Name: SPLINTER kullanarak Pooled Sıralama gelen Nadir Genomik Variantların Algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: Öğrenin SPLINTER algoritması kullanarak havuzlanmış DNA dizileme verilerinde nadir genomik varyantları tespit etmeyi. Bu hesaplamalı yöntem, büyük popülasyonlarda kanserle ilişkili genlerdeki varyasyonları doğru şekilde belirlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Çocuk Discovery Enstitüsü hibe MC-II-2006-1 (RDM ve TED), NIH Epigenetik Yol Haritası hibe [1R01DA025744-01 ve 3R01DA025744-02S1] (RDM ve FLMV), U01AG023746 (SC), Saigh tarafından desteklenmiştir Vakfı (FLMV ve TED), 1K08CA140720-01A1 ve Alex&#39;in Limonata &quot;A&quot; Ödülü desteği (TED) durun. Biz genomik analizi ile yardım için Washington Üniversitesi Tıp Okulu&#39;nda Genetik Bölümü Genom Teknoloji Erişim Merkezi teşekkür ederim. Merkezi kısmen Araştırma Kaynakları için NationalCenter (NCRR), Sağlık (NIH), Ulusal Sağlık Enstitüleri bir bileşeni # UL1RR024992 NCI Kanser Merkezi Destek Hibe Siteman Kanser Merkezi&#39;ne # P30 CA91842 tarafından ICTS / CTSA hibe ile desteklenen ve bir Tıbbi Araştırma NIH Yol Haritası. Bu yayın sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka NCRR veya NIH resmi görüşü temsil etmez.

<ol><li>Vallania, F. L. M., Druley, T. E., Ramos, E., Wang, J., Borecki, I., Province, M., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+discovery+of+rare+insertions+and+deletions+in+large+cohorts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">High-throughput discovery of rare insertions and deletions in large cohorts.</a> Genome Research. 20, 1391-1397 (2010).</li>
<li>Shendure, J., Mitra, R., Varma, C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+Sequencing+Technologies%3A+Methods+and+Goals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Advanced Sequencing Technologies: Methods and Goals.</a> Nature Reviews of Genetics. 5, 335-344 (2004).</li>
<li>The 1000 Genomes Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+human+genome+variation+from+population-scale+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of human genome variation from population-scale sequencing.</a> Nature. 467, 1061-1073 (2010).</li>
<li>Manolio, T. A., Collins, F. S., Cox, N. J., Goldstein, D. B., Hindorff, L. A., Hunter, D. J., McCarthy, M. I., Ramos, E. M., Cardon, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+missing+heritability+of+complex+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Finding the missing heritability of complex diseases.</a> Nature. 461, 747-753 (2009).</li>
<li>Reich, D. E., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+allelic+spectrum+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">On the allelic spectrum of human disease.</a> Trends Genet. 17, 502-510 (2001).</li>
<li>Cohen, J. C., Kiss, R. S., Pertsemlidis, A., Marcel, Y. L., McPherson, R., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+rare+alleles+contribute+to+low+plasma+levels+of+HDL+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiple rare alleles contribute to low plasma levels of HDL cholesterol.</a> Science. 305, 869-872 (2004).</li>
<li>Ji, W., Foo, J. N., O'Roak, B. J., Zhao, H., Larson, M. G., Simon, D. B., Newton-Cheh, C., State, M. W., Levy, D., Lifton, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+independent+mutations+in+renal+salt+handling+genes+contribute+to+blood+pressure+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Rare independent mutations in renal salt handling genes contribute to blood pressure variation.</a> Nat. Genet. 40, 592-599 (2008).</li>
