Name: Protein-Protein Etkileşimi Okumak Manyetik Boncuk Kullanarak Bir Sıvı Faz Affinity Yakalama Testi: Poliovirüs-Nanobody Örnek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Öğrenin, manyetik boncuk kullanarak sıvı faz afiniteli yakalama testi ile protein-protein etkileşimlerini nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, konformasyonel dönüşüme duyarlı proteinler için güvenilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar radyoaktif etiketli virüs hazırlanması için Farmasötik Biyoteknoloji ve Moleküler Biyoloji Bölümü ve özellikle Monique De Pelsmacker personeline teşekkür ederim. Biz Ellen Merckx ve onların ilginç açıklamalar ve tartışmalar için Hadewych Halewyck ve laboratuvarda yaptığı yardım Gerrit De Bleeser minnettarız. Bu çalışma, maddi Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N) ve Dünya Sağlık Örgütü (TSA 200.410.791) bir OZR hibe ile desteklenmiştir. Lise Schotte Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO) bir predoctoral üyesidir.

Prensibi (A) ve yöntemi genel bir (B) Şekil 1 içinde tasvir edilmiştir. 1. Tampon hazırlanması <ol><li> Erime sodyum dihidrojen fosfat (50 mM) ve su içinde sodyum klorür (300 mM) ile Yıkama / bağlanma tampon hazırlamak ve 8.0 pH ayarlanır. Buna ek olarak metiyonin (% 2 (m / v) son konsantrasyon) ve albumin Tween 20 (% 0.01 (m / v) son konsantrasyon), (0.1% (m / v) son konsantrasyon) ekleyin ve gerekli hacmi e ayarlanır. </li></ol> 2. Manyetik Boncuk hazırlanması Kılavuzuna göre manyetik boncuk hazırlayın. Kısaca: <ol><li> Bir girdap kullanarak manyetik boncuk süspansiyon hale getirin. </li><li> Transferi, her bir örnek için, bir tüp içine yeniden süspanse manyetik boncuklar (40 mg / ml) 10 ul. </li><li> Süpernatant netleşene kadar, bir mıknatıs kullanarak manyetik boncuk toplayın (+ / - 30 sn) ve supernatant dikkatlice çıkarın. </li><li> Yıkayınmanyetik boncuk iki kez: Yıkama / Bağlama tampon 150 ul içinde boncuklar tekrar süspansiyon. Manyetik boncuk süpernatant netleşene kadar bir mıknatıs kullanarak tüpün bir tarafına göç ve dikkatlice supernatant çıkarın. </li><li> Boncuklar (10 mg / ml) tekrar süspansiyon için, her bir örnek için, Yıkama / bağlanma tampon maddesi 40 ul kullanabilir. </li></ol> 3. Affinity Yakalama Testi Not: (kozmik) arka radyoaktivite (0% radyoaktivite) ölçmek için, herhangi bir radyoetiketli virüsü bir kontrol örneği 1 eklenir. Bunun yerine, aynı hacimde Binding / Yıkama tamponu ilave edilir. Not: 100% radyoaktivite, tüm bileşenler nanobody hariç eklenir için bir kontrol örneği 2 ile tanımlanır. Bunun yerine, aynı hacimde Binding / Yıkama tamponu ilave edilir. <ol><li> Bir 96-kuyucuklu mikrotitre plakası içine 80 ul kadar Yıkama / bağlanma tampon maddesi ile seyreltildi (β-radyasyon) poliovirus Sabin suşu tipi 1 9, 35 etiketli S 2000 cpm getirir. </li><li> Ekle 10 &amp; mu; kuyulara nanobody seyreltme l. </li><li> Bir çalkalayıcı kullanarak yaklaşık 10 saniye karıştırın. </li><li> Numuneler oda sıcaklığında 1 saat inkübe izin verin. </li><li> Yıkanmış manyetik boncuklar süspansiyonu, 40 ul ekleyin ve sürekli çalkalama altında, oda sıcaklığında 10 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Boncuk ve bir mıknatıs kullanarak süpernatant ayırın ve bir tüp içine temizlenmiş süpernatant aktarın. </li></ol> 4. Radyoaktivite ölçümü <ol><li> Bir sayma balona adım 3.6 den süpernatan 50 ul