Doğal Müsin Dağıtım Eğitim için sabitlenmemiş, Dondurulmuş Dokular kullanma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, doku örneklerindeki salgılanmış mukusun glikozilasyonunun doğal dağılımını korumaktır. Bu, öncelikle doku işlemeyi minimize etmek için dokuların optimal kesme sıcaklığı ortamına veya OCT'ye gömülmesiyle ve ardından glikan yapılarının, müsinin ve mukusun tespitine izin verilmesiyle sağlanır. Kesitler, lektin antikorları ve histokimyasal boyalarla inkübe edilir.

Lektin bağlanma özgüllüğünü doğrulamak için, kompetitif inhibisyon veya glikan epitoplarının enzimatik cleavage yoluyla lektin bağlanması daha fazla zorlanabilir. Nihayetinde, mukus ve dondurulmuş doku örneklerinin korunması, histokimyasal analiz yoluyla parafin gömülü örneklerdeki mukusun korunmasıyla karşılaştırılabilir. Bu tekniği, dokuların parafine gömülmesi ve karnoy solüsyonu ile fikse edilmesi gibi mevcut yöntemlere tercih etmenin temel avantajları, bu yöntemin özel fiksatiflerin kullanımını gerektirmemesi ve laboratuvarda halihazırda mevcut olabilecek dondurulmuş dokuların kullanımına olanak tanımasıdır.

Başlamak için, şok dondurulmuş dokunun bir kriyomikrotom haznesine yerleştirilerek -20 °C'ye ısınmasını bekleyin. Bu sırada, sığ bir strafor kutuya iki metil bütan ekleyip ardından kutuya kuru buz ekleyerek bir dondurma banyosu hazırlayın. Daha sonra, soyulabilir dondurma kalıbının tabanını kaplayacak kadar OCT ekleyin ve ardından dokuyu kalıba yerleştirin.

Dokunun, kalıbın tabanında istenen yönelimde durduğundan emin olun. Dokunun üzerini daha fazla OCT ile kapatın ve ardından kalıbı dondurma banyosuna yerleştirin. Doku dondukça OCT bileşiği beyaza dönecektir. Donma işlemi tamamlandığında, kalıbı donmuş bloktan ayırın ve bloğu işaretlenmiş bir dondurucu torbasına yerleştirin.

Dokuyu kesmeden önce, dondurulmuş blokları kullanana kadar -80 °C'de saklayın. İlgili dondurulmuş blokları, -20 °C'ye ulaşmaları için yaklaşık 30 dakika boyunca kriyomikrotom haznesine yerleştirin. Bloklar ısındığında 3-5 µm kalınlığında bir kesit alın ve ardından kesitin üzerine pozitif yüklü bir cam lam yerleştirin.

Dokular 30 ila 60 dakika boyunca havada kurutulduktan sonra lama yapışacaktır. Lamları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %10 tamponlu formaldehit ile sabitleyin ve ardından dokuları aum. Blue ile boyamak için lamları 250 mililitre tampon çözeltiye 10 kez hızlıca daldırarak PB PBS ile üç kez yıkayın. İlk olarak lamları suyla durulayın ve ardından üç dakika boyunca %3 asetik asit içinde inkübe edin.

Ardından dokuları AUM mavi çözeltisi ile inkübe edin. 30 dakika sonra, lamları 10 dakika boyunca akan musluk suyunda yıkayın ve ardından DI su ile durulayın. Çekirdekleri beş dakika boyunca nuclear fast red ile karşıt boyayın ve ardından lamları üç kez DI su ile yıkayın. Şimdi, lamları bir dakika boyunca %95 etanolde inkübe ederek, ardından %100 etanolde üç hızlı değişimle ve sonrasında citrus resolve içerisinde ikişer dakikalık üç değişimleyerek dehidrate edin ve saydamlaştırın.

Son olarak, periyodik asit Schiff ile dokuları boyamak için Cyto Seal 60 gibi bir rezonans ortamı kullanarak lam üzerine bir kapatma camı yerleştirin. İlk olarak lamları su ile durulayın ve ardından taze hazırlanmış %1 periyodik asit ile beş dakika inkübe edin. Şimdi, lamları di su ile üç kez yıkayın.

