Name: Doğal Müsin Dağıtım Eğitim için sabitlenmemiş, Dondurulmuş Dokular kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Öğrenin, OCT ile gömülü dondurulmuş dokularda doğal glikozilasyon ve müsin dağılımını koruma yöntemini. Lectinler ve histokimyasal boyamalarla glikan yapılarını analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Tavuk dokuları yardım ettikleri için Nicole M. Nemeth (University of Georgia) ve Jeanne M. Fuarı (LANL) teşekkür ve çekimler sırasında, onun yardım için Steven A. Springer olurdu. Bu çalışmada tüm kuşların bakım Los Alamos Ulusal Güvenlik, LLC, Los Alamos operatörün Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış laboratuvar hayvanları ve tüm protokolleri insani kullanımı için Sağlık kuralları National Institutes uygun oldu Sözleşme kapsamında Ulusal Laboratuvarı ABD Enerji Bakanlığı ile No DE-AC52-06NA25396. Bu çalışmada farelerde bakımı UCSD hayvan onaylanan protokole uygun olduğunu. İnsan doku UCSD onaylı protokol IRB bir parçası olarak elde edildi. Bu çalışma California Lab Ücret Başkan Programı Üniversitesi (PG) ve hibe NS047101 Nörolojik Bozukluklar Ulusal Enstitüsü ve İnme (Nörobilim Mikroskopi Paylaşılan Tesisi, UC San Diego) hibe 118645 tarafından desteklenmiştir.