<li>Ahituv, N., Kavaslar, N., Schackwitz, W., Ustaszewska, A., Martin, J., Hebert, S., Doelle, H., Ersoy, B., Kryukov, G., Schmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+sequencing+at+the+extremes+of+human+body+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Medical sequencing at the extremes of human body mass.</a> Am. J. Hum. Genet. 80, 779-791 (2007).</li>
<li>Druley, T. E., Vallania, F. L., Wegner, D. J., Varley, K. E., Knowles, O. L., Bonds, J. A., Robison, S. W., Doniger, S. W., Hamvas, A., Cole, F. S., Fay, J. C., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+rare+allelic+variants+from+pooled+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantification of rare allelic variants from pooled genomic DNA.</a> Nat. Methods. 6, 263-265 (2009).</li>
<li>Mitra, R. D., Butty, V., Shendure, J., Housman, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Genotyping+and+Haplotyping+with+Polymerase+Colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Digital Genotyping and Haplotyping with Polymerase Colonies.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 5926-5931 (2003).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Insidans ve sık, karmaşık fenotipleri ve obezite 8, hiperkolesterolemi 4, hipertansiyon 7 ve diğerleri gibi hastalıkların tedavi yanıtı nadir varyasyon kişisel profillerini moderatörlüğünü olabileceğini kanıtlar artmaktadır. Etkilenen popülasyonlarda agrega bu varyantların derin tanısal ve tedavi edici etkileri olacaktır genlerin ve yolların belirlenmesi, ancak ayrı olarak etkilenen bireylerin analiz zaman olabilir ve yasaklayıcı mal olabilir. Nüfus tabanlı analiz birden fazla odakta genetik çeşitliliği araştırmak için daha verimli bir yöntem sunar. Biz popülasyonlar arasında genetik varyasyon bu tip tanımlamak için tasarlanan SPLINTER&#39;da yazılım paketi ile eşleştirilmiş bir roman havuza-DNA dizi protokolü sunarız. We were nadir görülen varyantları da dahil olmak üzere, 947 kişilik geniş bir havuza nüfus içinde küçük allelleri tanımlanması ve miktarının bu yöntemin doğruluğunu göstermekbirleştirilmiş sıralama gelen de novo olarak adlandırılan ve bireysel pyrosequencing tarafından onaylanmıştır. Bizim strateji esas olarak bir pozitif kuruluş ve her deneme içinde bir negatif kontrol ile diğer protokoller farklıdır. Bu SPLINTER diğer yaklaşımlar 1 kıyasla çok daha yüksek doğruluk ve güç elde etmek için izin verir. Alel başına 25-kat arasında optimum kapsama havuz boyutu sadece ölçeklerde doğrusal olarak bu gerekliliği gibi büyük havuzlarının analizi olanaklı hale, bağımsız olarak havuz boyutu ile sabitlenir. Bizim yaklaşımımız çok esnek ve menfaat fenotipi değil, aynı zamanda karışık hücre popülasyonları ve tümör biyopsisi doğal olarak heterojen örnekleri, uygulanabilir. Böyle exome veya genom gibi büyük bir hedef bölgelerden toplanan sıralama içinde giderek artan ilgi dikkate alındığında, kütüphane hazırlık ve SPLINTER&#39;da analizi özel yakalama ve tam exome sıralama ile uyumludur, ancak SPLINTER&#39;da paketinde uyum programı için tasarlanmış değildi büyükreferanslar dizileri. Bu nedenle, başarılı bir şekilde birleştirilmiş örnek (Ramos ve ark., Incelemede) çağırıyor varyantı takip genom diziler için, Novoalign, dinamik programlama hizalama kullanmış olurlar. Böylece, birleştirilmiş sıralama stratejisi hedef dizisinin artan miktarda büyük havuzlarına başarıyla ölçeklendirilebilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Bölüm </td></tr><tr><td> PfuUltra Yüksek Sadakat </td><td> Agilent </td><td> 600384 </td><td> 1.4 </td></tr><tr><td> Betain </td><td> SIGMA </td><td> B2629 </td><td> 1.4 </td></tr><tr><td> M13mp18 ssDNA vektör </td><td> NEB </td><td> N4040S </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> pGEM-T kolay </td><td> Promega </td><td> A1360 </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> T4 nükleotid kinaz </td><td> NEB </td><td> M0201S </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> T4 Ligaz </td><td> NEB </td><td> M0202S </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> Polietilen Glikol 8000 MW </td><td> SIGMA </td><td> P5413 </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> Bioruptor sonikatör </td><td> Diagenode </td><td> UCD-200-TS</td><td> 2.3 </td></tr></tbody></table>

splinter kullanarak pooled sıralama gelen nadir genomik variantların algılama

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

DNA dizi analizi teknolojisi belirgin son yıllarda 2 ileri olduğu gibi, herhangi bir iki kişi arasındaki genetik varyasyonun miktarını daha önce 3 düşündüklerinden daha fazla olduğu giderek daha belirgin hale gelmiştir. Buna karşılık, dizi tabanlı genotipleme 4,5 yaygın hastalığın fenotipik değişkenlik ortak dizisi çeşitlerinin önemli bir katkı tanımlamak için başarısız oldu. Birlikte ele alındığında, bu gözlemler Ortak Hastalık / ortak ve karmaşık fenotipleri &quot;kayıp kalıtım&quot; ın yerine çoğunluk nadir ve özel DNA varyantlarının 6-8 bireyin kişisel tercihe bağlı olduğunu düşündüren Rare Variant hipotez evrim yol açmıştır . Ancak, nadir değişimi karmaşık fenotipleri nasıl etkilediğini karakterize birçok genomik lokuslar çok etkilenen bireylerin analiz gerektirir ve ideal bir etkilenmemiş kohortta benzer bir anketle karşılaştırıldığında. Bugünün platformlar, bir tarafından sunulan güç sıralaması rağmenbirçok genomik lokusları ve gerekli sonraki sayısal analiz nüfus tabanlı anket birçok araştırmacı için engelleyici kalır. Bu gereksinimi karşılamak için, biz bir birleştirilmiş sıralama yaklaşımı 1,9 ve elde edilen veriler son derece doğru nadir değişken tespiti için yeni bir yazılım paketi 1 geliştirdik. Etkilenen bireylerin ve anket tek bir sıralama kütüphanede birden fazla hedef bölgelerde genetik varyasyonun derecesi, tüm nüfusun Havuzu genom yeteneği geleneksel tek-örnek sıralama metodolojisi mükemmel bir maliyet ve zaman tasarrufu sağlar. 25 kat allel başına ortalama sıralama kapsama ile, bizim özel algoritması, SPLINTER, 1 kadar havuzları yüksek duyarlılık ve özgüllük uzunluğunda dört baz çiftlerine eklemeler, silmeler ve oyuncu çağırmak için bir iç varyant arayarak kontrol stratejisi kullanıyor 500 bireylerde mutant allel. Burada toplanmış s hazırlanması için bir yöntem tarifkütüphane equencing havuzlanmış dizi analizi (SPLINTER&#39;da paketini nasıl kullanılacağı hakkında adım adım talimatları takip <a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a> ). Biz 947 birey toplanmış dizi arasında bir karşılaştırma gösteriyor, bunların hepsi de kişi başına sıralama ile 20kb üzerinde de, genom dizisi yapıldı. Etiketlediniz genotipleme ve havuza örnek olarak adlandırılan yeni varyantları arasındaki uyum mükemmeldi. Bu yöntem kolay genomik lokus ve bireylerin herhangi bir sayı herhangi bir sayı kadar ölçeklendirilebilir. Çalışma kapsamında nüfus taklit oranlarda iç pozitif ve negatif amplikon kontrolleri birleşmeyle, algoritmanın optimum performans için kalibre edilebilir. Bu strateji, aynı zamanda hibridizasyon yakalama ya da tek tek spesifik barkodlar ile kullanılmak üzere modifiye edilebilir ve bu tür tümörün DNA gibi doğal olarak heterojen örnekleri, bir sekanslama için uygulanabilir.