aktarın. </li><li> Sintilasyon sıvısı ve karışım 3 ml ilave edilir. Bir β-sintilasyon sayacında radyoaktivite ölçün. </li></ol> 5.. Boncuk Geri Dönüşüm <ol><li> 2 dakika boyunca 500 xg&#39;de veya açık bir süpernatant elde edilinceye kadar bir tüp ve santrifüj kullanılan manyetik boncuk toplayın. </li><li> Süpernatantı ve 6 ml 0.5 M NaOH içinde boncuklar tekrar süspansiyon. </li><li> Multipl için süspansiyon aktarıne tüpler ve 5 dakika boyunca bir ultrason banyosunda inkübe. </li><li> Manyetik boncuk toplamak ve süpernatant kaldırmak için mıknatıslar kullanın. </li><li> Her tüpe 1 ml% 2 SDS-çözüm ekleyin ve bir girdap kullanarak tekrar süspansiyon. 5 dakika boyunca kaynatın. </li><li> Boncuklar toplayın ve supernatant çıkarın. 1 ml 0.2 M EDTA (pH = 7) içerisinde yeniden süspanse boncuklar. </li><li> 5 dakika boyunca bir ultrason banyosunda tüpler ve bir kez daha inkübe, süpernatan kaldırın. </li><li> Her tüpe 1 mL su ekleyin ve boncuklar tekrar süspansiyon. Boncuklar toplayın ve supernatant çıkarın. Iki kez bu yıkama işlemi tekrarlayın. </li><li> Süpernatan kaldırmak ve 1 ml 10 mM CoCl 2 çözelti içinde yeniden süspanse boncuklar. 10 dakika bir çalkalayıcı koyun. </li><li> Boncuk toplamak ve Yıkama / Ciltleme tampon 1 ml tekrar süspansiyon için bir mıknatıs kullanarak süpernatantı. </li><li> Süpernatant kaldırmak ve boncuklar 20% 1 ml kullanılarak iki kere (v / v) etanol yıkayıp </li><li> % 20 kendi orijinal hacim (v / v) ve in boncuklar tekrar süspansiyon40 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyonda yeniden elde etmek için boncuklar hanol. </li></ol> 6. Sonuçların Yorumlanması <ol><li> Hiçbir radyoaktif virüs eklenmiş olan Kontrol numunesi 1, arka radyoaktivite düzeltmek için ve% 0 radyoaktivite değeri ayarlamak için kullanılır. Nanobody nerede ve dolayısıyla tüm radyoaktif virüs süpernatant kalır içermez Kontrol örnek 2,% 100 radyoaktivite değeri olarak ayarlanır. </li><li> Nanobody tarafından radyoaktif virüsün - süpernatan radyoaktivite yüzdesi (= a%) toplam yağış (a% = 100) bir ölçüsüdür. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Bu afinite yakalama testinin sonuçları temsili Şekiller 2, 3 ve 4 &#39;de gösterilmiştir. Şekil 2&#39;de, PVSS38C, poliovirus için bir nanobody spesifik afinite ile gösterilir. PVSS38C bir afinite poliov üç farklı antijenleri için test edildiirus: Yerli-antijen (N-antijen), Isıtmalı-antijen (H-antijen) ve 14S alt birimleri. N-antijen bulaşıcı intakt bir virüstür. Virüs ısıtılır (56 azından 20 dakika ° C) ya da viral RNA&#39;nın bir (kısmi) kaybı ve kapsid proteini VP4 ile sonuçlanan bir katı yüzey (yayınlanmamış sonuçlar), kapsid değişikliklerin konformasyon, ekli ve boş olduğunda capsids sonra H-antijen olarak adlandırılan edildiği oluşturulmaktadır. 14S alt birimleri montaj ara vardır. Bu antijenler, aşı sonrası 10 antikorların farklı setleri tarafından tanınan ve bu nedenle farklı epitopları ve antijenik sitelere sahip edilir. Şekildeki süpernatan bulunan radyoaktivite yüzdesi nanobody konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak temsil edilir. Bu radyoetiketli 14S ait birimlerini içeren örneklerin üstte yüzen madde içindeki radyoaktivite nanobody PVSS38C artan konsantrasyonları ile azalmaktadır olduğu görülebilir. Bu poliovirus 14S alt birimleri con miktarında bir artış olarak tercüme edilebilirnanobody PVSS38C ve dolaylı manyetik boncuk bağlanırsınız. Yakalama