1. OCT Doku Gömme <ol><li> Sığ bir strafor kutuda 2-metil bütan için kuru buz ekleyerek dondurma banyo hazırlayın. </li><li> Doku Harvest, yavaşça aşırı sıvı kurulamak için kağıt mendil üzerine nemli. Ek dondurulmuş doku (sıvı nitrojen içinde dondurulmuş doku) kullanıyorsanız, doku kriyo-mikrotom odasında yerleştirerek -20 ° C&#39;ye kadar ısınmasını bekleyin. </li><li> Yeterli kalıbın alt kapağı, Peel-A-Way donma kalıp eki küçük bir miktar ekleyin. </li><li> Kalıp içinde doku yerleştirin, doku istenen yönde de kalıbın tabanındaki üzerinde duran olduğundan emin olun. Bir kez dondurulmuş doku blok veya alt taraftan ya da kesit olacaktır. </li><li> OCT doku kapağı, ve dondurma banyo içinde kalıp yerleştirin. Doku dondurur OCT bileşiği beyaz dönecek. </li><li> Sonra belirgin bir dondurma torba içinde dondurulmuş blok ve kapalı yerde kalıp soyma, dondurulmuş. </li><li> Dondurulmuş bloklar tutulabilir-80 ° C&#39;ye kadar. </li></ol> 2. Kesit Doku <ol><li> Sıra doku kriyo-mikrotom odasında blokları ve bunların -20 ° C (yaklaşık 30 dk) ulaşmanızı sağlar. </li><li> Bir 3-5 mikron kalınlığında kesit Kes ve bölümün üstünde bir pozitif yüklü cam slayt yerleştirin. Doku slayt uyacaktır. </li><li> Hava 30-60 dakika süreyle doku kurulayın. </li><li> Slaytlar, bu aşamada kullanılabilir, ya da -80 ° C &#39;de gelecekte kullanılmak üzere muhafaza edilebilir. </li></ol> 3. Boyama Doku <ol><li> -80 Bekletildi Slaytlar ° C: slaytlar 30 dakika boyunca oda sıcaklığında kuru bir çözülme ve hava sağlar. </li><li> % 10 oranında, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca tamponlu formalin ile slaytlar düzeltildi. </li><li> 250 ml tampon içinde slaytlar 10 kez daldırma her bir yıkama için, PBS veya TBST tamponu içinde üç kez yıkanır. PBS tamponu fosfataz, kromojenik conjug Alkalin ile tespiti için, ancak, immunofloresans boyaması için kullanılabilirlerantikor ated, TBST PBS içinde fosfat beri kullanılması gerektiğini Alkalin fosfataz aktivitesini inhibe eder. </li><li> Doku kesitleri slaytlar artık lekeli hazırdır. </li></ol> 4. Mukus Algılama böyle Alsiyan Mavi ve Periyodik Asit Schiff gibi Histokimyasal Boyaları Kullanımı <ol><li> Alsiyan Mavi lekesi: <ol><li> Su içinde slaytlar durulama, oda sıcaklığında 3 dakika için% 3 asetik asit içinde inkübe edilir. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika için Alsiyan Blue pH 2.5 çözeltisi ile Leke. </li><li> 10 dakika süreyle akan su içinde yıkayın slaytlar, DI su ile durulayın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca Nükleer Hızlı Kırmızı Counterstain. </li><li> Yıkama distile su içinde üç kez kayar. </li></ol></li><li> Periyodik Asit Schiff boyası: <ol><li> Su içinde slaytlar durulayın, 5 dakika için taze hazırlanmış% 1 periyodik asit içinde inkübe edilir. </li><li> DI suyla üç kez yıkayın, bir kez miliQ suya batırın. </li><li> Oda sıcaklığında, 15 dakika süre ile Schiff reaktif Lekee. </li><li> 10 dakika süreyle akan su içinde yıkayın slaytlar, DI su ile durulayın. </li><li> Oda sıcaklığında 30 sn için Surgipath hematoksilin Counterstain. </li><li> Yıkama distile su içinde üç kez kayar. </li><li> İnkübasyon oda sıcaklığında Scott musluk suyu içinde 30 saniye kayar. </li><li> DI suyla üç kez yıkayın. </li></ol></li><li> Kurutmak ve% 100 etanol içinde üç hızlı değişiklikler ve Citrisolv üç değişiklikler, 2 dakika her biri, ardından% 95 etanol içinde 1 dakika inkübe edilerek slaytlar temizleyin. Oda sıcaklığında tüm. </li><li> Reçineli orta (Cytoseal 60) lamelleri üzerine slaytlar monte edin. </li></ol> 5. Histokimyasal Yöntemlerle glukanıdır epitoplar Algılama Lektinlerle ve Antikorlar (Tablo 1) kullanarak <ol><li> Lektin kullanarak üç glikan epitopunun floresans saptama için, oda sıcaklığında, 10-30 dakika boyunca PBS içinde% 1 BSA ile bloke slaytlar. </li><li> Bir biyotinile lektin kullanıldığı için,% 0.1 ile 15 dakika inkübe edilerek endojen biyotin engellemekAvidin, oda sıcaklığında% 0.01 biotin ile 15 dakika inkübe edildi. </li><li> Her engelleme adımdan sonra PBS slaytlar yıkayınız. </li><li> Taze 1 ug / ml Rodamin-konjuge succinylated buğday tohumu aglutinin (sWGA), 1.3 ug / ml biyotinile Sambucus nigra agglutinin (SNA) ve 5 mg / HEPES / ml NaCl tampon içinde floresein-konjuge Jacalin (10 mM HEPES, bir karışım hazırlamak 150 mM NaCl, pH 7.5). </li><li> Düz bir yüzeye veya bir boyama kutusu ve katman üstüne lektin karışımı koyun slaytlar. Karışım yavaşça hacim sıvı üzerinde parafilm yerleştirilerek azaltılabilir, parafilm sıvı düzleştirir ve buharlaşmasını önler. </li><li> Karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> Yıkama üç kere PBS ile kayar. </li><li> 0.7 mg / ml streptavidin-konjuge CY5 (biyotinile-SNA tespit etmek için), ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir ve tabaka ile kayar. </li><li> Yıkama üç kere PBS ile kayar. </li><li> 0.1 &amp; m çekirdekler Counterstainu, g / ml DAPI. </li><li> VectaMount montaj ortam (veya herhangi bir sulu ortam) olarak, örneğin sulu ortam ile lameller üzerine monte slaytlar. </li></ol> 6. Lektin Boyama Özgünlük için denetleme <ol><li> Lektin boyama özgüllük boyamadan önce hedef glikan epitopun belirli enzimsel bölünme ile ya da küçük moleküller ile rekabet tarafından kontrol edilir. </li><li> Sambucus nigra aglutinin (SNA) bağlama özgünlüğü için Enzimatik dilinim <ol><li> 250 50 mM sodyum asetat pH 5.5 mU / ml Arthrobacter ureafaciens siyalidaz (AUS) seyreltin. </li><li> Öneri kutusu boş altına su ekleyin, bu inkübasyon sırasında nemli odasına oluşturacaktır. </li><li> Sıra kaydıraklı bir lamel ile slayt ve kapak üzerinde ucu kutusu, katman 150-200 ul AUS çözüm üst tabla üzerine yerleştirin. Hava kabarcığı oluşumunu önleyiniz. </li><li> 2.5 saat için 37 ° C sıcaklıkta inkübe kutusu kapağı ve kapatın. </li><li> Yıkama odasında temper de PBS içinde üç kez slaytlartüm ücretsiz sialik asit kaldırmak için düs ük. Bu slaytları SNA boyanması için negatif olması gerekir. </li></ol></li><li> Jacalin ve succinylated buğday tohumu aglutinin (sWGA) özgüllük için Rekabetçi inhibitörler <ol><li> Lektin karışımın tablet 200 ul 5.4 adım için iki Eppendorf tüpleri içinde hazırlanır. </li><li> Diğer şişeye 1:10 seyreltme de şişeleri ve Chitin-hidrolisat (sWGA inhibitörü) biri 200 mM melibiyoz (Jacalin inhibitörü) ekleyin. </li><li> Bindirme negatif kontrol slaytlar inhibitörleri içeren slaytların geri kalanı ile aynı zamanda oda sıcaklığında inkübe edin ve karışımı 1 saat. Bu slaytları sırasıyla, Jacalin veya sWGA boyama için negatif olması gerekir. </li></ol></li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Kriyo-koruyan medya (OCT) gömülü dondurulmuş dokulara parafine gömülü doku örnekleri arasında bir karşılaştırma Muci için boyama korunması ve kalitesi çarpıcı farkı ortayan glikoproteinler. Böyle Alsiyan Mavi ve Periyodik Asit Schiff gibi histokimyasal boyalar ile Doku boyama dondurulmuş ya da parafine gömülü örnekleri (Şekil 1) karşılaştırılabilir doku kesitlerinde çok farklı sonuçlar üretebilir. Görünüşe göre organik çözücü parafin gömme işlemi sırasında kullanılır ki (ksilen veya Citrisolv) epithelia üzerinde salgılanan müsin dağılımı de çok numuneleri (Şekil 2) glikolipitlerin kaldırma olarak etkiler. Sonuç olarak, mukus tabaka mukoza hücreleri üzerinde daraltılmış ve çoğunlukla goblet hücrelerinde bulunan görünür. Kriyo-koruyan medya dokuların Flaş dondurma (OCT) örnek hidrasyon muhafaza ve salgılanan müsin tabakasının boyutları korunmuştur. Parafin gömme işlem benzer bir şekilde diğer mukus ile ilişkili glukanlardır ve glikolipidler etkilemiştir. Glukanıdır dağılımı bulunan epitoplara rutin glukanıdır tespiti için kullanılır lektinler, (Şekil 3) ve antikorlar kullanılarak incelendimüsin ve glikolipitler (Şekil 6). Lektin bağlayıcı iyi tanımlanmamış ve glukanlardır hem de glikan yapı 14,15 arasında uzaysal dağılımının tarafından etkilendiği için, bu lektin boyanması için uygun kontrol uygulamak için önemlidir. Enzimatik parçalanma ve yarışmalı inhibisyonu: Burada test dokulara lektin boyama kontrol etmek için iki yöntem gösterilmektedir. Glikan epitopunun Yarılma glikan-spesifik enzimler ile doku bölüm sindirilmesi ile yapılabilir, örneğin bakteri siyalidaz için SNA (Şekil 4) bağlayıcı sialik asit için kontrol olarak. Edildi Spesifik enzim (örneğin glycosidase) okudu glukanıdır epitop kaldırılması için mevcut olmadığı durumlarda, lektin özgünlüğü, sWGA boyama Jacalin boyama veya Chitin-hidrolizat için melibiyoz (Şekil 5) olarak rekabetçi bir inhibitörü ekleyerek teyit edilebilir. Biz ek dondurulmuş doku örnekleri, hangi rou olduğunu burada göstermektinely klinik ve araştırma laboratuvarlarında elde edilen, daha OCT gömülü ve müsin glikoproteinler ve onları mevcut birçok glukanlardır incelemek için kullanılabilir. <table border="1"><tbody><tr><td> Lektin / Ab </td><td> Kaynak </td><td> Binbaşı özgüllük </td></tr><tr><td> LFA </td><td> Limax flavus (Sarı slug) </td><td> Terminal Sia </td></tr><tr><td> MAA * </td><td> Maackia amurensis (Amur Maackia) </td><td> Galβ1-R Siaα2-3Galβ1-R / 3-O-sülfat </td></tr><tr><td> SNA </td><td> Sambucus nigra (Mürver) </td><td> Siaα2-6Gal / Siaα2-6GalNAc </td></tr><tr><td> WGA </td><td> Triticum vulgaris (Buğday) </td><td> GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc / Sia </td></tr><tr><td> sWGA </td><td> Succinylated Triticum vulgaris (Buğday) </td><td> GlcNAc &amp; beta, 1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc </td></tr><tr><td> PNA </td><td> Arachis (Yerfıstığı) </td><td> Galβ1-3GalNAc (değiştirilmemiş T-antijen) </td></tr><tr><td> Jacalin </td><td> Artocarpus integrifolia (Jacalin) </td><td> Galβ1 3GalNAc-O-bağlı glukanlardır bulunabilir </td></tr><tr><td> ECA </td><td> Erythrina cristagalli (Mercan ağacı) </td><td> Galβ1-4GlcNAc </td></tr><tr><td> TKH2 </td><td> Antikor </td><td> O-bağlı glukanlardır üzerine Siaa2-6GalNAc (STN) </td></tr><tr><td> CA19-9 </td><td> Antikor </td><td> Siaa2-3Galβ1-4 (Fuca1-3) GlcNAc (SLE) </td></tr><tr><td> SNH3 </td><td> Antikor </td><td> Siaa2-3Galβ1-3 (Fuca1-4) GlcNAc (SLE x) </td></tr></tbody></table> Kısaltmalar: Ab, antikor; Sia, Sialik asit; Gal, Galaktoz; GalNAc, <em&gt; N-acetylgalactosamine, GlcNAc, N-asetilglukozamin; fuc, fucose; STN, Sialyl Tn, SLE, sialyl Lewisa, SLE, x, sialyl Lewis x. MAA için * Ticari kaynaklardan Mali, MALII ve MAH içerir. Tablo 1. Glukanıdır epitopları için lektinler ve antikorların kısmi listesi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig1.jpg" /> Şekil 1. Alsiyan Mavi ve dondurulmuş ve parafine gömülü kolon dokularında Periyodik Asit Schiff boyası. Insan, fare veya tavuk kolon örneklerinin doku kesitleri OCT (üst panel) dondurulmuş veya parafin (alt panel) gömülü Periyodik Asit Schiff (PAS) ile boyandı