Protein-Protein Etkileşimi Okumak Manyetik Boncuk Kullanarak Bir Sıvı Faz Affinity Yakalama Testi: Poliovirüs-Nanobody Örnek

Bu protokol, poliovirüs ve Poliovirüs arasındaki etkileşimi kullanır ve basit bir kantitatif sıvı faz afinite yakalama testini göstermek için nano cisimleri tanır. Temel olarak, kobalt kaplı manyetik boncuklar, etiketli proteinleri ve ayrıca etkileşimli radyo etiketli proteinleri aşağı çekmek için kullanılır. İlk olarak, etiketli ve etiketli proteinleri karıştırın ve oda sıcaklığında inkübe edin.

Daha sonra etiketi tanıyan manyetik boncuklar ekleyin, etiketli proteinin bağlı fraksiyonunu mıknatıslar kullanarak bağlanmamış fraksiyondan ayırın. Daha sonra, bağlanmamış fraksiyonda bulunan etiketli proteinin sinyalini ölçün ve bağlanmamış fraksiyonda bulunan etiketli protein miktarını belirleyin. Bu sıvı faz afinite testinden elde edilen sonuçlar, onaylayıcı dönüşüme duyarlı proteinler test edildiğinde son derece yararlıdır.

Bu sıvı faz afinite yakalama testi, poliovirüs arasındaki etkileşim, nano boies ve farklı poliovirüs antijenlerini tanıma hakkında bilgi sağlayabilir. Yöntem, bir proteinin etiketlenebilmesi ve diğerinin tespit edilebilmesi koşuluyla diğer protein protein etkileşimlerine de uygulanabilir. Bu yöntem için ilk olarak, poliovirüs, nano cisimleri tanıma ve farklı poliovirüs antijenleri arasındaki etkileşimi araştırmakla ilgilendiğimizde ID'ye sahiptik.

Poliovirüs, onaylayıcı dönüşüme duyarlı olduğundan, katı bir yüzeye bağlandığında, e LSA'nın kullanımı sınırlıdır. Bu nedenle sıvı faz tabanlı bir sistem tercih edilmelidir. Poliovirüs araştırmalarında sıklıkla kullanılan böyle bir sıvı faz tabanlı sistemin bir örneği mikro proteindir.

Bir immünopresipitasyon testi. Bu test uygulanabilirliği kanıtlanmış olsa da, nano cisimlerde bulunmayan geleneksel bir antikorun kristalize yapısını gerektirir. İlginç ve çok kararlı tek alanlı antikorlar olan bu nano cisimler, farklı metinlerle kolayca tasarlanabilir.

Yaygın olarak kullanılır. Yığın, nikel ve kobalt gibi iki değerlikli iyonlara afinite gösterir ve bunlar da manyetik boncuklar üzerinde kolayca kaplanabilir. Bu nedenle, kobalt kaplı manyetik boncuklara dayalı basit kantitatif afinite yakalama testini geliştirdik.

Reese, girdap yoluyla manyetik boncuk stoğudur ve her numune için 10 mikrolitreyi bir tüpe aktarır, bir mıknatıs kullanarak boncukları peletler. Boncukları yıkamak için şeffaf supinatı çıkarın. 150 mikrolitre bağlayıcı tampon ekleyin.

Boncukları bir mıknatıs kullanarak hasat edin ve ikinci bir yıkamadan sonra sırtı çıkarın. Her numunenin kontrol etmesi için boncukları 40 mikrolitre bağlayıcı tamponda yeniden askıya alın. Birinci numunedeki arka plan için, radyoaktif işaretli virüs içermeyen, ancak kontrol için eşit hacimde bağlayıcı tampon içeren bir kuyu hazırlayın.

%100 radyo aktivitesinin ikinci örneği. Nano gövdeyi bağlayıcı tampon ile değiştirmek dışında tüm bileşenleri bir kuyuya ekleyin. Şimdi, tüm numunelere toplam 80 mikrolitre bağlayıcı tampon hacminde S 35 etiketli yedi suş tipi bir S 35 sayımı ekleyin.