titresi (radyoaktif virüs% 50 yakalama nanobody gerekli of = konsantrasyon) grafiksel 0.099 nM olarak hesaplanabilir. N-antijenik ve poliovirus H-antijenik formu için PVSS38C No afinite görülmektedir. Bu verilere bakıldığında PVSS38C poliovirus diğer iki antijenik formları sadece 14S alt birim mevcut değildir ve bir epitopu ile etkileşim olduğunu yorumlanır. Süpernatan gelen radyoaktivite kaybı sadece antijenleri doğru nanobody spesifik afinite bağlı olduğunu göstermek için, aynı deney Ab1 ile gerçekleştirildi, Sulfolobus sulfataricus arasında lrpB transkripsiyon faktörü karşı oluşturulan ve bilinen bir nanobody bir etkileşim ile sahip Herhangi bir poliovirus antijen. Bu değerlendirmenin sonucu, Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Bütün radyoetiketli virüsünün herhangi reaktivitesi olduğunu gösteren süpernatanlar kalırPoliovirus üç antijenik türlerine karşı Ab1. Sonuçların tekrarlanabilirliği farklı günde bir verilen nanobody (yani, PVSP29F) sekiz defa olmak üzere toplam deneyi tekrarlayarak ve farklı kişiler tarafından test edildi. Sonuçlar Şekil 4 &#39;de gösterilmiştir. Süpernatant yüzde radyoaktivitenin ortalama değeri her nanobody konsantrasyonu için hesaplandı ve standart sapma ile yazışmalarda temsil edilmektedir. <img alt="Şekil 1.." src="/files/ftp_upload/3937/3937fig1.jpg" /> Şekil 1.. Assay of prensibi (A) bir özetini ve (b) yöntemi. A. özellikle belli bir poliovirus antijen kobalt kaplı manyetik bilye ile etkileşim ve radyoaktif işaretli virüs çöktürmek olacaktır mümkün olacak tanımak nanobodies Onun etiketli. B. His-etiketli nanobodies radyoaktif olarak etiketlenmiş poliovirus eklenir ve inkübe edilir. Kobalt-kaplı manyetik bilye vardıreklenmiş ve ilişkili / ilişkisiz antijen manyetik ayırma gerçekleştirilir. Üstte kalan radyoaktivite ölçülür ve ele antijen miktarda elde edilebilir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig2.jpg" /> Şekil 2. Nanobody PVSS38C farklı poliovirus antijenlerin Manyetik boncuk afinitesi yakalama. Süpernatan bulunan radyoaktivite yüzdesi PVSS38C konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak temsil edilir. 14S için bir konsantrasyon-yanıt ilişkisi 14S münhasıran mevcut bir epitopu ile PVSS38C etkileşimi gösteren bulunabilir. Ile belirgin bir etkileşim N-, ne de bir non-spesifik çok yüksek konsantrasyonlarda yakalama ihmal edilebilir bir fark edilmiş olmasına rağmen H-antijen, tespit edilebilir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig3.jpg" /> Şekil 3. Nanobody Ab1 farklı poliovirus antijenlerin Manyetik boncuk afinitesi yakalama </strong&gt;. Süpernatan bulunan radyoaktivite yüzdesi Ab1 konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak temsil edilir. Ab1 herhangi poliovirus-antijen ya-alt birimi olan bir etkileşim olduğu bilinmektedir. Radyoaktivitenin% 100 süpernatant bulunan bu yana, hiçbir virüs non-spesifik Ab1 bağlı idi. Şekil 2&#39;de radyoaktivite kaybı dolayısıyla antijenleri doğru nanobody spesifik afinite sadece kaynaklanmaktadır. <img alt="Şekil 4." src="/files/ftp_upload/3937/3937fig4.jpg" /> Şekil 4. Testin tekrarlanabilirliği. Üstte yüzen madde içindeki yüzdesi radyoaktivite ortalama değeri nanobody konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak temsil edilir. Deney, farklı gün ve farklı kişiler tarafından sekiz kez tekrar edildi. Standart sapma dikey çubuklar olarak temsil edilir.

