cancer Res. 10, 106-106 (2008).</li>
<li>Pece, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+molecular+heterogeneity+of+breast+cancers+correlates+with+their+cancer+stem+cell+content%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content.</a> Cell. 140, 62-73 (2010).</li>
<li>Roesch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+temporarily+distinct+subpopulation+of+slow-cycling+melanoma+cells+is+required+for+continuous+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth.</a> Cell. 141, 583-594 (2010).</li>
<li>Dembinski, J. L., Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+functional+analysis+of+a+slow+cycling+stem+cell-like+subpopulation+in+pancreas+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma.</a> Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).</li>
<li>Graham, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primitive%2C+quiescent%2C+Philadelphia-positive+stem+cells+from+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+are+insensitive+to+STI571+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro.</a> Blood. 99, 319-325 (2002).</li>
<li>Holyoake, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primitive+quiescent+leukemic+cells+from+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+spontaneously+initiate+factor-independent+growth+in+vitro+in+association+with+up-regulation+of+expression+of+interleukin-3%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3.</a> Blood. 97, 720-728 (2001).</li>
<li>Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+and+proliferation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies.</a> Immunol. Cell Biol. 77, 499-508 (1999).</li>
<li>Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+cell+division+in+vivo+and+in+vitro+using+flow+cytometric+measurement+of+CFSE+dye+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution.</a> J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).</li>
<li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+Human+Glioblastoma+Multiforme+Tumor+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (56), e3633-e3633 (2011).</li>
<li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Çalışmalar artan bir sayıda tümör oluşumunu ve tedavi direnç 2-8 katkı kanser hücrelerinin bir yavaş alt bölme bölümünün önemini ortaya koymuştur. Bu nedenle, farklı büyüme oranları ile subpopülasyonunun karşılaştırmak için daha genel olarak hücre ya da bu belirli alt populasyonun çalışma deneysel sağlayan yöntemleri açıklanmaktadır ve standartlaştırmak için çok önemlidir. Hücre bölünmesi onların oranı esas alınarak hücre alt fraksiyonlarının belirlemek ve yalıtmak için KAKE kullanma tümörler açıklanan hetero...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Tip </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> NeuroCult MGK Bazal Orta (İnsan) </td><td> Orta </td><td> Hücre Teknolojileri Stem </td><td> 05750 </td></tr><tr><td> NeuroCult MGK Proliferasyon Takviyeler (İnsan) </td><td> Orta takviyesi </td><td> Hücre Teknolojileri Stem </td><td> 05753 </td></tr><tr><td> % 0.05 tripsin-EDTA </td><td> Reaktif </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td></tr><tr><td> Soya tripsin inhibitörü </td><td> Reaktif </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> Reaktif </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> T25 şişesi </td><td> Kültür gereçleri </td><td> Nalge Nunc uluslararası </td><td> 136196 </td></tr><tr><td> T80 şişesi </td><td> Kültür gereçleri </td><td> Nalge Nunc uluslararası </td><td> 178905 </td></tr><tr><td> 15 ml tüp </td><td> Kültür gereçleri </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td></tr><tr><td> 50 ml tüp </td><td> Kültür gereçleri </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Büyüme faktörü </td><td> Ar-Ge </td><td> 2028-EG </td></tr><tr><td> CellTrace KAKE Hücre Çoğalması Takımı </td><td> Floresan Hücre Bölünmesi Takip Boya </td><td> Moleküler Probları, Invitrogen </td><td> C34554 </td></tr></tbody></table>

karboksi flöresein sukkinimidil ester (kake) kullanarak İnsan glioblastoma yavaş-bölme hücreleri tanımlama ve İzolasyonu