ya Alsiyan Mavi (AB). Bu reaktifler sırasıyla, pembe ya da mavi mukus leke. Üst panel: dondurulmuş doku olarak, goblet hücrelerinde müsin ek olarak, mukus salgılanması ayrıca kuvvet idiible (oklar). Alt panel: parafine gömülmüş doku, mukus boyama goblet hücreleri ile sınırlı idi. Çekirdekler Surgipath (PAS) veya Mayer&#39;in (AB) Hematoksilen ile zıt edildi. Ölçek çubuğu 100 mikron gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3928/3928fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/3928/3928fig2.jpg" /> Şekil 2. % 10 tamponlu formalin ve sulu (sol panel) muhafaza içinde müsin önemli kaybına Citrisolv kuluçka sonuçlar. Dondurulmuş tavuk ileum örnekleri Seri kesitler sıralı% 70 inkübasyon,% 90 ve% 100 etanol ile etanol içinde suyu 20 dakika süreyle, fikse edildi Her (orta panel) veya etanol içinde susuz ve 1 saat (sağ panel) Citrisolv ile temizlenir. Dehydrated örnekleri Hematoksilen-Eozin (H &amp; E) veya Alsiyan Blue boyaması önce PBS geri rehidrate edildi. Etanol dehidratasyon ve Citrisolv takas gelişmiş doku morphology (örneğin, üst satır, orta ve sağ görüntüleri veya sol resim). Etanol dehidratasyon Alsiyan Blue boyaması (orta sıra, sol ve orta görüntüleri karşılaştırın) üzerinde anlamlı bir etkisi vardı. Buna karşılık, Citrisolv inkübasyon Alsiyan Blue boyaması azalır ve parafine gömülü dokularda (Şekil 1) görülene benzer bir desen goblet hücreleri (orta sıra, sağ resim) için sınırlı. Bu veriler parafine gömülü örneklerinde mukus granülleri kuvvetli boyanma takas adımı sırasında küçülen ve goblet hücrelerinde mukus yoğuşmalı bağlı olduğunu göstermektedir. Dondurulmuş OCT-gömülü dokularda mukus sönük ve az yoğun boyama doku mukus daha doğal dağılımını yansıtmaktadır. Kutulu alanlardan yüksek büyütme oklarla işaretlenmiştir. Ölçek çubukları 50 mikron (üst ve orta satırlar) ve 10 mikron (alt satır) gösterir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig3.jpg" /> Şekil 3,. Bağlanmadondurulmuş ve parafine gömülü dokularda glukanıdır epitoplara lektinler. Tavuk ince bağırsak (ileum) örneklerinde OCT (üst panel) dondurulmuş veya Jacalin (mavi), sWGA (yeşil) ve SNA ile probed (alt panel) parafine gömüldü (kırmızı ). Kutulu alanlardan yüksek büyütme oklarla işaretlenmiştir. Dondurulmuş dokularda O-bağlı glukanlardır bağlama Jacalin lümen (Jacalin, üst panel, oklar) içine goblet hücrelerinden sızıntı ortaya çıktı yapıları ortaya çıkarmıştır. Buna karşılık, parafine gömülü dokularda bağlama Jacalin goblet hücreleri (Jacalin, alt panel, oklar) ve villus fırça sınır (sol alt resim, ok) ile sınırlı idi. β1-4GlcNAc arasında sWGA boyama kısmen de dondurulmuş dokularda Jacalin lektin bağlayıcı (üst panel, oklar) ile birlikte lokalize ve dokuların (alt panel, oklar) parafine gömülü. Buna karşılık, α2-6 bağlantılı sialik asit bağlayıcı SNA lektin (SNA, ok uçları) hücre içi ve Jacalin (renk ile birlikte lokalize etmezkırmızı görüntü, SNA ok ucu, noktalı ok işaretli mavi Jacalin) ile işaretlenmiş. Ölçek çubukları 100 mikron (sol resim) ve 20 mikron (büyütülmüş kutulu alanlar) gösterir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/3928/3928fig4.jpg" /> Şekil 4. SNA ile sialik asit boyama için enzimatik bölünme kontrolü. Tavuk ince bağırsak numuneler 37 ° C sıcaklıkta 250 mU / ml Arthrobacter ureafaciens siyalidaz (Avustralya) ile 2.5 saat boyunca ya da 50 mM sodyum asetat pH 5.5 tamponu ile inkübe edildi AUS tedavi sialik asidin SNA bağlama özgünlüğü teyit biotinlenmiş SNA ile boyanarak ortadan kaldırmaktadır. Ölçek çubuğu 100 mikron gösterir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3928/3928fig5.jpg" /> Şekil 5,. Jacalin ve sWGA glikan ile boyanması için Rekabetçi inhibisyon kontrolü. Tavuk ince bağırsak (kıvrımbağırsak) örnek spesifik LEC varlığında bir Jacalin ve sWGA karışım ile inkübe edildikalay inhibitörleri: melibiyoz (orta sütun), Chitin-hidrolizat (sağ sütun) veya inhibitör olmadan (A ve D). Üst panel: (solda) inhibitörleri olmadan Jacalin boyama. (Merkezi) Jacalin boyama melibiyoz tarafından inhibe edilmiştir. (Sağda) Chitin-hidrolizat Jacalin boyama inhibe etmemiştir. Alt panel: (solda) inhibitör olmadan sWGA boyama. (Merkezi) melibiyoz sWGA boyama inhibe etmemiştir. (Sağda) sWGA boyama Chitin-hidrolizat tarafından inhibe edilmiştir. Bu inhibisyon dokuları ile lektinlerinin spesifik etkileşimi teyit etmektedir. Boyama inhibisyon Asteriskler imajının. Ölçek çubuğu 100 mikron gösterir. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig6.jpg" /> Şekil 6. Sekretuar müsin, glikolipid ve donmuş insan kolorektal kanser dokularında glukanıdır epitopların tespiti. Villöz karsinom ve mukoza karsinom Kolorektal kanser biyopsi sıvı azot içinde ek dondurulmuş ve OCT gömülü. Doku kesitleri 1 saat süreyle inkübe edildisalgılanan musin karşı antikorlar ile MUC5AC sialyl Lewis - glukanıdır epitop gangliosides (kolorektal kanser belirteci CA 19-9) üzerinde bulunan ve sialyl-Tn - müsin üzerinde bol glukanıdır epitopu (TKH2 antikor ile tespit) ile 30 dakika inkübasyon izledi biyotinile eşek anti-fare IgG ikincil antikor, ve peroksidaz-konjuge streptavidin ile 30 dakika inkübasyon. İlave doku peroksidaz-konjuge streptavidin ile 30 dakika inkübasyon, ardından biyotinile lektinler SNA ve sWGA ile 1 saat boyunca inkübe edildi. Peroksidaz boyama AEC kiti kullanılarak geliştirilmiştir. Siyah ölçek çubuğu 200 mikron gösterir.

