Doğal Müsin Dağıtım Eğitim için sabitlenmemiş, Dondurulmuş Dokular kullanma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, doku örneklerinde salgılanan mukusun glikozilasyonunun doğal dağılımını korumaktır. Bu, doku işlemeyi en aza indirmek için önce dokuların optimum kesme sıcaklığına, ortama veya OCT'ye gömülmesi ve daha sonra glikan yapılarının, müsin ve mukusun tespit edilmesine izin vermesiyle elde edilir. Kesitler lektinler, antikorlar ve histokimyasal boyalarla inkübe edilir.

Lektin bağlanması, lektin bağlanma özgüllüğünü doğrulamak için glikan epitoplarının rekabetçi inhibisyonu veya enzimatik bölünmesi ile daha da zorlanabilir. Sonuç olarak, mukus ve donmuş doku örneklerinin korunması, mistik kimyasal analizlerle parafine gömülü örneklerdeki mukusun korunmasıyla karşılaştırılabilir. Bu tekniğin kullanılmasının, paren içine doku gömme ve araba gürültüsü solüsyonu ile eh sabitleme gibi mevcut yöntemlere göre başlıca avantajları, bu yöntemin özel fiksatiflerin kullanılmasını gerektirmemesi ve laboratuvarda zaten mevcut olabilecek donmuş dokuların kullanımına izin vermesidir.

Başlamak için, donmuş dokuyu bir kriyo mikrotom odasına yerleştirerek eksi 20 santigrat dereceye kadar ısınmasına izin verin. Bu arada, sığ bir strafor kutuya iki metil bütan ekleyerek ve ardından kutuya kuru buz ekleyerek bir dondurma banyosu oluşturun. Daha sonra, soyulmuş bir dondurucu kalıbın altını kaplayacak kadar OCT ekleyin ve ardından dokuyu kalıba yerleştirin.

Dokunun kalıbın altına istenen yönde dayandığından emin olun. Dokuyu daha fazla OCT ile örtün ve ardından kalıbı dondurma banyosuna yerleştirin. Doku donduğunda OCT bileşiği beyaza dönecektir Dondurulduktan sonra, kalıbı donmuş bloktan soyun ve bloğu işaretli bir dondurucu poşetine koyun.

Dokuyu bölümlere ayırmadan önce donmuş blokları eksi 80 santigrat derecede saklayın. Dondurulmuş ilgili blokları, eksi 20 santigrat dereceye ulaşmalarını sağlamak için yaklaşık 30 dakika kriyo mikrotom odasına yerleştirin. Sıcaklık blokları üç ila beş mikrometre kalınlığında bir bölümü kestiğinde ve ardından bölümün üzerine pozitif yüklü bir cam sürgü yerleştirdiğinde.

Dokuları 30 ila 60 dakika havayla kuruttuktan sonra doku slayta yapışacaktır. % 10 tamponlu formülle slaytları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca sabitleyin ve ardından slaytları aum ile dokuları boyamak için 250 mililitre tamponda 10 hızlı daldırma ile PB PBS'de üç kez yıkayın. Önce mavi, slaytları suda durulayın ve ardından üç dakika boyunca %3 asetik asit içinde inkübe edin.

Daha sonra dokuları AUM mavi solüsyonu ile inkübe edin 30 dakika sonra, slaytları akarak, musluk suyunda 10 dakika yıkayın ve ardından DI suyunda durulayın. Çekirdekleri beş dakika boyunca nükleer hızlı kırmızı ile boyayın ve ardından slaytları DI suyunda üç kez yıkayın. Şimdi% 95 etanolde bir dakika inkübe ederek, ardından% 100 etanolde üç hızlı değişiklik ve ardından% 100 etanolde üç değişiklik yaparak ve ardından narenciye çözeltisinde her biri iki dakika boyunca üç değişiklik yaparak slaytları kurutun ve temizleyin.

Son olarak, dokuları periyodik asit kayması ile boyamak için cyto seal 60 gibi bir rezonans ortamı ile slayt üzerine bir kapak kızağı monte edin. İlk olarak, slaytları suyla durulayın ve ardından taze hazırlanmış% 1 periyodik asitle beş dakika boyunca inkübe edin. Şimdi, slaytları di suda üç kez yıkayın.