Slaytları bir kez Milli Q suyuna daldırın ve ardından dokuları Schiff reaktifi ile boyayın. 15 dakika sonra, slaytları 10 dakika boyunca akan musluk suyunda yıkayın ve ardından bir kez DI suyuna daldırın. Çekirdekleri 30 saniye boyunca sgio metin ile karşı boyayın ve ardından slaytları üç kez DI suyunda yıkayın.

Son olarak lamları 30 saniye boyunca inkübe edin. Scot'un musluk suyu mavileştirme reaktifi ile üç kez daha DI su ile yıkayın ve ardından kalsiyum mavisi boyamasında gösterildiği gibi dokularıy dehidrate edin. Lektinler kullanılarak glikan epitoplarının floresan deteksiyonu için lamları bir kapatma camı ile kapatın.

İlk olarak, lamı PBS içindeki BSA ile 10 ila 30 dakika boyunca bloke edin. Ardından, lamı 15 dakika avadon ile inkübe ederek endojen biyotini bloke edin, bunu bir PBS yıkamasıyla takip edin ve ardından başka bir PBS yıkamasından sonra 0.01% biotin ile 15 dakikalık bir inkübasyon gerçekleştirin. Lamı bir boyama kutusuna yerleştirin, her doku kesitinin üzerine taze hazırlanmış istenen lektin karışımını katmanlar halinde ekleyin ve ardından lektin karışımını nazikçe parfum ile örtün.

Şimdi lamı bir saat boyunca karanlıkta inkübe edin. Parfümu nazikçe uzaklaştırın ve lamı üç kez PBS ile yıkayın. Ardından lamı konjuge SCI beş içerisindeki strep avid ile kaplayın ve 30 dakika sonra tekrar karanlıkta inkübe edin, lamları üç kez PBS ile yıkayın ve ardından çekirdekleri dappy ile karşı boyayın.

Son olarak, sase enzim kontrolü için vector mount montaj medyumu gibi sulu bir ortam kullanarak lamı bir lamelle kapatın. Nemli bir ortam oluşturmak için boş bir uç kutusunun tabanına su ekleyerek başlayın. Negatif kontrol lamlarını, uç kutusunun üst tepsisine yüzleri yukarı bakacak şekilde yerleştirin.

Doku kesitlerinin üzerine 150 ila 200 µL US çözeltisi damlatın ve ardından hava kabarcığı oluşumunu önleyerek her lamı bir lamel ile kapatın. Kutu kapağını kapatın ve kutuyu 37 °C'de iki buçuk saat boyunca inkübe edin. Serbest silik asitleri uzaklaştırmak için lamları oda sıcaklığında PBS ile üç kez yıkayın.

Ardından, kompetitif inhibisyon için lamları oda sıcaklığında bir saat boyunca SNA ile inkübe edin. Kontrol alikotu olarak, lektin karışımının 200 µL'sini iki adet eppendorf tüpüne paylaştırın. Daha sonra, tüplerden birine 200 mM Jacqueline inhibitörü Meli bios ekleyin ve diğer tüpe 1/10 dilüsyonunda SWGA inhibitörü kitin hidrolizatı ekleyin.

Ardından lamları, inhibitör içeren karışımlarla oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Bu ilk figür doku örneğinde, OCT içinde dondurulmuş veya parafine gömülmüş fare veya tavuk kolon örneklerinin kesitleri; pembe renkte periyodik asit Schiff veya mavi renkte calcium blue ile boyanmıştır. Parafine gömülmüş doku örnekleri ile OCT kriyoprotektan ortamda dondurulmuş dokuların karşılaştırılması, dondurulmuş dokulardaki müsin glikoproteinlerinin korunumu ve boyama kalitesinde çarpıcı farklar olduğunu ortaya koymuştur.

Parafinle gömülmüş dokularda, oklarla belirtildiği üzere, goblet hücrelerindeki müsine ek olarak salgılanmış mukus da görülmekteydi. Mukus boyanması goblet hücreleri ile sınırlıydı. Bu şekilde, müsindeki belirgin kayıp ve citrus resolve içinde inkübe edilen dokular gözlemlenebilir.