<ol><li>Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antiviral+activity+of+single+domain+antibody+fragments+against+poliovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus.</a> Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).</li>
<li>Meloen, R. H., Briaire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+cross-reacting+antigens+on+the+intact+foot-and-mouth+disease+virus+and+its+12S+subunits+with+antisera+against+the+structural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins.</a> J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).</li>
<li>Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+quantitative+protein+A+micro-immunoprecipitation+method%3A+assay+of+antibodies+to+the+N+and+H+antigens+of+poliovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus.</a> J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).</li>
<li>Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+competition+immunoprecipitation+assay+of+unlabeled+poliovirus+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens.</a> J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).</li>
<li>Kessler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+antigens+from+cells+with+a+staphylococcal+protein+A-antibody+adsorbent%3A+parameters+of+the+interaction+of+antibody-antigen+complexes+with+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A.</a> J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).</li>
<li>Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. ajyana, Bendahman, E., N,, Hamers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li>
<li>Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+identification+of+single+domain+antibody+fragments+from+camel+heavy-chain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies.</a> FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).</li>
<li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+domain+camel+antibodies%3A+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single domain camel antibodies: current status.</a> Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).</li>
<li>Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+evolution+in+poliovirus+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">Epitope evolution in poliovirus maturation.</a> Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).</li>
<li>Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridoma+antibodies+to+poliovirus+N+and+H+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen.</a> Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).</li>
<li>Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+quantitative+affinity+capturing+assay+of+poliovirus+antigens+and+subviral+particles+by+single-domain+antibodies+using+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads.</a> J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).</li>
<li>Wild, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWild%2C+D+%22The+Immunoassay+Handbook%22">The Immunoassay Handbook</a>. , Third edition, Elsevier. (2005).</li>
<li>Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+labeling+of+human+rhinovirus+capsid+and+analysis+by+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis.</a> Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).</li>
<li>Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolar+endocytosis+of+simian+virus+40+reveals+a+new+two-step+vesicular-transport+pathway+to+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER.</a> Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Protokolde, nanobody ile etkileşen antijen radyoaktivite süpernatan gelen radyoetiketli virüsünün kaybı olarak tanımlanmaktadır. Bu nedenle çöken radyoaktivite (= 100 -%) miktarı (manyetik boncuk bağlı) supernatant (= bir%) olarak radyoaktivite tarafından dolaylı bir şekilde tahmin edilebilir. Diğer taraftan, 500 mM imidazol ile manyetik boncuklar immün elüt tarafından doğrudan bir şekilde antijen çöktürülmüş bağlı fraksiyonun radyoaktivite ölçmek için de mümkündür. Bu, daha önce radyoaktivite miktarı ve süpernatan ve p...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strongReaktifin&gt; Adı</strong</td&gt;<td<strong&gt; Şirket</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog numarası</strong</td&gt;<td<strong&gt; Yorumlar</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dynabeads His-Tag İzolasyon ve Pulldown</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 101.03D</td&gt;<td&gt; Manyetik boncuk</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Optiphase &#39;HiSafe&#39; 2</td&gt;<td&gt; Perkin Elmer</td&gt;<td&gt; 1200 - 436</td&gt;<td&gt; Sintilasyon sıvısı</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