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Tümör heterojenite tümör sağlamlığı destekleyen temel bir özelliği temsil eder ve tedavi stratejilerinin 1 gelişiminde merkezi bir engel koymaktadır. Tümör heterojenliğin sorunu aşmak için, belirli bir hastalığın patolojiler sürücü ve klinik hedefleri temsil tümörün alt popülasyonlarının fenotipik, (epi) genetik ve fonksiyonel belirlenmesi ve tanımlanması sağlayan deneyleri ve araçlar geliştirmek esastır. Bu, şimdi de tümörleri yavaş bisiklet olma fonksiyonel kriterleri pozitif tümör oluşumu beyin, göğüs, cilt de dahil olmak üzere çeşitli kanser yeteneği ile ilişkili olduğu hücre bölünmesi, farklı frekanslarda bulunan hücrelerin alt fraksiyonlar ayrı göstermektedir ve olduğunun tespit edilmesi pankreas yanı sıra lösemi 2-8. Floresan boya carboxyfluorescein süksinimidil ester (CFSE) kan yoluyla in vitro olarak T hücrelerinin bölünmesini frekans izlemek için ve in vivo olarak kullanılmıştırumors ve bu glioblastoma 2,7,8 gibi solid tümörler. CFSE, hücre-geçirgenler floresan olmayan pro-ilaç kararlı amid bağı oluşturmak üzere hücre içi 9 amin grupları ile süksinimidil kısmının reaksiyon yoluyla proteinlere kovalent olarak bağlanarak hücre içinde tutulan bir floresan bileşik, içine hücre içi esterazlar ile dönüştürülür. Floresan boya eşit her hücre bölünmesi ile floresans şiddetinin ikiye bölme neden bölünmeler üzerine kızı hücreleri arasında dağıtılır. Bu bölünme 10 sekiz ila on mermi kadar hücre döngüsü frekans izleme sağlar. KAKE tutma kapasitesi kanseri kök hücre aktivitesi 2 zenginleşmektedir gösterdi yavaş bisiklet subpopülasyonu (üst% 5 boya tutucu hücreleri) belirlemek ve yalıtmak için beyin tümör hücreleri ile birlikte kullanılmıştır. Bu protokol, insan glio kültürü içinde KAKE ile boyanan hücrelerin tekniği ve bireysel nüfus izolasyonu açıklarblastom (GBM)-türetilen akım sitometri 2 kullanarak farklı bölünme fiyatla sahip hücreler. Tekniği tanımlamak ve KAKE etiketleme korumak için onların yeteneği sayesinde hücrelerin beyin tümörü yavaş bisiklet nüfusu izole etmeye hizmet etmiştir.

Bu video protokol hücre bölünmesi sıklığına göre insan glioblastoma hücreleri farklı alt-popülasyonlarının belirlenmesi ve ayrılması için floresan boya carboxyfluorescein sukkinimidil ester (KAKE) uygulamasını gösterir.

Karboksi Flöresein sukkinimidil ester (KAKE) Kullanarak İnsan Glioblastoma Yavaş-bölme Hücreleri Tanımlama ve İzolasyonu

Tümör heterojenitesi, tümör dayanıklılığını destekleyen temel bir özelliği temsil eder ve terapötik geliştirmenin önünde merkezi bir engel teşkil eder...