Slaytları bir kez Milli Q suyuna batırın ve ardından dokuları shiff reaktifi ile boyayın. 15 dakika sonra, slaytları akarak yıkayın, 10 dakika daha musluk suyunda yıkayın ve ardından bir kez di suya batırın. Çekirdekleri 30 saniye boyunca sgio metin ile boyayın ve ardından slaytları DI suyunda üç kez yıkayın.

Son olarak, slaytları 30 saniye inkübe edin. Scot'un musluk suyunda mavileştirme reaktifi, DI suyunda üç kez daha yıkayın ve ardından dokuları kalsiyum mavisi lekelenmesi için gösterildiği gibi dehidre ettikten sonra. Lektinler kullanarak glikan epitoplarının floresan tespiti için slaytları bir kapak fişi ile monte edin.

İlk olarak, slaytı PBS'de BSA ile 10 ila 30 dakika boyunca engelleyin. Daha sonra, slaytı avadon ile 15 dakika inkübe ederek, ardından bir PBS yıkaması ve ardından başka bir PBS yıkamasından sonra% 0.01 biyotin ile 15 dakikalık bir inkübasyon yaparak endojen biyotini bloke edin. Slaytı bir boyama kutusuna yerleştirin, her doku bölümünün üzerine istenen lektinlerin yeni hazırlanmış bir karışımını yerleştirin ve ardından lektin karışımını parfümle nazikçe kaplayın.

Şimdi slaytı bir saat sonra karanlıkta kuluçkaya yatırın. Parfümü nazikçe çıkarın ve slaytı PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra slaydı konjuge SCI beşte strep avid ile kaplayın ve 30 dakika sonra bir kez daha karanlıkta inkübe edin, slaytları PBS ile üç kez yıkayın ve ardından çekirdekleri dappy ile boyayın.

Son olarak, sase enzim kontrolü için vektör montaj ortamı gibi sulu bir ortam kullanarak sürgüyü bir kapak kızağı ile monte edin. Nemli bir oda oluşturmak için boş bir uç kutusunun dibine su ekleyerek başlayın. Negatif kontrol slaytlarını yüzü yukarı bakacak şekilde bahşiş kutusunun üst tepsisine yerleştirin.

Doku bölümlerine 150 ila 200 mikrolitre US solüsyonu yerleştirin ve ardından hava kabarcığı oluşumunu önleyerek her slaytı bir kapak fişi ile örtün. Kutu kapağını kapatın ve kutuyu iki buçuk saat sonra 37 santigrat derecede inkübe edin. Serbest dilim asitlerini çıkarmak için slaytları oda sıcaklığında PBS'de üç kez yıkayın.

Daha sonra, rekabetçi inhibisyon için slaytları oda sıcaklığında bir saat boyunca SNA ile inkübe edin. Lektin karışımının 200 mikrolitresini iki einor şişesine kontrol edin. Daha sonra şişelerden birine 200 milimolar Jacqueline inhibitörü Meli bios ekleyin ve SWGA inhibitörü kitin hidrolizatını diğer şişeye bir ila 10 seyreltmede ekleyin.

Daha sonra slaytları, inhibitör içeren karışımlarla oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Bu ilk figür dokusunda, OCT içinde dondurulan veya parafin içine gömülen kimyon faresi veya tavuk kolon örneklerinin kesitleri, pembe veya mavi kalsiyum mavisi periyodik asit kokusu ile boyandı. Parafine gömülü doku örnekleri ile OCT Kriyoprotektan ortamına gömülü donmuş dokular arasında yapılan bir karşılaştırma, donmuş dokulardaki müsin glikoproteinleri için boyamanın korunması ve kalitesinde çarpıcı farklılıklar olduğunu ortaya koydu.

Goblet hücrelerindeki müsine ek olarak, salgılanan mukus da parafine gömülü dokulardaki oklarla gösterildiği gibi görülebiliyordu. Mukus boyaması kadeh hücreleri ile sınırlıydı. Bu şekilde, turunçgillerde inkübe edilen müsin ve dokuların önemli ölçüde kaybı gözlemlenebilir.