protein-protein etkileşimi okumak manyetik boncuk kullanarak bir sıvı faz affinity yakalama testi: poliovirüs-nanobody Örnek

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Bu makalede, basit, kantitatif, sıvı faz afinitesi yakalama deneyi sunulmuştur. Bir proteinin etiketlenmiş edilebilir olması şartıyla ve başka protein etiketli, bu yöntem, protein-protein etkileşimlerinin araştırılması için de uygulanabilir. Bu, kobalt kaplı manyetik boncuklar ile etiketlenmiş protein tanınması ile etiketlenmiş protein ve etiketlenmiştir ikinci bir özel protein arasındaki etkileşimi, diğer yandan, bir taraftan dayanır. İlk olarak, etiketlenmiş ve etiketlenmiş proteinleri karıştırılır ve oda sıcaklığında inkübe edilir. Etiketi kabul manyetik boncuk, eklenir ve etiketli protein bağlı fraksiyonu mıknatıslar kullanılarak ilişkisiz fraksiyon ayrılır. Yakalanır etiketli protein miktarı, ilişkisiz fraksiyonu içinde kaldı etiketli protein sinyali ölçülmesi ile dolaylı bir şekilde belirlenebilir. Yapısal dönüşüm duyarlı proteinler eşek olduğunuzda açıklanan sıvı faz afinitesi tayini son derece yararlıayed. Assay of gelişimi ve uygulama poliovirus ve nanobodies 1 tanıyan poliovirus arasındaki etkileşim için gösterilmiştir. Poliovirus katı bir yüzey (yayınlanmamış sonuçlar) eklenmiş konformasyonel dönüşüm 2 karşı hassas olduğu için, ELISA kullanımı sınırlıdır ve bir sıvı faz bazlı sistemi nedenle tercih edilmelidir. Genellikle polioresearch 3,4 kullanılan bir sıvı fazda tabanlı bir sistemin bir örneğini mikro protein A-immünopresipitasyon testi 5 &#39;dir. Bu test uygulanabilirliğini kanıtlamış olsa da, 6,7 nanobodies bulunmaz bir Fc-yapısı gerektirir. Ancak, başka bir fırsat olarak, bu ilginç ve istikrarlı tek alan antikorlar 8 kolayca farklı etiketler ile tasarlanmış olabilir. Yaygın (O&#39;nun) 6-etiketi gibi onların dönüşünü kolaylıkla manyetik boncuk kaplı edilebilir nikel ve kobalt gibi iki değerlikli iyon afinite gösterir kullanılır. Bu nedenle, bu basit kantitatif geliştirdiafinite yakalama testi kobalt kaplı manyetik bilye dayalı. Poliovirüs nanobodies ile engellenmeden etkileşimi etkinleştirebilirsiniz ve nicel bir saptama yapılabilir kılmak için 35 S etiketli edildi. Metodu gerçekleştirmek için kolaydır ve daha etkili bir şekilde yenileyici manyetik boncuklar olasılığını tarafından desteklenen bir düşük maliyet ile tespit edilebilir.

Bu makalede, basit, kantitatif, sıvı faz afinitesi yakalama deneyi sunulmuştur. Bu bir yandan, diğer tarafta etiketli protein ve ikinci, etiketli protein (örn. poliovirus) arasındaki yakınlığı manyetik boncuk ve etiketli proteinlerin (örneğin nanobodies) arasındaki etkileşime dayanan güvenilir bir tekniktir.

Protein-Protein Etkileşimi Okumak Manyetik Boncuk Kullanarak Bir Sıvı Faz Affinity Yakalama Testi: Poliovirüs-Nanobody Örnek

Bu makalede, basit, kantitatif bir sıvı faz afinite yakalama testi sunulmaktadır. Bir proteinin etiketlenebildiği ve başka bir proteinin...