Bu video protokolü, karboksi floresein sodyum esteri (CFSE) kullanılarak insan glioblastomundaki yavaş bölünen hücrelerin tanımlanmasını ve izole edilmesini göstermektedir. Glioblastom tümör hücreleri önce nörosfer analizi kullanılarak büyütülür. Ardından, elde edilen sferler tekil hücrelere ayrıştırılır ve CFSE ile boyanır.CFSE yüklü hücreler tekrar ekilir. Nörosfer kültüründe, oluşan sferler tek hücrelere ayrıştırılır ve akış sitometrisi cihazından geçirilir. Yavaş ve hızlı bölünen hücreler, hücre bölünmesinin bir fonksiyonu olarak floresan yoğunluğuna göre tanımlanır ve ayrıştırılır.Frekans Heterojenitesi, kanserde temel bir özelliktir. Bu heterojenite, tümör dayanıklılığını destekler ve tamamen etkili tedavilerin geliştirilmesinin önünde büyük bir engel teşkil eder. Bu nedenle, genetik, fenotipik ve fonksiyonel olarak tanımlanan bu heterojeniteyi incelemek ve anlamak için araçlar ve analizler geliştirmek kritik öneme sahiptir.Bu video protokolünde, flues ve I-C-F-S-C kullanan standart bir yöntemi tanımlıyoruz. Bu teknik, farklı fonksiyonel özelliklere sahip insan glioblastoma türevli hücrelerin bir kültüründeki tekil alt popülasyonların akış sitometrisi ile tanımlanmasına ve ayrıştırılmasına olanak tanır. Bu tekniği, tümör başlatma ile ilişkili olduğu gösterilen fonksiyonel bir özellik olan yavaş bölünme hızı sergileyen bir tümör hücre popülasyonunu izole etmek ve karakterize etmek için kullandık. Glioma küre kültürü, ekranda belirtilen adresteki ayrı bir videoda açıklanan nörosfer deneyi kullanılarak kurulur ve sürdürülür.Glioma küreleri 150 ila 200 mikron çapa ulaştığında, küreleri içeren ortam uzaklaştırılır, uygun boyuttaki steril bir doku kültürü tüpüne yerleştirilir ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 800 RPM veya 110 G'de santrifüj edilir. Ardından süpernatant atılır ve küre peleti bir ml önceden ısıtılmış tripsin EDTA içinde yeniden süspanse edilir ve bir su banyosunda 37 derecede üç ila beş dakika inkübe edilir. Daha sonra, küreleri ayrıştırmak için eşit hacimde tripsin inhibitörü eklenir ve nazikçe pipetle yukarı-aşağı çekilerek karıştırılır.Hücre süspansiyonu tekrar santrifüj edilir. Süpernatan uzaklaştırılır ve hücreler 1 mL nöral kök hücre bazal medyumu içerisinde yeniden süspanse edilir. Tek hücre süspansiyonundan 10 µL alınarak 90 µL Trypan Blue ile iyice karıştırılır ve boyanacak her 1 milyon hücre için hücre sayımı gerçekleştirilir.Beş milimolar CFSE boyasından bir mikrolitre, bir mil nöral kök hücre bazal besiyerine eklenerek beş mikromolar nihai boyama konsantrasyonu sağlayacak şekilde bir mil boyama reaktifi hazırlanır. Ardından boyama çözeltisi uygun şekilde karıştırılır. İstenen sayıdaki hücre ayrı bir tüpe aktarılır, santrifüj edilir ve süpernatan uzaklaştırılır.Ardından CFSE boyama çözeltisi pelete eklenir, homojenlik sağlanana kadar nazikçe karıştırılır ve boyama işlemini durdurmak için oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. CFSE yüklü hücrelere, buz gibi soğuk nöral kök hücre bazal ortamından 5 ila 10 hacim eklenir ve iyice karıştırılır. Hücre süspansiyonu ardından santrifüj edilir ve süpernatan atılır.Bu aşamada, tüpün dibinde boyamanın başarılı olduğunu gösteren yeşil renkli bir hücre tabakası görülmelidir. Fazla CFSE boyasını uzaklaştırmak için, peleti 1 mL nöro kök hücre bazal medyumu içinde yeniden süspande edip santrifüjleyerek süpernatantı uzaklaştırmak suretiyle iki ila üç yıkama işlemi gerçekleştirilir.Üçüncü yıkamadan sonra, hücreler 1 ml nöro kök hücre bazal ortamında yeniden süspande edilir ve hücreleri ekmek için daha önce açıklandığı şekilde hücre sayımı gerçekleştirilir. Tam nöro kök hücre ortamı, final konsantrasyonu 20 ng/ml olacak şekilde EGF ile desteklenir. Ardından, CFSE yüklü ve yüksüz gruplardaki hücreler, final konsantrasyonu 50.000 hücre/ml olacak şekilde ilgili tüplere eklenir.Ardından hücre süspansiyonları iyice karıştırılır ve steril doku kültürü flasklarına ekilir. Flasklar daha sonra etiketlenir. CFSE boyamasını doğrulamak için hücreler floresan mikroskobu altında izlenebilir ve ardından beş ila 10 gün boyunca 37 °C %5CO2 nemlendirilmiş inkübatöre yerleştirilebilir.Akış sitometrisi kullanarak CFSE boyamasını doğrulamak için, CFSE yüklü ve yüklenmemiş negatif kontrol gruplarından 500, 000 hücre ayrı faks tüplerine aktarılır. Akış sitometresi, ilgili parametreler için kullanıcı kılavuzundaki talimatlara göre ayarlanır. İlk olarak, yüklenmemiş