<ol><li>Slayter, H. S., Wold, J. K., Midtvedt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucin+of+germ-free+rats.+Biochemical+and+electron-microscopic+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucin of germ-free rats. Biochemical and electron-microscopic characterization.</a> Carbohydr. Res. 222, 1-9 (1991).</li>
<li>Lamblin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carbohydrate+diversity+of+human+respiratory+mucins%3A+a+protection+of+the+underlying+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Rev.+Respir.+Dis%22%5BJournal%5D)">The carbohydrate diversity of human respiratory mucins: a protection of the underlying mucosa.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 144, S19-S24 (1991).</li>
<li>Corfield, A. P., Carroll, D., Myerscough, N., Probert, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucins+in+the+gastrointestinal+tract+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Mucins in the gastrointestinal tract in health and disease.</a> Front. Biosci. 6, D1321-D1357 (2001).</li>
<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).</li>
<li>Lievin-Le Moal, V., Servin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+front+line+of+enteric+host+defense+against+unwelcome+intrusion+of+harmful+microorganisms%3A+mucins%2C+antimicrobial+peptides%2C+and+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The front line of enteric host defense against unwelcome intrusion of harmful microorganisms: mucins, antimicrobial peptides, and microbiota.</a> Clin. Microbiol. Rev. 19, 315-337 (2006).</li>
<li>Kim, Y. S., Ho, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+goblet+cells+and+mucins+in+health+and+disease%3A+recent+insights+and+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gastroenterol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Intestinal goblet cells and mucins in health and disease: recent insights and progress.</a> Curr. Gastroenterol. Rep. 12, 319-330 (2010).</li>
<li>Nochi, T., Kiyono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+in+the+mucosal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">Innate immunity in the mucosal immune system.</a> Curr. Pharm. Des. 12, 4203-4213 (2006).</li>
<li>Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+airway+epithelium%3A+soldier+in+the+fight+against+respiratory+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses.</a> Clin. Microbiol. Rev. 24, 210-229 (2011).</li>
<li>McGuckin, M. A., Linden, S. K., Sutton, P., Florin, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucin+dynamics+and+enteric+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mucin dynamics and enteric pathogens.</a> Nat. Rev. Microbiol. 9, 265-278 (2011).</li>
<li>Knowles, M. R., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucus+clearance+as+a+primary+innate+defense+mechanism+for+mammalian+airways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Mucus clearance as a primary innate defense mechanism for mammalian airways.</a> J. Clin. Invest. 109, 571-577 (2002).</li>
<li>Johansson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inner+of+the+two+Muc2+mucin-dependent+mucus+layers+in+colon+is+devoid+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15064-15069 (2008).</li>
<li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 159-169 (2010).</li>
<li>Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHayat%2C+MA+%22Microscopy%2C+Immunohistochemistry%2C+and+Antigen+Retrieval+Methods%3A+For+Light+and+Electron+Microscopy%22">Microscopy, Immunohistochemistry, and Antigen Retrieval Methods: For Light and Electron Microscopy</a>. Hayat, M. A. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York, NY. 53-70 (2002).</li>
<li>Cohen, M., Hurtado-Ziola, N., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABO+blood+group+glycans+modulate+sialic+acid+recognition+on+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">ABO blood group glycans modulate sialic acid recognition on erythrocytes.</a> Blood. 114, 3668-3676 (2009).</li>
<li>Cohen, M., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sialome--far+more+than+the+sum+of+its+parts%5BTitle%5D)+AND+%22OMICS%22%5BJournal%5D)">The sialome--far more than the sum of its parts.</a> OMICS. 14, 455-464 (2010).</li>
<li>Ota, H., Katsuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating+laminated+array+of+two+types+of+mucin+in+the+human+gastric+surface+mucous+later%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemical+J%22%5BJournal%5D)">Alternating laminated array of two types of mucin in the human gastric surface mucous later.</a> Histochemical J. 24, 86-92 (1992).</li>
<li>Matsuo, K., Ota, H., Akamatsu, T., Sugiyama, A., Katsuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemistry+of+the+surface+mucous+gel+layer+of+the+human+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Histochemistry of the surface mucous gel layer of the human colon.</a> Gut. 40, 782-789 (1997).</li>
<li>Boyde, A., Maconnachie, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+lithium+salts+reduces+ethanol+dehydration+shrinkage+of+glutaraldehyde+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Treatment with lithium salts reduces ethanol dehydration shrinkage of glutaraldehyde fixed tissue.</a> Histochemistry. 66, 181-187 (1980).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Dondurulmuş dokularda mukus ve glukanıdır epitoplarının korunması parafine gömüldü dokuların üstündür. Bu mukus salgılanması katman (Şekil 1 ve 3) ve parafine gömülmüş dokulara göre dondurulmuş dokuda üç glukanlardır yapılarının dağılımı (Şekil 3) arasında muhafaza göstermiştir. Bu tür Carnoy çözeltisi gibi özel fiksatifler, (% 60 etanol,% 30 kloroform,% 10 asetik asit) 17 doku numuneleri içinde mukus tabakasının en uygun şekilde korunması için geliştirilmiştir. Optimal, bu çözüm mukus çalışmalar için varız doku örnekleri toplamak için kullanılması gerektiğini ve mukus tabakası 16-17 pürüzsüz bir görünüm korumak için gösterilmiştir. OCT gömülü sabitlenmemiş donmuş örnekleri mukus tabakası sağlam görünür ve bazı alanlarda doku ayırmak olabilir, ancak genel tabakası kalınlığı Carnoy solüsyonu ve embedd ile tespit edilen dokularda gözlenen ile uyum içindedirParafin 16-17 ed. 16 - Örneğin, dondurulmuş insan kolon dokusunda bölümünde mukus tabakası Carnoy&#39;s sabit insan kolon Örnek 55.4 ± 2.5 mikron (204.8 mikron aralığında 7.7) için bildirilen aralığında ~ 100 mikron (Şekil 1) &#39;dir. Bu, on yıllardır bilinmektedir ki biyolojik numune, 18 ~% 30 büzülme ve dokular 13 ksilen gibi organik çözücüler, Citrisolv ve bir dereceye kadar kloroform ekstresi lipidler, glikolipidler ve, proteinler de etanol dehidrasyon ile sonuçlanır. Fiksasyon (% 10 tamponlu formalin), dehidratasyon (artan etanol konsantrasyonu) ve takas (Citrisolv veya ksilen): parafine gömme için Doku işlem aşağıdaki adımları içerir. Sabitlenmemiş dondurulmuş doku kesitlerinde şu adımları taklit ederek, biz Citrisolv (Figür parafine gömülü dokuların buna benzer doku morfolojisi sonuçlanan dondurulmuş doku bölümlerden mukus ayıklar göstermiştire 2, sağ panel). Buna karşılık, mukus katman (Şekil 2, sol ve orta panel) ya da formalin etanol ile inkübasyon yoluyla değişmemiştir. Bu da gösteriyor ki Citrisolv / ksilen uzamış inkübasyon gerektirir standart parafine gömme prosedürün açıklığa adım, mukus tabakasının çöküşle sonuçlanır. Formalin fiksasyonu kolayca glikan, lipid glikolipitler ve proteinler (Şekil 2, 3 ve 6) karşı lektinler ve antikorlar ile boyanarak edilebilir formalin ile tespit edildi mukus tabakası ve dondurulmuş doku bölümleri zarar vermez. Bu etkiler membrana bağlı proteinler ve doku patolojisinin çalışma için önemsiz olabilir, ama bu tür salgılanan mukus tabakası gibi yüksek nemli yapılar için yıkıcı vardır. Müsinlerin Ancak histolojik çalışmalar hala mukus tabakası korunması suboptimal olduğu parafine gömülü örnekleri, çoğunlukla yapılır. Böyle se kesin kimlik olarak mukus tabakası kompozisyon derinliği analizlerindecreted ya da zar bağlı glikoproteindir MUC kombinasyonları spesifik antikorlar ve protein omurgaları belirlenmesi için kütle spektrometrisi gerektirir. Mukus tabakasının korunması gibi çalışmaları için ancak ilk gerekliliktir. Birçok laboratuar farklı projeler için geçmişte toplanmıştır OCT dondurulmuş doku örneklerinin, bu dokular kolayca müsin, glikolipid ve mukus korunması için benzersiz tasarlanmış özel fiksatif içine dokuları toplamak için ihtiyacı ortadan kaldırarak glukanıdır dağılımını kullanılabilir olması. Donmuş dokular en az işleme geçmesi ve bu yüzden doğal olarak sulu glikan, lipid doğal dağılımı muhafaza edilir. Bu mikrobiyal-konak ilişkileri aleminde özellikle önemlidir. Bu &quot;bariyer&quot; molekülleri dekorasyon salgılanan müsin ve birçok glukanıdır yapıların natüralist dağılımı ve bolluğu Bilgi konak savunma, mikrobiyal sömürü ve patojenler anlamada anahtar olacakolduğunu.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif ve ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> 2-metil bütan </td><td> Fisher Scientific </td><td> 03551-4 </td></tr><tr><td> AEC peroksidaz substrat kiti </td><td> Vektör Labs </td><td> SK-4200 </td></tr><tr><td> Alsiyan Mavi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3157 </td></tr><tr><td> Anti-CA 19-9 monoklonal antikor </td><td> Calbiochem </td><td> CA1003 </td></tr><tr><td> Anti-MUC5AC monoklonal antikor </td><td> Millipore </td><td> MAB2011 </td></tr><tr><td> Avidin-Biotin engelleme kiti </td><td> Vektör Labs </td><td> SP-2001 </td></tr><tr><td> Biyotinile eşek anti-fare antikoru </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 90863 </td></tr><tr><td> Biotinlenmiş SNA </td><td> Vektör Labs </td><td> B-1305 </td></tr><tr><td> Sığır sedk </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td></tr><tr><td> Chitin-hidrolizat </td><td> Vektör Labs </td><td> SP-0090 </td></tr><tr><td> Kriyostat mikrotom </td><td> Leica Microsystems </td><td> Leica CM 1800 </td></tr><tr><td> Hematoksilen </td><td> Surgipath Medikal Sanayi </td><td> 3801570 </td></tr><tr><td> Hidrojen peroksit% 30 </td><td> Fisher Scientific </td><td> H325-100 </td></tr><tr><td> Jacalin-FITC </td><td> Vektör Labs </td><td> FL-1151 </td></tr><tr><td> Mayer Hematoksilen </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MHS32 </td></tr><tr><td> Melibiyoz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5500 </td></tr><tr><td> Nükleer Hızlı Kırmızı </td><td> Vektör Labs </td><td> H-3403 </td></tr><tr><td> Ekim bileşik </td><td> VWR International </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> Peroksidaz bağlı streptavidin </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 94638 </td></tr><tr><td> Schiff reaktifi </td><td> Elektron mikroskobu bilimler </td><td> 26052 </td></tr><tr><td> sWGA-Rodamin </td><td> Vektör Labs </td><td> RL1022S </td></tr><tr><td> TKH2 monoklonal antikor </td><td> ATCC </td><td> HB-9654 </td></tr><tr><td> VectaMount sulu montaj medya </td><td> Vektör Labs </td><td> H-5501 </td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 8310-4 </td></tr><tr><td> Peel-A Way kalıpları </td><td> Polysciences A.Ş. </td><td> 18646A-1 </td></tr></tbody></table>