Bu protokol, basit bir kantitatif sıvı faz afinite yakalama analizini göstermek için poliovirus ile Poliovirus tanıyan nanobodylerin etkileşimini kullanmaktadır. Temel olarak, etiketli proteinlerin yanı sıra etkileşime giren radyoaktif işaretli proteinleri çöktürmek için kobalt kaplı manyetik boncuklar kullanılır. İlk olarak, işaretli ve etiketli proteinleri karıştırın ve oda sıcaklığında inkübe edin.Ardından, etiketi tanıyan manyetik boncuklar ekleyin ve mıknatısları kullanarak etiketli proteinin bağlanan fraksiyonunu bağlanmayan fraksiyondan ayırın. Sonrasında, bağlanmayan fraksiyonda bulunan etiketli proteinin sinyalini ölçün ve bağlanmayan fraksiyonda bulunan etiketli protein miktarını belirleyin. Bu sıvı faz afinite analizinden elde edilen sonuçlar, konformasyonel dönüşüme duyarlı proteinler analiz edildiğinde son derece faydalıdır.Bu sıvı faz afinite yakalama deneyi, poliovirüsü tanıyan nanobody'ler ile farklı poliovirüs antijenleri arasındaki etkileşime dair bilgi sağlayabilir. Yöntem, proteinlerden birinin işaretlenebildiği ve diğerinin tespit edilebildiği diğer protein-protein etkileşimlerine de uygulanabilir. Bu yönteme dair ilk fikir, poliovirüsü tanıyan nanobody'ler ile farklı poliovirüs antijenleri arasındaki etkileşimi incelemek istediğimizde ortaya çıkmıştır.Poliovirüs konformasyonel değişime duyarlı olduğu için, katı bir yüzeye bağlandığında e LSA kullanımı sınırlıdır. Bu nedenle sıvı faz tabanlı bir sistem tercih edilmelidir. Poliovirüs araştırmalarında sıkça kullanılan böyle bir sıvı faz tabanlı sisteme örnek olarak mikro protein gösterilebilir.Bir immünopresipitasyon deneyi. Bu testin uygulanabilirliği kanıtlanmış olsa da, nanobodilarda bulunmayan konvansiyonel bir antikorun kristalize yapısını gerektirmektedir. İlgi çekici ve oldukça kararlı tek alan antikorları olan bu nanobodiler, farklı metinlerle kolayca mühendisleği yapılabilmektedir.Yaygın olarak kullanılan His etiketi, nikel ve kobalt gibi bivalent iyonlara afinite gösterir; bu iyonlar ise sırasıyla manyetik boncuklara kolayca kaplanabilir. Bu nedenle, kobalt kaplı manyetik boncuklara dayalı basit bir kantitatif afinite yakalama testi geliştirdik.Manyetik boncuk stokunu vorteksle karıştırın ve her örnek için 10 µL'yi bir tüpe aktarıp boncukları bir mıknatıs kullanarak çöktürün. Boncukları yıkamak için şeffaf süpernatantı uzaklaştırın. 150 µL bağlama tamponu ekleyin.Boncukları bir mıknatıs kullanarak toplayın ve ikinci yıkamadan sonra süpernatantı uzaklaştırın. Her bir kontrol örneği için boncukları 40 µL bağlanma tamponunda yeniden süspanse edin. Birinci örnekteki arka plan için, radyoligandlı virüs içermeyen ancak kontrol için eşit hacimde bağlanma tamponu içeren bir kuyucuk hazırlayın.%100 radyoaktiviteye sahip iki örnek alın. Nanobody yerine bağlama tamponu koymak dışında, tüm bileşenleri bir kuyucuğa ekleyin. Şimdi, toplam 80 µL bağlama tamponu hacmi içinde, tüm örneklere dakika başına 2000 sayım S 35 işaretli poliovirüs yedi suşu tip bir ekleyin.Kontrolü kabul edin. Birinci örnek. Her örneğe 10 µL nanobody dilüsyonu ekleyin.Bir çalkalayıcı üzerinde 10 saniye boyunca iyice karıştırın ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Ardından, 40 µL yıkanmış manyetik boncuk süspansiyonu ekleyin ve sürekli çalkalama altında oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin, boncukları