kontrol hücreleri çalıştırılır ve olaylar ileri ve yan saçılım özelliklerine göre kaydedilir; ardından, hücre frekansına karşı CFSE yoğunluğuna dayalı bir histogram grafiğinde, CFSE floresan yoğunluğu düzeyini doğrulamak için ana hücre popülasyonu kapılamayla seçilir (gate edilir).Ardından, görüldüğü üzere, CFSE yüklü hücreler kontrol hücreleri için kullanılan parametrelerin aynısı kullanılarak analiz edilir. CFSE pozitif hücreler, kontrol hücrelerinden katbekat daha yüksek floresan yoğunluğu sergiler. Glioma küreleri yaklaşık 150 ila 200 mikron ortalama çapa ulaştığında.Küreler pasajlanır ve daha önce açıklandığı üzere hem CFSE yüklü hem de yüksüz gruplardan tek hücre süspansiyonu hazırlanır. Ardından hücreler, uygun hacimdeki steril 1x PBS içerisinde yeniden süspanse edilir ve ölü veya hasarlı hücreleri dışlamak için hücre sayımı yapılır. Akış sitometrisi ile ayıklama yaparken, yavaş bölünen ve hızlı bölünen hücreleri toplamak için hücre süspansiyonunun ml'si başına bir mikrolitre konsantrasyonda propidyum iyodür eklenir.Sıralama işlemi sırasında, her biri 1 ml tam nöral kök hücre medyumu içeren iki adet steril 15 ml doku kültürü tüpü hazırlanır. Ardından, hücreler akış sitometrisi tesisine nakledilirken buz üzerinde tutulur. İlk olarak, yüklenmemiş hücre grubundan alınan hücre süspansiyonu akış sitometresinden geçirilir.Ölü veya hasarlı hücreleri dışlamak için olaylar, ileri saçılım (forward scatter) ile yan saçılım (side scatter) temelinde grafiğe dökülür. Hücreler, yan saçılım ile PI reaktivitesi temelinde grafiğe dökülür ve tek bir canlı hücre popülasyonu birinci popülasyon olarak kapılaştırılır (gated). Ardından, birinci popülasyondan ileri ve yan saçılım özelliklerine göre homojen bir hücre popülasyonu seçilir ve ikinci popülasyon olarak kapılaştırılır. Sonrasında ikinci popülasyon, aynı parametreler ve kapılama stratejisi kullanılarak, logaritmik ölçekte ayarlanmış hücre frekansına karşı CFSE yoğunluğu temelinde bir histogramda grafiğe dökülür.CFSE ile işaretlenmiş hücreler akış sitometresinden geçirilerek analiz edilir. Ardından, hücrelerin en alttaki %85'i hızlı bölünen, en üstteki %5'i ise yavaş bölünen hücreler olarak kapılandırmasına (gate) tabi tutulur. İlgilenilen bu farklı hücre popülasyonları seçilerek, içerisinde 1 ml komple nöral kök hücre besiyeri bulunan ayrı 15 ml'lik steril doku kültürü tüplerine sort edilir.Sıralama eşik hızı, saniyede 2.500 olayı geçmeyecek şekilde ayarlanmalıdır. Sıralama işlemi tamamlandıktan sonra hücreler santrifüj edilir, süpernatan atılır ve pelet uygun hacimde besiyerinde yeniden süspanse edilerek hücre sayımı gerçekleştirilir. Ardından, farklı sıralanmış popülasyonlardan elde edilen hücreler, ml başına 50.000 hücre yoğunluğunda ekim yapılır.20 ng/mL EGF ile desteklenmiş tam nöral kök hücre ortamında, hücreler küreler oluşturmaları için beş ila 10 gün boyunca inkübe edilir. Bu, hücrelere bir örnektir. CFSE boyasıyla yüklendikten kısa bir süre sonra, floresan mikroskobunda gözlemlendiği üzere, tüm hücreler yoğun bir yeşil floresan sergiler.Bu, ekimden altı gün sonra A-C-F-S-E yüklü hücrelerden türetilmiş temsili bir gliom küresinin görüntüsüdür. Bazı hücrelerin hala çok parlak CFSE boyanmasına sahip olduğuna dikkat edin. Bu, CFSE yoğunluğunun zamanla azaldığını gösteren bir akış sitometrisi histogramı örneğidir.Mavi, CFSE ile yeni yüklenmiş hücreleri ve bunların floresan yoğunluğunu temsil etmektedir. Bu yoğunluk, kırmızıyla gösterilen yüklenmemiş hücrelerden kat kat daha yüksektir. Yeşil ise hücrelerin bölünmesi nedeniyle, CFSE ile yüklemeden sonraki altı günlük süre boyunca azalan floresan yoğunluğunu temsil etmektedir.Bunlar, hızlı ve yavaş bölünen popülasyonlar izole edildikten yedi gün sonra büyütülmüş temsili kürelerdir. Küre oluşturma frekansları iki grup arasında farklılık göstermemektedir, ancak CFSC tutan hücreler, CFSC seyrelten hücrelere kıyasla daha yavaş büyür ve daha küçük kürelerle sonuçlanır. Hücre bölünme hızına dayanarak bir hücre alt popülasyonunu tanımlamak ve izole etmek için CFSC'nin kullanılması, sonraki deneyler ve daha ileri karakterizasyonlar için bir başlangıç noktasıdır.Bu protokol, insan gliyom türevli kültürlerde yavaş bölünen hücrelerin belirlenmesi için bir örnek sunmuştur; ancak diğer tümör hücre tiplerine veya kanserli olmayan sistemlere de uygulanabilir. İzlediğiniz için teşekkür ederiz, bu protokolün araştırmalarınız için faydalı olduğunu umuyoruz.