Dondurulmuş tavuk ileum örneklerinin seri kesitleri% 10 tamponlu formin içinde sabitlendi ve hidratlı tutuldu, her biri% 70% 90 ve% 100 etanolde 20 dakika boyunca sıralı inkübasyon ile etanol içinde kurutuldu veya etanol içinde kurutuldu ve daha sonra bir saat boyunca narenciye ile temizlendi. Tek başına etanol dehidrasyonu ve etanol dehidrasyonu artı turunçgillerin tümü, doku morfolojisini iyileştirdi. Daha fazla etanol dehidrasyonunun tek başına mavi lekelenme üzerinde önemli bir etkisi olmamıştır.

Buna karşılık, turunçgillerin tüm inkübasyonu, önceki şekilde görülen parafin gömülü dokular için gözlemlenene benzer bir modelde mavi lekelenmeyi azalttı ve kadeh hücrelerine hapsetti. Kutular, allium mavisi leke dokusu bölümlerinde daha yüksek büyütme alanlarını gösterir. Bu sonraki görüntü serisinde, OCT'de dondurulan veya parafine gömülen ve daha sonra mavi renkte Jacqueline, yeşil renkte SWG ve kırmızı renkte SNA ile incelenen tavuk ileum örnekleri donmuş dokularda gösterilmektedir.

Jacqueline'in olink glikanlarına bağlanması, OCT donmuş doku bölümündeki oklarla gösterildiği gibi, goblet hücrelerinden lümene sızıyor gibi görünen yapıları ortaya çıkardı. Buna karşılık, Jacqueline'in parafine gömülü dokulara bağlanması, kadeh hücrelerine ve bu oklarla gösterilen villus fırça sınırına sınırlıydı. Beta bir dört GL'nin SWGA boyaması, oklarla gösterildiği gibi hem donmuş hem de parafine gömülü dokularda Jacqueline lektinin bağlanması ile kısmen birlikte lokalize olur.

Buna karşılık, kırmızı renkli ve ok başlarıyla gösterilen SNA lektin, hücre içi olarak alfa iki altı bağlı sialik aside bağlanır ve mavi olan ve bu şekilde noktalı oklarla gösterilen Jacqueline ile birlikte lokalize olmaz. Slic asit epitopları, tavuk ileum örneklerinden doku kesiti US ile sindirilerek parçalandı veya burada görüldüğü gibi inkübasyon ve sodyum asetat tamponu ile parçalandı. US tedavisi, tedavi edilmeyen dokuda gözlenen biyotinile SNA ile boyanmayı ortadan kaldırdı ve SNA'nın sialik asitlere bağlanma özgüllüğünü doğruladı.

Lektin özgüllüğü, Jacqueline boyaması için mely bios veya SWGA boyaması için kitin hidrolizatı gibi rekabetçi bir inhibitör eklenerek de doğrulanabilir. Tavuk ileum örnekleri, bir kez daha, bir Jacqueline ve SWGA karışımı ile inkübe edildi. Bu sefer ayrıca spesifik lektin inhibitörleri, mely bios veya kitin hidrolizatının varlığında Jacqueline boyaması mely bios tarafından inhibe edildi, ancak kitin hidrolizatı tarafından inhibe edilmedi. Tersine, SWGA boyaması kitin hidrolizatı tarafından inhibe edildi, ancak mely bios tarafından inhibe edilmedi.

Bu son görüntü serisi, klinikte ve araştırma laboratuvarlarında rutin olarak elde edilen donmuş doku örneklerinin OCT'ye daha fazla gömülebileceğini ve müsin, glikoproteinler, glikolipidler ve glikanlar üzerindeki glikanları incelemek için kullanılabileceğini göstermektedir. Villöz karsinom ve mukus karsinomu dokularından elde edilen bu kolorektal kanser biyopsileri, OCT'ye gömülü sıvı nitrojen içinde donduruldu ve belirtilen çeşitli müsin ve glikan epitopları için başarılı bir şekilde boyandı. Bu videoyu izledikten sonra, dokuların OCT'ye nasıl yerleştirileceğini ve immünokimyasal yöntemler kullanılarak mukus ve doku glikozilasyonunun nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.