bir mıknatısla çöktürün ve her örneğin radyoaktivitesini ölçmek için temizlenmiş süpernatantı bir tüpe aktarın, süpernatanttan 50 µL'yi bir sayım şişesine aktarın. Üç mL sintilasyon sıvısı karışımı ekleyin ve bu sintilasyon cihazında okuma yapın.Kullanılan manyetik boncukları bir tüp içinde su kullanarak karşı akımla çekin ve iki dakika boyunca 500 ×g'de santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve boncukları altı mililitre 0,5 molar sodyum hidroksitte yeniden süspanse edin. Ardından süspansiyonu birden fazla tüpe paylaştırın ve beş dakika boyunca ultrasonik banyoda inkübe edin.Boncuklar bir mıknatıstla çöktürüldükten ve süpernatan uzaklaştırıldıktan sonra, her tüpe bir mililitre %2 SDS çözeltisi ekleyin, ardından vortex ve folyo kullanarak beş dakika boyunca karıştırın. Şimdi boncukları toplayın. Her tüpe bir mililitre 0,2 molar pH yedi EDTA ekleyin ve tüpleri beş dakika boyunca ultrasonik banyoda inkübe edin.Ardından boncukları toplayın, boncukları üç kez bir mililitre su ile, ardından bir mililitre 10 milimolar kobalt klorür çözeltisi ile yıkayın. Tüpleri 10 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin. Boncukları bir mıknatıs yardımıyla hasat edin ve bir mililitre bağlanma tamponunda yeniden süspanse edin.Bir mililitre %20 etanol ile iki kez yıkayın ve son olarak boncukları, mililitre başına 40 miligram konsantrasyonda rejenerasyon sağlanmış boncuklar elde etmek için orijinal %20 etanol hacminde tekrar süspande edin. Kontrol örneği birini %0 radyoaktivite değeri ve kontrol örneği ikisini %100 radyoaktivite değeri olarak ayarlayarak arka plan radyoaktivitesini düzeltin.Şimdi her bir örnek için, nanovücut tarafından radyo işaretli virüsün genel çöktürülmesinin bir ölçüsü olarak, süpernatanttaki radyoaktivite yüzdesini hesaplayın. Bu deney, poliovirüse özgü PVSS 38 C ve antikorun afinitesini; poliovirüsün doğal antijen, ısıtılmış antijen ve 14 s alt birimleri olmak üzere üç farklı antijeni kullanarak değerlendirir. İlginç bir şekilde, radyo işaretli 14 s alt birimleri içeren örneklerin süpernatantındaki radyoaktivite, PVSS 38 C nanovücut konsantrasyonlarının artışıyla birlikte azalmaktadır. Bu durum, PVSS 38 C nanovücuduna ve dolaylı olarak manyetik boncuklara bağlanan Poliovirüs 14 s alt birimi miktarındaki artışı göstermektedir.pvs S 38 C'nin poliovirusün N antijenik ve H antijenik formlarına karşı herhangi bir afinitesi gözlemlenmediğinden, nanobody'nin poliovirusün 14 s alt birimine özgü olduğu görülmektedir. Bu yöntemle ölçülen nanobody'nin antijenlerine karşı afinitesi, ilişkisiz nanobody ile karşılaştırıldığında özgündür. NB one, poliovirusün üç antijenik formuna karşı herhangi bir reaktivite göstermemektedir.Farklı araştırmacılar tarafından farklı günlerde oluşturulan bu doz-yanıt eğrisinde belirtildiği üzere, bu sistem yüksek tekrarlanabilirlik sağlar. Uzmanlaşıldığında, bu güvenilir sıvı fazlı afinite yakalama analizi, kullanılan boncukların geri kazanımı dahil olmak üzere iki saat içinde uygun şekilde gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, özellikle katı faz temelli sistemlerin kullanılamadığı durumlarda, farklı proteinler arasındaki etkileşimleri incelerken manyetik boncuklara dayalı bu sıvı fazlı afinite yakalama analizinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.