Kontrolü kabul edin. Örnek bir. Her numuneye 10 mikrolitre nano vücut seyreltmesi ekleyin.

Bir çalkalayıcı üzerinde 10 saniye karıştırın ve bir saatlik oda sıcaklığında inkübe edin. Daha sonra, yıkanmış manyetik boncuk süspansiyonundan 40 mikrolitre ekleyin ve sürekli çalkalama altında oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin, boncukları bir mıknatısla peletleyin ve her numunenin radyoaktivitesini ölçmek için temizlenmiş SUP natantını bir tüpe aktarın, 50 mikrolitre supinat bir sayma şişesine aktarın. Üç mililitre sintilasyon sıvısı karışımı ekleyin ve bu yalıtımı okuyun.

Kullanılmış manyetik boncukları su kullanarak bir tüpe karşı çekin ve iki dakika boyunca 500 kez G santrifüjleyin. Supinatı atın ve boncukları altı mililitre 0.5 molar sodyum hidroksit içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra süspansiyonu birden fazla tüpe ayırın ve beş dakika boyunca ultrasonik bir banyoda inkübe edin.

Boncukları bir mıknatısla peletledikten ve supinatı çıkardıktan sonra, her tüpe bir mililitre% 2 SDS çözeltisi ekleyin, ardından beş dakika boyunca girdap ve folyo ile karıştırın. Şimdi boncukları hasat edin. Her tüpe bir mililitre 0.2 molar EDTA pH yedi ekleyin ve tüpleri ultrasonik bir banyoda beş dakika inkübe edin.

Daha sonra boncukları toplayın, boncukları üç kez bir mililitre su ile yıkayın ve ardından bir mililitre 10 milimolar kobalt klorür çözeltisi ile yıkayın. Tüpleri 10 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Bir mıknatıs üzerindeki boncukları toplamaya devam edin ve bir mililitre bağlayıcı tamponda tekrar askıya alın.

Bir mililitre% 20 Etanolde iki kez yıkayın, son olarak mililitre başına 40 miligramlık bir konsantrasyonda rejenere boncuklar elde etmek için boncukları orijinal% 20 etanol hacminde yeniden süspanse edin. Kontrolü ayarlayarak arka plan radyoaktivitesini düzeltin. Birinci numuneyi %0 radyoaktivite değeri olarak ve kontrol numunesi iki %100 radyoaktivite değeri olarak verin.

Şimdi her numune için, radyo etiketli virüsün nano cisim tarafından genel çökelmesinin bir ölçüsü olarak sattaki radyoaktivite yüzdesini hesaplayın. Bu deney, poliovirüsün üç farklı antijeni, doğal antijen, ısıtılmış antijen ve 14 s alt birimlerini kullanarak PVSS 38 C ve poliovirüse özgü antikorun afinitesini değerlendirir. İlginç bir şekilde, radyo etiketli 14 s alt birimleri içeren numunelerin satındaki radyoaktivite, nano cisim PVSS 38 C'nin konsantrasyonlarındaki artışla azalır.

PVS S 38 C'nin poliovirüsün N antijenik ve H antijenik formu için herhangi bir afinitesi gözlenmediğinden, nano cisim, poliovirüsün 14 s alt birimi için spesifik görünmektedir. Bu yöntemle ölçülen nano cismin antijenlerine olan afinitesi, ilgisiz nano cisim olarak spesifiktir. NB bir, poliovirüsün üç antijenik formuna karşı reaktivite göstermez.

Bu sistem, farklı araştırmacılar tarafından farklı günlerde oluşturulan bu doz yanıt eğrisinde belirtildiği gibi yüksek tekrarlanabilirlik üretir. Bu güvenilir sıvı faza hakim olduktan sonra, afinite yakalama testi, dahil edilen atımların geri dönüşümü için iki saatlik bir şekilde gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, özellikle katı faz tabanlı sistemler kullanılamadığında, farklı proteinler arasındaki etkileşimi incelerken manyetik atımlara dayalı bu sıvı faz afinite yakalama testinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.