Pooled DNA dizi büyük kohortlarında karmaşık fenotipleri ile ilişkili nadir türevlerini algılamak için hızlı ve maliyet-etkin bir stratejidir. Burada SPLINTER&#39;da yazılım paketi kullanarak 32 kanser ilişkili genlerin havuzlu, yeni nesil dizileme sayısal analiz açıklanmaktadır. Bu yöntem, ölçeklenebilir ve menfaat fenotipi için geçerlidir.

SPLINTER kullanarak Pooled Sıralama gelen Nadir Genomik Variantların Algılama

DNA dizileme teknolojisi son yıllarda belirgin bir ilerleme kaydettiğinden2, herhangi iki... arasındaki genetik varyasyon miktarının giderek daha belirgin hale geldiği görülmektedir.

Bu prosedürün genel amacı, nadir fonksiyonel varyasyonların ağırlıklı olduğu bireylerden oluşan bir popülasyondaki genleri tanımlamaktır. Bu işlem, öncelikle bir DNA örnek popülasyonunun havuzlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, bir yeni nesil dizileme kütüphanesi oluşturmak ve bunu dizilemektir.Bunu, okumaların referans diziye hizalanması ve bir hata modelinin oluşturulması takip eder. Son adım, splinter algoritması kullanılarak yapılan hesaplamalı analizdir. Nihayetinde, havuzlanmış Yeni Nesil Dizileme'nin splinter analizi, popülasyonlar içinde nadir fonksiyonel varyasyonların ağırlıklı olduğu genleri göstermek için kullanılır. Prosedürün gösterimi.Bugün, mentorum ve iş birliği yaptığımız Rob Mitra'nın laboratuvarında lisansüstü öğrencisi olan Francesco Vilania ile benim laboratuvarımda lisansüstü öğrencisi olan Enrique Ramos bize eşlik edecekler. Bu tekniğin tekil birey genotipleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, önceden herhangi bir bilgiye ihtiyaç duymadan, karışık bir DNA molekülü popülasyonundaki nadir sekans varyantlarını çok hassas bir şekilde tespit etmenize olanak tanımasıdır. Bu yöntem, geniş kohort çalışmalarında yeni ortaya çıkan hastalık yapıcı nadir varyantların frekansının nasıl belirleneceği gibi, genetik ve genomik alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Optimal doğruluğu elde etmek için her splinter deneyi, negatif ve pozitif bir kontrolün varlığını gerektirir; PCR reaksiyon karışımını PFU ultra high fidelity DNA polimeraz kullanarak hazırlayın. Negatif kontrol, klonlanmış bir vektör iskeleti gibi genetik varyasyon içermediği bilinen herhangi bir DNA dizisinden elde edilen bir PCR ürünüdür.Burada, M 13 MP 18 vektöründen elde edilen 1, 934 baz çiftlik bir amplikon kullanılmıştır. Pozitif kontrol, tüm popülasyonda bulunan, önceden doğrulanmış herhangi bir dizi varyantı seti olabilir. Bu veriler mevcut değilse, bu laboratuvar, bu tabloda listelendiği üzere PGMT easy vektörüne klonlanmış mühendislik dizilerinin bir karışımından oluşan 331 baz çiftlik bir PCR ürününden meydana gelen yapay bir pozitif kontrol tasarlamıştır.Bu sekanslar, hasta havuzundaki gerçek varyantların çeşitli düşük alel frekanslarını taklit etmek için birleştirilir. Bu videoya eşlik eden yazılı protokolde tartışıldığı şekilde örneklerin PCR amplifikasyonunun ardından, her bir PCR ürününde kalan fazla primerler Kyogen Kayak hızlı kolon saflaştırma yöntemiyle veya geniş ölçekli temizleme için vakum