doğal müsin dağıtım eğitim için sabitlenmemiş, dondurulmuş dokular kullanma

Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution

Mukinler ağırlığı 1-3% 70&#39;den fazla karbonhidrat içeren karmaşık ve ağır glikosilatlıdır O-bağlı glikoproteinler, vardır. Salgılanan müsin, goblet hücresi ve mide mukozası tarafından üretilen, bir mikrometre kalınlığında mukus tabakası için iskele sağladığı hatları bağırsak ve solunum yolu 3,4 epithelia. Müsin ek olarak, mukus tabakalar da antimikrobiyal peptitler, sitokinler ve immünoglobulinler 5-9 içerir. Mukus tabakası konak bağışıklık önemli bir parçası olduğunu ve mikroorganizmaların 8,10-12 istila karşı ilk savunma hattı oluşturur. Bunun gibi, mukus mikropların çok sayıda etkileşimleri tabidir, hem patojenler ve simbiont ve salgılanan müsin bu etkileşimler için önemli bir arayüz oluştururlar. Böyle biyolojik etkileşimin çalışma genellikle doku toplama ve boyama için histolojik yöntemler içerir. Doku toplama ve preserv için iki en yaygın olarak kullanılan yöntemler histolojikklinik ve araştırma laboratuvarlarında ation şunlardır: formalin fiksasyonu kriyo-koruyan medya gömerek ardından, parafine gömme takip ve doku dondurma. Parafine gömülü doku örneklerinde berraklık ve iyi tanımlanmış morfolojisi gibi histolojik görselleştirme için optimal nitelikler ile bölümleri üretmek. Bununla birlikte, parafin gömme işlemi sırasında epitopunun çok sayıda değiştirilmiş ve bu epitoplara incelemek için, doku kesitleri daha fazla sayıda epitop yöntemlerine de 13 biri ile işlenmesi gereken hale gelir. Salgılanan müsin ve lipitler organik çözücü maddeler (ya da ksilen Citrisolv) ile inkübasyon uzun sürmesi parafin gömme temizleme adımı sırasında doku ayıklanır. Bu nedenle bu yaklaşım müsin ve in vivo mukus niteliği ve dağıtım odaklanan çalışmalar için optimal olduğunu. Buna karşılık, Optimal Kesme Sıcaklık donma dokuların (OCT) orta bir katıştırmaboşluklar örnek dehidratasyon ve takas ve örnek hidrasyon korur. Bu mukus sulu tabaka daha iyi koruma sağlar, ve böylece epitel biyoloji Müsinlerin çok sayıda rolleri çalışma sağlar. Bu yöntem, doku en az işleme gerektirdiği gibi, doku daha doğal bir durumda muhafaza edilir. Dolayısıyla dondurulmuş doku bölümleri boyamadan önce herhangi bir ek işlem gerektirmez ve kolayca immünohistokimyasal yöntemler kullanılarak analiz edilebilir. Biz dondurulmuş kolon örneklerinde mikrometre kalınlığında salgılanan mukus tabakasının korunması göstermektedir. Aynı dokularda parafin içine gömülmüş, bu katman büyük ölçüde azaltılmış olur. Ayrıca bitki lektinler kullanarak müsin sunulan glukanıdır epitopların immünofloresan boyama göstermektedir. Bu yaklaşımın avantajı, özel fiksatif kullanımını gerektirir ve zaten laboratuvarda muhafaza edilebilir dondurulmuş doku kullanan veriyor olmamasıdır.

Optimal Kesme Sıcaklık orta (OCT) gömülü sabitlenmemiş dondurulmuş doku örneklerinin salgılanan mukus doğal dağıtım ve glikozilasyon incelemek için kullanılabilir. Bu yaklaşım, doku işleme minimal ve glikolipitler, müsin ve glukanıdır-epitopların doğal sunumu korunur. Doku kesitleri floresan veya kromojenik algılama kullanılarak immünohistokimyasal olarak analiz edilebilir.

Doğal Müsin Dağıtım Eğitim için sabitlenmemiş, Dondurulmuş Dokular kullanma

Müsinler, ağırlıkça %70'ten fazla karbonhidrat içeren, kompleks ve yoğun şekilde glikozillenmiş O-bağlı glikoproteinlerdir1-3. ... tarafından üretilen salgılanan müsinler,

