Konak Bitki uçucu için bir tarama aracı olarak Electroantennographic Biyoassay

Bu prosedürün genel amacı, çok sayıda konuk bitki uçucu maddesini potansiyel biyolojik aktivite açısından hızla taramaktır. Bu işlem, öncelikle ilgili konuk bitki uçucu maddelerinin toplanması ve GCMS ile analiz edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, kimyasal bileşenler tanımlanır ve doğrulanır.

Üçüncü adım, bireysel bileşenlerin biyolojik aktivitesini elektro grafik analiz yoluyla yeterli tekrarlarla taramaktır. Son adım ise aktif bileşenlerin karışımlarını formüle etmek ve değerlendirmektir. Nihayetinde elde edilen sonuçlar, ilgili böcek türü ile yapılacak davranışsal çalışmalarda daha ileri araştırmalara hazır, kısaltılmış bir bileşen serisi veya bileşen karışımı sağlayabilir.

Bu tekniğin, zaman alıcı davranışsal çalışmalar gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, elektro grafik analiz yoluyla yapılan hızlı taramanın, bir prosedürü kanıtlamak için diğer çalışmalara alınması gereken bileşik sayısını önemli ölçüde azaltmasıdır. MR Wage laboratuvarım için bir teknisyen mi? Gaz kromatografisi ve kütle spektrometrisi ile ilgili uçucu maddeler belirlendikten sonra, öncelikle mevcut her bir uçucu madde için elektro ikonografi analizi veya EAG yapılması mümkündür.

Bununla birlikte, mevcut uçucuların hazırlanması gerekir. Her bir uçucunun pentan içerisinde 5 mg/mL konsantrasyonda bir çözeltisini, sıkıca kapatılabilen bir kapta hazırlayın ve 4 °C'de saklayın. Ardından, stimülasyon pipetlerini hazırlayın.

Her uçucu madde için 10 adet geçmiş yıldız pipeti etiketleyin ve uçlarını küçük bir parafilm parçasıyla sarın. 10 pipet, düşük tekrarlı bir ön taramada uçucu maddeyi her iki cinsiyete de iletmek için yeterlidir. Şimdi, kalan beş pipetlik seti bir raf tutucuya dizin ve her pipetin açık ucuna bir biyolojik deney diski yerleştirin.

Bir diski cımbızla nazikçe katlayın ve diskin iki ila üç milimetresi dışarıda kalacak şekilde pipetin geniş ucuna kısmen yerleştirin. Bir pipetleyici veya şırınga kullanarak her diskin üzerine 10 µL uçucu çözelti yükleyin. Tutarlı tekrarlar sağlamak için çözeltilerin doğru şekilde hesaplanması, formüle edilmesi ve hazırlanması son derece önemlidir.

İki dakika bekleyin ve ardından diskleri pipetlerin içine tamamen itin. Yüklendikten sonra, her bir pipeti derhal param ile mühürleyin. Bu pipet hazırlama işlemini istenen tekrar sayısı kadar tekrarlayın.

Aynı protokolü kullanarak, sadece pentanlardan oluşan bir negatif kontrol ile bu örnekte asetofenon ve seks hormonu şeklinde pozitif kontroller hazırlayın. Şimdi böcek antenlerinin hazırlanmasına geçin.

Bu deneyde, bir ön amplifikatör, çatallı elektrottan EAG kayıt cihazına sinyal iletir. EAG cihazıyla birlikte sağlanan yazılım, yazılım içerisinde uygun şekilde yapılandırılmalıdır. Örnekleme hızını 106,7 olarak ayarlayarak ayarları yapılandırın.

Filtre sekmesi altında, rectify anahtarını "know" konumuna getirin ve filtreyi 0 ile 42 hertz arasına ayarlayın. EAG filtresini "on" konumuna getirin ve düşük kesme frekansını 0.1 hertz olarak ayarlayın. Ardından, ayarları ileride kullanmak üzere bir yapılandırma dosyasına kaydedin.

Programı çalıştırmak; yeni bir proje dosyası açmak, bunu belirli bir isim altında kaydetmek ve kayda başlamak kadar basittir. Kırmızı üçgen simgesi kayıt işlemini başlatır ve her bir tekil püfleme için önceden belirlenmiş bir süre boyunca açık kalır. Antenler için tüm püflemeler tamamlandığında, EAG yanıtlarının daha doğru okunmasını kolaylaştırmak için siyah X simgesi kaydı durdurur.

Sinyalin taban çizgisine bilgisayar ekranı üzerine küçük bir cetvel bantlanabilir. Yanıt milimetre cinsinden kaydedilir ve daha sonra mikrovolt cinsinden genliğe dönüştürülür. Gerekirse, kayıtlar daha ayrıntılı değerlendirme için yeniden oynatılabilir.

Bu örnekte, üç ila dört günlük naval portakal yaprağına yumurta bırakmış erkek ve çiftleşmiş dişi güveler kullanılmıştır. Ancak bu protokol diğer böceklere de uyarlanabilir. Her bir böceği küçük, kapaklı plastik bir kaba aktarın.

Analiz gününde, biyolojik analizden hemen önce, böceği, sadece başının sığabileceği kadar küçük bir açıklığı olan bir pipet ucunun geniş ağzına yerleştirin. Ardından daha küçük bir pipet ucu kullanarak, böceğin başı bir stereomikroskop altında görünene kadar onu dikkatlice küçük açıklığa doğru itin. Antenlerin tutma tüpü içinde sabitlendiğinden ve anten tabanlarının eksizyon için açık olduğundan emin olun.