manifolduna sahip 96 kuyucuklu filtre plakaları kullanılarak temizlenir. Saflaştırma işlemi tamamlandıktan sonra, her bir PCR ürünü standart teknikler kullanılarakle miktarları belirlenir.Tüm PCR ürünlerini ve kontrollerini, molekül sayısına göre normalize edilmiş bir havuzda birleştirmeye hazırlanın. Konsantrasyona göre havuzlama yapmak, küçük amplikonların daha büyük ürünlere kıyasla aşırı temsil edilmesine neden olacaktır. Bunun yerine, amplikon başına normalize edilmiş sayıda molekülü havuzlayın.Pipetleme sırasında doğruluğu koruyacak kadar büyük olan rastgele sayılar seçin. PCR ürünlerini ve kontrolleri alın. Küçük PCR aplikantlarının fragmantasyonu, temsilin uçlara doğru yanlılık gösterme olasılığını artıracağından, PCR ürünlerinin ligasyonu gereklidir.Bu nedenle, pull PCR ürünlerini fragmantasyon işleminden önce büyük konlara ligasyonu yaparız. Protokolde belirtildiği üzere T four Ligase, T four PNK ve PEG kullanarak küt uçlu ligasyon için karışımı hazırlayın. Reaksiyonu 22 °C'de 17 saat boyunca inkübe edin.Ardından 65 °C'de 20 dakika boyunca inkübasyon yapın ve 4 °C'de bekletin. Daha sonra, 50 ng örneği agaroz jeline yükleyerek ligasyonu kontrol edin. Başarılı ligasyon, şeritte yüksek moleküler ağırlıklı bir bandın oluşmasıyla sonuçlanacaktır.Numuneyi, viskozitesini azaltmak için Qiagen PB Buffer ile 10'a 1 oranında seyrelterek rastgele bir sonikasyon stratejisiyle DNA fragmantasyonu için hazırlayın. Ardından, geniş PCR ürün konsantrasyonunu 24 örnekli Diagen Node Bio Rupture kullanarak fragmente edin; 25 dakika boyunca, her dakika için 40 saniye açık ve 20 saniye kapalı olacak şekilde yüksek güçte sonike edin. DNA fragmantasyon sonuçlarını agaroz jelde kontrol edin ve metinde açıklandığı şekilde illumina sekanslama işlemine geçin.Sekanslamaya başlamak için okuma hizalamasını gerçekleştirin. Ham sekanslama okuma dosyalarını ya scarf formatına dönüştürün ya da bunları sıkıştırın. Sıkıştırma işlemi isteğe bağlıdır.Herhangi bir ilgili bilgi kaybı olmadan, sonraki analiz adımları için zaman ve alan tasarrufu sağlar. Dahil edilen hizalama aracını kullanarak, ham okumaları açıklama eklenmiş hızlandırılmış referans dizisine hizalayın. Hedeflenen bölgelere özgü olanlar arasında PCR reaksiyonlarının yanı sıra pozitif ve negatif kontroller de yer alır.Giriş formatı scarf formatında veya sıkıştırılmış olmalıdır. Ardından, metinde açıklandığı şekilde dosya etiketleme işlemini gerçekleştirin. Her çalışma, her çalışma için hataları modellemek ve doğru varyant çağrımı yapmak üzere karakterize edilecek benzersiz bir sekanslama hatası profili oluşturur.Hizalanmış etiketli dosyadan elde edilen her havuz örnek kütüphanesine, dizi varyasyonu sergilediği bilinen bir iç kontrol dahil edilmiştir. Negatif kontrol referans dizisini kullanarak, beraberinde sunulan araçla bir hata modeli dosyası oluşturun; tüm negatif kontrol dizisi kullanılabilir veya alternatif olarak, beş uç ve üç uç noktaları belirtilerek yalnızca bir alt küme seçilebilir. Benzersiz okumalar ve psödokayımlar her zaman uygulanmalıdır.Araç, çıkış dosyası adı parametresiyle başlayan ve