identification-isolation-slow-dividing-cells-human-glioblastoma-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

KAKE kovalent, floresan boya, carboxyfluorescein uzun ömürlü hücre içi moleküller etiketler. Gibi KAKE etiketli hücre böler, döl ve böylece hücre bölünmesini değerlendirmek için kullanılan floresan yarısı miktarı, var. Bu makalede, tipik olarak KAKE fare lenfositler etiketlenmesi için kullanılan prosedürler açıklanmaktadır.

Lenfosit Silahların Yayılmasının Önlenmesi Monitör Carboxyfluorescein diasetat Succinimidyl Ester (KAKE) Kullanımı

Bu videoda, glioma hücrelerinin kızılötesi floresan proteini veya iRFP'yi eksprese etmek için genetik mühendislik protokolü açıklıyoruz. Bu floresan etiketli glioma hücreleri, beyin tümörlerinin gelişimini anlamak için derin doku görüntülemede yardımcı olur.

Glioma Hücrelerinin Floresan Etiketlemesi: Derin Doku Görüntüleme için Floresan Protein İfade Eden Glioma Hücreleri Elde Etmek İçin Lentiviral Vektör Tabanlı Bir Transfeksiyon Yöntemi

Kaynak: Parker, J. J., et al. Tümör Hücre Göçü ve Anti-İnvaziv İlaçların Hastaya Özgü Etkilerinin İncelenmesi için Bir İnsan Glioblastoma Organotipik Dilim Kültür Modeli. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, konfokal mikroskopi ile yeşil floresan proteini (GFP) eksprese eden glioblastoma doku dilimlerinin görüntülenmesini göstermektedir. Tümör hücresi hareketini ve yönünü izlemek için tutarlı aralıklarla yüksek çözünürlüklü görüntüler yakalanır.

Glioblastoma Dokusunda Tümör Hücresi Migrasyonunun Hızlandırılmış Taramalı Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Görüntülenmesi

Erken beyin tümörü mikro giren bağışıklık hücrelerinin sayısının ve aktivasyon durumu ile ilgili zamana bağlı nicel verileri verir glioma-infiltre periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyonu ve akım sitometri analizi için bir basit bir yöntem burada sunulmuştur.

İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi

Bir verimli tarama Protokolü glioblastoma kök hücreler (GSCs) astroglial farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlanması için sunulmaktadır. Tahlil sayede gelişmiş GFP (eGFP) ifade insan GFAP'nin düzenleyici tarafından tahrik edilmektedir bir kök hücre farklılaşması muhabir temel alır.