Aşağıdaki deneyin genel amacı, doku örneklerindeki salgılanmış mukusun glikozilasyonunun doğal dağılımını korumaktır. Bu, öncelikle doku işlemeyi minimize etmek için dokuların optimal kesme sıcaklığı ortamına veya OCT'ye gömülmesiyle ve ardından glikan yapılarının, müsinin ve mukusun tespitine izin verilmesiyle sağlanır. Kesitler, lektin antikorları ve histokimyasal boyalarla inkübe edilir.Lektin bağlanma özgüllüğünü doğrulamak için, kompetitif inhibisyon veya glikan epitoplarının enzimatik cleavage yoluyla lektin bağlanması daha fazla zorlanabilir. Nihayetinde, mukus ve dondurulmuş doku örneklerinin korunması, histokimyasal analiz yoluyla parafin gömülü örneklerdeki mukusun korunmasıyla karşılaştırılabilir. Bu tekniği, dokuların parafine gömülmesi ve karnoy solüsyonu ile fikse edilmesi gibi mevcut yöntemlere tercih etmenin temel avantajları, bu yöntemin özel fiksatiflerin kullanımını gerektirmemesi ve laboratuvarda halihazırda mevcut olabilecek dondurulmuş dokuların kullanımına olanak tanımasıdır.Başlamak için, şok dondurulmuş dokunun bir kriyomikrotom haznesine yerleştirilerek -20 °C'ye ısınmasını bekleyin. Bu sırada, sığ bir strafor kutuya iki metil bütan ekleyip ardından kutuya kuru buz ekleyerek bir dondurma banyosu hazırlayın. Daha sonra, soyulabilir dondurma kalıbının tabanını kaplayacak kadar OCT ekleyin ve ardından dokuyu kalıba yerleştirin.Dokunun, kalıbın tabanında istenen yönelimde durduğundan emin olun. Dokunun üzerini daha fazla OCT ile kapatın ve ardından kalıbı dondurma banyosuna yerleştirin. Doku dondukça OCT bileşiği beyaza dönecektir. Donma işlemi tamamlandığında, kalıbı donmuş bloktan ayırın ve bloğu işaretlenmiş bir dondurucu torbasına yerleştirin.Dokuyu kesmeden önce, dondurulmuş blokları kullanana kadar -80 °C'de saklayın. İlgili dondurulmuş blokları, -20 °C'ye ulaşmaları için yaklaşık 30 dakika boyunca kriyomikrotom haznesine yerleştirin. Bloklar ısındığında 3-5 µm kalınlığında bir kesit alın ve ardından kesitin üzerine pozitif yüklü bir cam lam yerleştirin.Dokular 30 ila 60 dakika boyunca havada kurutulduktan sonra lama yapışacaktır. Lamları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %10 tamponlu formaldehit ile sabitleyin ve ardından dokuları aum. Blue ile boyamak için lamları 250 mililitre tampon çözeltiye 10 kez hızlıca daldırarak PB PBS ile üç kez yıkayın. İlk olarak lamları suyla durulayın ve ardından üç dakika boyunca %3 asetik asit içinde inkübe edin.Ardından dokuları AUM mavi çözeltisi ile inkübe edin. 30 dakika sonra, lamları 10 dakika boyunca akan musluk suyunda yıkayın ve ardından DI su ile durulayın. Çekirdekleri beş dakika boyunca nuclear fast red ile karşıt boyayın ve ardından lamları üç kez DI su ile yıkayın. Şimdi, lamları bir dakika boyunca %95 etanolde inkübe ederek, ardından %100 etanolde üç hızlı değişimle ve sonrasında citrus resolve içerisinde ikişer dakikalık üç değişimleyerek dehidrate edin ve saydamlaştırın.Son olarak, periyodik asit Schiff ile dokuları boyamak için Cyto Seal 60 gibi bir rezonans ortamı kullanarak lam üzerine bir kapatma camı yerleştirin. İlk olarak lamları su ile durulayın ve ardından taze hazırlanmış %1 periyodik asit ile beş dakika inkübe edin. Şimdi, lamları di su ile üç kez yıkayın.Slaytları bir kez Milli Q suyuna daldırın ve ardından dokuları Schiff reaktifi ile boyayın. 15 dakika sonra, slaytları 10 dakika boyunca akan musluk suyunda yıkayın ve ardından bir kez DI suyuna daldırın. Çekirdekleri 30 saniye boyunca sgio metin ile karşı boyayın ve ardından slaytları üç kez DI suyunda yıkayın.Son olarak lamları 30 saniye boyunca inkübe edin. Scot'un musluk suyu mavileştirme reaktifi ile üç kez daha DI su ile yıkayın ve ardından kalsiyum mavisi boyamasında gösterildiği gibi dokularıy dehidrate edin. Lektinler kullanılarak glikan epitoplarının floresan deteksiyonu için lamları bir kapatma camı ile kapatın.İlk olarak, lamı PBS içindeki BSA ile 10 ila 30 dakika boyunca bloke edin. Ardından, lamı 15 dakika avadon ile inkübe ederek endojen biyotini bloke edin, bunu bir PBS yıkamasıyla takip edin ve ardından başka bir PBS yıkamasından sonra 0.01% biotin ile 15 dakikalık bir inkübasyon gerçekleştirin. Lamı bir boyama kutusuna yerleştirin, her doku kesitinin üzerine taze hazırlanmış istenen lektin karışımını katmanlar halinde ekleyin ve ardından lektin karışımını nazikçe parfum ile örtün.Şimdi lamı bir saat boyunca karanlıkta inkübe edin. Parfümu nazikçe uzaklaştırın ve lamı üç kez PBS ile yıkayın. Ardından lamı konjuge SCI beş içerisindeki strep avid ile kaplayın ve 30 dakika sonra tekrar karanlıkta inkübe edin, lamları üç kez PBS ile yıkayın ve ardından çekirdekleri dappy ile karşı boyayın.Son olarak, sase enzim kontrolü için vector mount montaj medyumu gibi sulu bir ortam kullanarak lamı bir lamelle kapatın. Nemli bir ortam oluşturmak için boş bir uç kutusunun tabanına su ekleyerek başlayın. Negatif kontrol lamlarını, uç kutusunun üst tepsisine yüzleri yukarı bakacak şekilde yerleştirin.Doku kesitlerinin üzerine 150 ila 200 µL US çözeltisi damlatın ve ardından hava kabarcığı oluşumunu önleyerek her lamı bir lamel ile kapatın. Kutu kapağını kapatın ve kutuyu 37 °C'de iki buçuk saat boyunca inkübe edin. Serbest silik asitleri uzaklaştırmak için lamları oda sıcaklığında PBS ile üç kez yıkayın.Ardından, kompetitif inhibisyon için lamları oda sıcaklığında bir saat boyunca SNA ile inkübe edin. Kontrol alikotu olarak, lektin karışımının 200 µL'sini iki adet eppendorf tüpüne paylaştırın. Daha sonra, tüplerden birine 200 mM Jacqueline inhibitörü Meli bios ekleyin ve diğer tüpe 1/10 dilüsyonunda SWGA inhibitörü kitin hidrolizatı ekleyin.Ardından lamları, inhibitör içeren karışımlarla oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Bu ilk figür doku örneğinde, OCT içinde dondurulmuş veya parafine gömülmüş fare veya tavuk kolon örneklerinin kesitleri; pembe renkte periyodik asit Schiff veya mavi renkte calcium blue ile boyanmıştır. Parafine gömülmüş doku örnekleri ile OCT kriyoprotektan ortamda dondurulmuş dokuların karşılaştırılması, dondurulmuş dokulardaki müsin glikoproteinlerinin korunumu ve boyama kalitesinde çarpıcı farklar olduğunu ortaya koymuştur.Parafinle gömülmüş dokularda, oklarla belirtildiği üzere, goblet hücrelerindeki müsine ek olarak salgılanmış mukus da görülmekteydi. Mukus boyanması goblet hücreleri ile sınırlıydı. Bu şekilde, müsindeki belirgin kayıp ve citrus resolve içinde inkübe edilen dokular gözlemlenebilir.Dondurulmuş tavuk ileum örneklerinin seri kesitleri %10 tamponlu forminde fikse edilip nemli tutulmuş, ardından sırasıyla %70, %90 ve %100'lük etanolde 20'şer dakika inkübe edilerek etanol ilele dehidre edilmiş veya etanol ile dehidre edildikten sonra bir saat boyunca citrus all ile şeffaflaştırılmıştır. Sadece etanol dehidrasyonu ve etanol dehidrasyonu artı citrus all şeffaflaştırma işlemi doku morfolojisini iyileştirmiştir. Tek başına uygulanan ileri etanol dehidrasyonunun mavi boyama üzerinde anlamlı bir etkisi olmamıştır.Buna karşılık, sitrus ile yapılan tüm inkübasyonlar, mavi boyanmayı önceki şekilde görülen parafinle gömülmüş dokularda gözlemlenene benzer bir paternle kadeh hücreleriyle sınırlandırarak azaltmıştır. Kutular, allium mavi boyalı doku kesitlerindeki daha yüksek büyütmeli alanları belirtmektedir. Bir sonraki görüntü serisinde, OCT içinde dondurulmuş veya parafine gömülmüş, ardından Jacqueline mavi, SWG yeşil ve SNA kırmızı renkle problanmış tavuk ileum örnekleri dondurulmuş dokularda gösterilmektedir.Jacqueline'in olink glikanlarına bağlanması, OCT dondurulmuş doku kesitindeki oklarla belirtildiği üzere, goblet hücrelerinden lümene sızıyormuş gibi görünen yapıları ortaya çıkardı. Buna karşılık, Jacqueline'in parafin gömülü dokulara bağlanması, bu oklarla gösterilen goblet hücreleri ve villi fırça kenarı ile sınırlıydı. Beta bir dört GL'nin SWGA boyaması, oklarla belirtildiği üzere, hem dondurulmuş hem de parafin gömülü dokularda Jacqueline lektininin bağlanmasıyla kısmen aynı yerleşim gösterir.Buna karşılık, kırmızı renkte olan ve ok uçlarıyla belirtilen SNA lektini, hücre içi alfa iki altı bağlı siyalik asitlere bağlanır ve bu şekildeki noktalı oklarla gösterilen mavi renkli Jacqueline ile ko-lokalizasyon göstermez. Siyalik asit epitopları, doku kesiti bir neuraminidase ile sindirilerek tavuk ileum örneklerinden uzaklaştırılmış veya burada görüldüğü gibi inkübasyon ve sodyum asetat tamponu ile işleme tabi tutulmuştur. Neuraminidase işlemi, biotinylated SNA ile yapılan ve işlem görmemiş dokuda gözlemlenen boyanmayı ortadan kaldırmış, böylece SNA'nın siyalik asitlere olan bağlanma özgüllüğünü doğrulamıştır.Lektin özgünlüğü, Jacalin boyaması için melibiyoz veya SWGA boyaması için kitin hidrolizatı gibi kompetitif bir inhibitör eklenerek de doğrulanabilir. Tavuk ileum örnekleri, bir kez daha Jacalin ve SWGA karışımı ile inkübe edildi. Bu kez işlem, spesifik lektin inhibitörleri olan melibiyoz veya kitin hidrolizatı varlığında gerçekleştirildi. Jacalin boyaması melibiyoz tarafından inhibe edildi ancak kitin hidrolizatı tarafından inhibe edilmedi. Aksine, SWGA boyaması kitin hidrolizatı tarafından inhibe edildi ancak melibiyoz tarafından inhibe edilmedi.Bu son görüntü serisi, kliniklerde ve araştırma laboratuvarlarında rutin olarak elde edilen şok dondurulmuş doku örneklerinin OCT'ye gömülebileceğini ve müsin üzerindeki glikanları, glikoproteinleri, glikolipidleri ve glikanları incelemek için kullanılabileceğini göstermektedir. Villöz karsinoma ve müsinöz karsinoma dokularından alınan bu kolorektal kanser biyopsileri, sıvı azot içinde şok dondurulmuş, OCT'ye gömülmüş ve belirtilen çeşitli müsin ve glikan epitopları için başarıyla boyanmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, dokuların OCT'ye nasıl gömüleceği ve immünokimyasal yöntemler kullanılarak mukus ve doku glikozilasyonunun nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