a-liquid-phase-affinity-capture-assay-using-magnetic-beads-to-study

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Hücre geçirgen çapraz bağlayıcı DSP [dithiobis-(succinimidyl propiyonat)] stabilize geçici ve labil...

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

MACS ve Annexin V-konjuge manyetik boncuk ve hedef lipid ve Annexin V-bağlayıcı fosfatidilserin sentezlenen lipid veziküller hedef lipid protein etkileşim test etmek için. Ortak hedef lipid bağlı Proteinler saflaştırılmış ve boncuk elüsyon sonra analiz edilir.

Manyetik Aktif Hücre Ayırma (LIMACS) kullanarak Lipid veziküllü aracılı Afinite Kromatografisi: Protein-lipit Etkileşim Analiz Roman Yöntemi

Poliovirus (PV) virüs alıcı molekül kullanan son zamanlarda geliştirilen bir roman partikül aglütinasyon (PA) tahlil hızlı ve kolay bir kimlik izin verdi. Bu makalede, biz PA PV kimlik tayini için prosedür gösterecektir.

Poliovirüs Kimlik Parçacık Aglütinasyon Yöntemi

Tandem afinite saflaştırma proteinlerine bağlanma ortaklarının belirlenmesi için sağlam bir yaklaşımdır. Kavramı kanıtı olarak, bu metodoloji konak hücre faktörü için inisiyasyon dahil eş-tortu ile iyi karakterize çevirisi başlatma faktörü eIF4E uygulanmıştır. Bu yöntem, kolaylıkla bir hücre ya da viral proteini için uyarlanmıştır.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

Bu videoda, bir numuneden antijen gösteren virüs benzeri parçacıkları veya VLP'leri izole etmek için VLP yakalama testi adı verilen bir immünopresipitasyon testi gösteriyoruz. Antijen, manyetik boncuklara bağlı spesifik antikorlarla bağlanır ve daha sonra ayrılan ve daha fazla analiz için saklanan hareketsizleştirilmiş bir antijen-antikor kompleksi oluşturur.

Virüs Benzeri Parçacıklar Yakalama Testi: Nötralize Edici Antikor Konjuge Manyetik Boncuklar Kullanarak Antijen Gösteren VLP'leri Bir Numuneden İzole Etme Yöntemi

Burada, bir kriyojenik sıcaklıkta katı hal öğütme ile memeli hücrelerin bozulması Elde edilen hücre tozu, bir hücre, ekstrenin üretilmesi ve antikor-bağlı mikron çaplı paramanyetik taneler üzerine afinite yakalama ile ilgili protein kompleksleri izole etmek için protokoller tarif eder.

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Virüsler veya hücre dışı veziküller, yüzey antijenlerini tanıyan antikorlara bağlı 15 nm manyetik nanopartiküller ile immüno-yakalandı. Yakalanan virionlar veya veziküller, diğer yüzey antijenlerine karşı floresan antikorlarla etiketlendi. Elde edilen kompleksler yüksek manyetik alanda ayrıldı ve floresan üzerinde tetiklenen geleneksel akış sitometreleri ile analiz edildi.

Virionlar antijenik Spectra ve ekstrasellüler veziküllerin Analiz Virometry Akış

Protein-protein etkileşimleri bir hücrenin hem çekirdeğinde hem de sitoplazmasında meydana gelebilir. Bu etkileşimleri araştırmak için geleneksel ko-immünopresipitasyon ve modern yakınlık ligasyon testi uygulanır. Bu çalışmada, NF90-RBM3 etkileşimlerinin çekirdek ve sitoplazmadaki dağılımını görselleştirmek için bu iki yöntemi karşılaştırıyoruz.

Co-immunoprecipitation tarafından Nükleer ve Sitoplazmik Kesirler Protein-protein Etkileşim görselleştirme ve<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi

Burada, antijen gösteren virüs benzeri parçacıklar (VLP'ler) üzerindeki nötralizasyon epitoplarını tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. İnsan immün yetmezlik virüsünün (HIV) türevli VLP'lerin immün özürlülüğü, protein G-konjuge manyetik boncuklarla birleştirilmiş zarf glikoproteinlere özgü monoklonal antikorlar kullanılarak gerçekleştirilir. Yakalanan VLP'ler daha sonra viral çekirdek protein Gag spesifik antikorlar kullanan SDS-PAGE ve Batı blot analizine tabi tutulur.

Virüs Benzeri Parçacık (VLP) Tabanlı Aşılarda Bir Yakalama Tahlili Kullanılarak Görüntülenen Antijenlerde Nötralizasyona Duyarlı Epitopların Tespiti

Burada, anjiyotensin dönüştürücü enzim-2'ye bağlı manyetik mikroküreler tarafından yakalanan sağlam şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) viral partikülleri üzerinde iki benzersiz spike protein epitopunu aynı anda tespit etmek için çift raportörlü bir akış sitometrik sistemi kullanan yeni geliştirilmiş bir multipleks floresan immünolojik testi açıklıyoruz.

Viral Partiküller Üzerindeki Yüzey Protein Epitoplarının Multipleks Çift Raportör Stratejisi ile Profillenmesi

Öğrenin, manyetik boncuk kullanarak sıvı faz afiniteli yakalama testi ile protein-protein etkileşimlerini nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, konformasyonel dönüşüme duyarlı proteinler için güvenilir sonuçlar sağlar.

Protein-Protein Etkileşimi Okumak Manyetik Boncuk Kullanarak Bir Sıvı Faz Affinity Yakalama Testi: Poliovirüs-Nanobody Örnek

Daha fazla video keşfet