Akış Sitometresi tabanlı uyuşturucu Glioblastoma kök hücre hücresel farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlanması için eleme sistemi

Orthotopic kafa içi enjeksiyon tümör hücrelerinin Beyin tümör biyolojisi, ilerleme, evrim ve terapötik yanıt çalışmaya kanser araştırmalarında kullanılmıştır. Burada gerçek zamanlı intravital görüntüleme ve miktar tümör preklinik glioblastoma modellerinde kitle sağlayan Floresans moleküler tomografi, tümör xenografts, mevcut.

Floresans moleküler tomografi Glioblastoma Xenografts in Vivo içinde görüntüleme için

Burada sunulan bir protokol Proliferasyona CD4+ T hücreleri antijenik proteinler veya peptidler boya seyreltme kullanarak yanıt olarak. Bu tahlil nadir antijen özgü T hücrelere özellikle duyarlıdır ve antijen özgü hücrelerin klonlama kolaylaştırmak için değiştirilebilir.

Proliferasyon ınsan antijeni spesifik CD4+ T hücrelerinin Karboksflorcein Succinimidyl Ester kullanarak ölçülmesini

Burada, desenli nöronlar üzerinde glioblastoma (GBM) göçünü analiz etmek için kullanımı kolay bir ortak kültür tahlili sunuyoruz. Nöronlar üzerinde GBM hücre göçünün kolay ölçülmesi için FiJi yazılımında bir makro geliştirdik ve nöronların GBM hücre invaziv kapasitesini değiştirdiğini gözlemledik.

Göç ve Hücresel Etkileşimleri İncelemek İçin Desenli Nöronlarda Glioblastoma Kök Benzeri Hücrelerin Ortak Kültürü

Omurgalı beyin dokusunu invaze eden glioblastoma (GBM) hücrelerinde mikrotübül dinamiklerinin canlı görüntülenmesine izin veren bir teknik sunuyoruz. Floresan etiketli GBM hücrelerinin ortotopik enjeksiyonunun, yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme ile şeffaf bir zebra balığı beynine bağlanması, in situ kanser invazyonu sırasında sitoiskelet dinamiklerinin ölçülmesini sağlar.

Zebra Balığı Beynini İstila Eden Glioblastoma Hücrelerinde Mikrotübül Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi

Zebra balığı T-akut lenfoblastik lösemi modelindeki hareketsiz hücreleri tanımlamak için hücre proliferasyon boyaması kullandık. Leke, bölünmeyen hücrelerde tutulur ve hücre proliferasyonu sırasında azaltılır, bu da daha fazla sorgulama için hareketsiz hücrelerin seçilmesini sağlar. Bu protokol, hücresel sessizlik bağlamında kendini yenilemeyi incelemek için işlevsel bir araç sağlar.

Zebra Balığı T Hücreli Akut Lenfoblastik Lösemi Modelinde Hareketsiz Hücrelerin Hücre Proliferasyonu Boyama Kullanılarak Tanımlanması 

Yeni teşhis edilen ve tekrarlayan tümörlerden üretilen hastadan türetilen manyetik gliomakürleri kullanarak 3D glioblastoma göç modeli sunuyoruz. Bu platform, hastaya özgü göç dinamiklerinin görselleştirilmesine ve terapötik etkinliğin değerlendirilmesine olanak tanır. Test, protein lokalizasyonu ve ifade desenlerini değerlendirmek için göç sonrası çoklu eklenebilir.

Hipoksik Koşullarda Manyetik Nanopartikül Aracılı Sferoid Lokalizasyon ile Tekrarlanabilir 3D Glioblastoma Göç Testi

Keşfedin, insan glioblastoma yavaş bölünen hücrelerini CFSE boyama ve akış sitometrisi kullanarak tanımlama ve izolasyon yöntemini. Bu teknik tümör heterojenliğini anlamak ve tedavi stratejileri geliştirmek için değerli bir araçtır.

Karboksi Flöresein sukkinimidil ester (KAKE) Kullanarak İnsan Glioblastoma Yavaş-bölme Hücreleri Tanımlama ve İzolasyonu

Daha fazla video keşfet