Dondurulmuş tavuk ileum örneklerinin seri kesitleri %10 tamponlu forminde fikse edilip nemli tutulmuş, ardından sırasıyla %70, %90 ve %100'lük etanolde 20'şer dakika inkübe edilerek etanol ilele dehidre edilmiş veya etanol ile dehidre edildikten sonra bir saat boyunca citrus all ile şeffaflaştırılmıştır. Sadece etanol dehidrasyonu ve etanol dehidrasyonu artı citrus all şeffaflaştırma işlemi doku morfolojisini iyileştirmiştir. Tek başına uygulanan ileri etanol dehidrasyonunun mavi boyama üzerinde anlamlı bir etkisi olmamıştır.

Buna karşılık, sitrus ile yapılan tüm inkübasyonlar, mavi boyanmayı önceki şekilde görülen parafinle gömülmüş dokularda gözlemlenene benzer bir paternle kadeh hücreleriyle sınırlandırarak azaltmıştır. Kutular, allium mavi boyalı doku kesitlerindeki daha yüksek büyütmeli alanları belirtmektedir. Bir sonraki görüntü serisinde, OCT içinde dondurulmuş veya parafine gömülmüş, ardından Jacqueline mavi, SWG yeşil ve SNA kırmızı renkle problanmış tavuk ileum örnekleri dondurulmuş dokularda gösterilmektedir.

Jacqueline'in olink glikanlarına bağlanması, OCT dondurulmuş doku kesitindeki oklarla belirtildiği üzere, goblet hücrelerinden lümene sızıyormuş gibi görünen yapıları ortaya çıkardı. Buna karşılık, Jacqueline'in parafin gömülü dokulara bağlanması, bu oklarla gösterilen goblet hücreleri ve villi fırça kenarı ile sınırlıydı. Beta bir dört GL'nin SWGA boyaması, oklarla belirtildiği üzere, hem dondurulmuş hem de parafin gömülü dokularda Jacqueline lektininin bağlanmasıyla kısmen aynı yerleşim gösterir.

Buna karşılık, kırmızı renkte olan ve ok uçlarıyla belirtilen SNA lektini, hücre içi alfa iki altı bağlı siyalik asitlere bağlanır ve bu şekildeki noktalı oklarla gösterilen mavi renkli Jacqueline ile ko-lokalizasyon göstermez. Siyalik asit epitopları, doku kesiti bir neuraminidase ile sindirilerek tavuk ileum örneklerinden uzaklaştırılmış veya burada görüldüğü gibi inkübasyon ve sodyum asetat tamponu ile işleme tabi tutulmuştur. Neuraminidase işlemi, biotinylated SNA ile yapılan ve işlem görmemiş dokuda gözlemlenen boyanmayı ortadan kaldırmış, böylece SNA'nın siyalik asitlere olan bağlanma özgüllüğünü doğrulamıştır.

Lektin özgünlüğü, Jacalin boyaması için melibiyoz veya SWGA boyaması için kitin hidrolizatı gibi kompetitif bir inhibitör eklenerek de doğrulanabilir. Tavuk ileum örnekleri, bir kez daha Jacalin ve SWGA karışımı ile inkübe edildi. Bu kez işlem, spesifik lektin inhibitörleri olan melibiyoz veya kitin hidrolizatı varlığında gerçekleştirildi. Jacalin boyaması melibiyoz tarafından inhibe edildi ancak kitin hidrolizatı tarafından inhibe edilmedi. Aksine, SWGA boyaması kitin hidrolizatı tarafından inhibe edildi ancak melibiyoz tarafından inhibe edilmedi.

Bu son görüntü serisi, kliniklerde ve araştırma laboratuvarlarında rutin olarak elde edilen şok dondurulmuş doku örneklerinin OCT'ye gömülebileceğini ve müsin üzerindeki glikanları, glikoproteinleri, glikolipidleri ve glikanları incelemek için kullanılabileceğini göstermektedir. Villöz karsinoma ve müsinöz karsinoma dokularından alınan bu kolorektal kanser biyopsileri, sıvı azot içinde şok dondurulmuş, OCT'ye gömülmüş ve belirtilen çeşitli müsin ve glikan epitopları için başarıyla boyanmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, dokuların OCT'ye nasıl gömüleceği ve immünokimyasal yöntemler kullanılarak mukus ve doku glikozilasyonunun nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.