using-unfixed-frozen-tissues-to-study-natural-mucin-distribution

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, meme kanserinin bir fare modelinde tümör hedefleme antikorlarının biyolojik dağılımını incelemek için in vivo immünofloresan lokalizasyon (IVIL) tekniğini göstermektedir. Farede tümöre özgü bir antikorun intravenöz enjeksiyonu üzerine, tümör cerrahi olarak izole edilir ve antikorun tümör dokusu içindeki lokalizasyonu ex vivo immün boyama yoluyla doğrulanır.

Antikor Biyodağılımını İncelemek için Bir İn Vivo İmmünofloresan Lokalizasyon Yöntemi

Burada, uzamsal olarak farklı murin kolonik epitel yüzey hücrelerinin alttaki kript bazlı hücrelerden izolasyonu için basit bir yöntem açıklıyoruz.

Fare Kolon Mukozanın Mikrodisseksiyon için Cryosectioning Yöntemi

Bu makalede açıklanan dolaylı immünfloresan protokol algılama ve fare meme bezinde proteinlerin yerelleştirme verir. Tam bir yöntem olup, meme bezi örnekleri hazırlamak için floresan mikroskobu ile görüntü, doku kesitlerinde immunhistokimya gerçekleştirmek için ve görüntüleri yeniden verilir.

Fare Meme Bezinin Dondurulmuş Bölümler Dolaylı İmmünofloresan

Müsinler, boyutları 0.2 ila 200 megadalton (MDa) arasında değişen yüksek moleküler ağırlıklı glikokonjugatlardır. Boyutlarının bir sonucu olarak, müsinler geleneksel poliakrilamid jellere nüfuz etmez ve ayrılma için daha büyük gözenekler gerektirir. Bağıl miktar tayinini değerlendirmek ve polimer montajını incelemek için müsin agaroz jel elektroforezi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Musin Agaroz jel elektroforezi: Yüksek molekül ağırlıklı glikoproteinler için Western Blot

Burada, hücre dışı Matriks (ECM) ifade ve duktal Morfoloji araştırmak için meme dokuları bütün, olduğu gibi fare yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. Fare #4 karın bezleri tarafsız tampon formalin içinde sabit kesitli ve ECM proteinler için immünhistokimya kullanarak lekeli 8-10 hafta eski kadın nulliparous fareler, elde.

Sağlam, Bütün fare meme dokuları yalıtım hücre dışı matriks ifade ve bezi Morfoloji analizi için

Kuga vd fosforilasyon-durum belirli antikor aktin bağlayıcı protein tirozin 1798 (pY1798) fosforile girdin karşı tutam hücreleri (TCs) etiketlemek için kullanılabilir keşfetti. Bu iletişim kuralı serbest yüzer değişir cryosections pY1798 antikorlar ile immünfloresan boyama kullanarak TCs güçlü görselleştirme sağlar.

Serbest dalgalanma fare değişir Cryosections hücrelerde bağırsak tutam görselleştirmek için Anti-fosfo-girdin antikor kullanımı

Bu protokolün amacı Memeli gastrointestinal sistemde Candida albicans hücre şekli ve lokalizasyonu görselleştirmektir.

Situ Hibridizasyonfloresan Kullanarak Murine Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Görselleştirilmesi

Bu kolaylaştırılmış protokol, karmaşık doku örneklerindeki bakterileri tespit etmek ve görüntülemek için, dokuyu sabitlemekten floresan in situ hibridizasyonlu mikropları boyamaya kadar bir iş akışını detaylandırıyor.

Floresan In Situ Hibridizasyon, Lectin Boyama ve Görüntüleme Yoluyla Gut Mikrobiyota-konak Etkileşimlerinin Görselleştirilmesi

Burada, müsinlerden O-glikanların salınması ve ardından MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanılarak tuzdan arındırma, permetilasyon ve analiz için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon Uçuş Süresi Kütle Spektrometresi Kullanılarak Permetillenmiş Müsin O-glikanlarının Profillenmesi

Bu çalışma, salgılanan mukusu ölçmek için tam montajlı bağırsak dokuları ve çoklu foton mikroskobu kullanan bir 3D görüntüleme yöntemi sunarak, karbamoilkolin klorür gibi uyaranlara yanıt olarak mukus dinamiklerinin hassas hacimsel analizini ve görselleştirilmesini sağlar.

Tam Montajlı Doku Görüntüleme Kullanılarak Bağırsak Mukusunun Üç Boyutlu Miktar Tayini

Öğrenin, OCT ile gömülü dondurulmuş dokularda doğal glikozilasyon ve müsin dağılımını koruma yöntemini. Lectinler ve histokimyasal boyamalarla glikan yapılarını analiz edin.

Doğal Müsin Dağıtım Eğitim için sabitlenmemiş, Dondurulmuş Dokular kullanma

Daha fazla video keşfet