Ardından, elektrot jeli ile kaplanmış çatallı tutucuyu antene çok yakın bir konuma getirin; mikro makas kullanarak her iki anteni serbest bırakıp kesin ve bu işlem ile ardından gelecek uyarılar arasındaki süreyi kaydetmek için bir zamanlayıcı başlatın. Ucunda bir miktar jel bulunan telli bir aletle bir anteni alın ve çatala yerleştirin. Antenin tabanının çataldaki kırmızı olmayan kayıtsız toprak elektroduna yerleştirildiğinden emin olun.

Aynı işlemi ikinci anten için de gerçekleştirin. Antenin tabanını çatalın aynı tarafına, anten konumlandırılmış haldeyken iki ila üç milimetre ara bırakarak yerleştirin. Anten uçlarını gerektiği gibi kırpın.

Elektrodu bir fırça yardımıyla jelle kaplayın ve jel içinde hava kabarcığı kalmadığından emin olmak için elektrotların taban ve uç kısımlarının elektrot jeline tamamen daldırıldığını kontrol edin. Uçucu maddelerin püskürtüldüğü alana maruz kalan anten yüzey alanını maksimize etmek için antenin orta kısmını jelle kaplamaktan kaçının. Hazırlık işlemi uygun şekilde jelleştirildikten sonra, çatalı prob ön yükselticisine bağlayın.

Şimdi, anten preparatının canlılığını korumak için preparat üzerine nemlendirilmiş hava akışı uygulayın. Eksizyon zamanından 10 dakika sonra, ilk stimülasyonların uygulanmasına geçin. Bir preparasyonu stimüle etme işlem sırası, araya ardışık olarak aynı bileşiğin gelmediği randomize bir bileşik dizisi ve en az bir negatif kontrol eklenerek, pozitif bir kontrol ile başlar ve yine pozitif bir kontrol ile sona erer; bir antene uygulanan bileşik sayısı türe göre değişiklik gösterir.

Bir naval orange worm moth preparatı 30 dakikadan fazla aktif kalabilir ve bu durum, düşük tekrar sayısıyla 10'a kadar uçucu maddenin kolayca analiz edilmesine olanak tanır. Aynı numune iletim prensibi, ön taramada yanıt verdiği tespit edilen harmanlanmış bileşiklerin sonraki taramaları için de geçerlidir. İlk stimülasyon pipeti, puff uygulanmadan 30 saniye önce hazırlanmalıdır; pipetin kapağını açın ve hava akışını, anten eksizyonundan 10 dakika sonra antenlerin iki ila üç milimetre uzağına yönlendirecek şekilde tutucuya yerleştirin.

İlk stimulus püfünü dakikada 300 mililitre hızla bir ila iki saniye boyunca uygulayın. Ardından, ilk stimulustan bir dakika sonra ikincisinin uygulanabilmesi için pipeti hızla değiştirin. Örnekler arasında tutarlılık sağlanması, gerçekte püfleme yoluyla iletilen uçucu madde miktarlarındaki değişkenliği en aza indirecektir.

Son pozitif kontrol püskürtmesi uygulandıktan sonra, anteni çıkarın ve çatalı temizleyin. Etanolle doyurulmuş bir mendille temizledikten sonra, bir sonraki kullanımdan önce tamamen kurumasını bekleyin. Analizlerin işlem hacmini artırmak için, bir asistan, önceki hazırlıklar bitmeden 10 dakika önce temiz çatallar ile bir sonraki anteni hazırlamalıdır.

Test dizisi için bu yöntemde birden fazla çatal gereklidir. Her deneyden sonra, test güvelerini kuru buz ortamında ötanize edin ve çiftleşme durumlarını kontrol etmek için dişi güveleri disseke edin. Birlikte konaklayan erkeklerin çiftleşmiş olduğunu varsayın; naval orange worm anten hazırlıkları iki saniyelik püskürtmelerle uyarılmış ve beş milivolt ölçeğinde on saniyelik bir pencere ile on saniyelik kayıtlar alınmıştır.

Tipik yanıt negatif bir sapmaydı. Yine de mutlak değerler kaydedildi. Pozitif kontrole zayıf yanıt veren tüm dişi preparatlar elendi.

Kalan preparatların ortalama yanıtı 2.600 mikrovoltdu. Benzer şekilde, erkeklerin cinsiyet pH kontrolüne verdiği ortalama yanıt tipik olarak 3000 mikrovolt seviyesindeydi. Bu nedenle, standart altı yanıt veren antenler elendi; ayrıca deney boyunca yanıtı azalan antenlerden elde edilen veriler de dışlandı.

Son pozitif kontrol pufuna verilen Anton yanıtı, ön kontrolün ilk pufunun %75'inden az olduğunda veya geri kalan deneysel çalışmalar için ön kontrolün ikinci pufundan az olduğunda degredasyon gerçekleşmiş sayıldı. Yanıt değerleri, her çalışmadan alınan ham ölçümlerin kullanılması ve o çalışmadaki her bir değerden aynı çalışmanın negatif kontrol yanıtının çıkarılması yoluyla analiz edildi. Ardından, her çalışmadaki tüm pozitif kontrollerin ortalaması alındı ve her çalışma için 1000 Microvolts'a düzeltme oranı kaydedilerek 1000 Microvolts'a düzeltildi.

Test edilen bileşiklerin değerleri daha sonra pozitif kontrol düzeltme oranı ile çarpılmıştır. Son olarak, her bir test edilen bileşiğin tüm denemeler boyunca ortalama düzeltilmiş yanıtı, her bir bileşiğin daha ileri araştırmalar için adaylığını değerlendirmek üzere karşılaştırılmıştır. Kimyasallarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve her zaman uygun önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.