sırasıyla sıfır, bir veya iki ile biten üç dosya oluşturacaktır. Bu dosyalar, splinter ile varyant belirleme işlemi için sırasıyla sıfırıncı, birinci ve ikinci derece hata modellerine karşılık gelir. Çalışma hata oranı profilinin görselleştirilmesi için her zaman ikinci derece hata modeli kullanılmalıdır.Hata modeli grafiğini çizmek için kullanılan Pearl betiği, sıfırıncı derece hata modeli dosyasında bir PDF hata grafiği oluşturmak için kullanılabilir. Grafik dosyası, çalışmaya özgü hata eğilimlerini ortaya çıkaracak ve analiz için maksimum okuma baz sayısını belirlemek amacıyla kullanılacaktır. Aşağıdaki bölüm, nadir sekans varyantlarını tespit etmek için hata modelini kullanarak hizalanmış dosya üzerinde splinter'ın nasıl çalıştırılacağını gösterecektir.Analizdeki ilk adım, referans dizilim ve hata modelini kullanarak hizalanmış dosya üzerinde splinter'ı çalıştırmaktır. Kusurlu olduğu tespit edilen tek okuma bazları analiz dışı bırakılabilir. P-değeri eşik değeri, varyant çağırma analizinin ne kadar katı olacağını belirler.Minimum -1,301 kesme değeri iyi bir başlangıçtır. Havuz boyutu seçeneği, minor alel frekansları gerçek havuzdaki tek bir alelinkinden daha düşük olan potansiyel varyansları eleyerek algoritmanın sinyal-gürültü ayırt etme yeteneğini optimize eder. Havuz boyutu seçeneği, deneyde analiz edilen gerçek alel sayısından büyük olan en yakın değere ayarlanmalıdır.Daha düşük frekanslarda tespit edilen varyanslar gürültü olarak kabul edilip yok sayılacaktır. Tüm parametreleri ve dosya adlarını girdikten sonra splinter'ı çalıştırın. Bu dosya, örnek genelinde istatistiksel olarak anlamlı olan tüm vuruşları, varyant tipinin konumuna dair bir açıklama ile birlikte döndürür.Varyantın DNA zinciri frekansı başına P-değeri ve DNA zinciri başına toplam kapsama alanı. Liste şişesi, örneğin genelindeki kapsamayı normalize etmek için splinter tarafından kullanılır. İlk alan ilgili amplikonu, ikinci alan ise mutasyonun bulunduğu pozisyonu belirtir.N, dizinin geri kalanının herhangi bir mutasyon içermediğini belirtir. Normalizasyon için, belirli bir çalışmada duyarlılığı ve özgünlüğü maksimize etmek adına pozitif kontrolün analizi temel öneme sahiptir. Bu durum önemlidir çünkü büyük olasılıkla -1,301 olan başlangıç kesme değeri, tüm yalancı pozitifleri elemeye yetmeyecektir.Her bir splinter analizi, öncelikli olarak tahmin edilemeyecek olan, saptanan her varyant için gerçek P-değerini gösterecektir. Ancak, tüm analiz, bilinen gerçek pozitif baz konumları için başlangıç çıktısında görüntülenen en az kısıtlayıcı P-değeri kullanılarak tekrarlanabilir. Bu işlem, gerçek pozitiflere kıyasla tipik olarak çok daha az anlamlı P-değerlerine sahip olan yanlış pozitiflerin çoğunu, hatta tamamını dışarıda bırakırken tüm gerçek pozitiflerin korunmasını sağlayacaktır.Bu işlemi otomatikleştirmek için cutoff tester betiği kullanılabilir. Cutoff tester betiği, bir splinter çıktı dosyasına ve normalizasyon için kullanılanla aynı biçimde, sekme ile ayrılmış bir dosya şeklinde sunulan pozitif kontrol hitleri listesine ihtiyaç duyar. Elde edilen çıktı, optimal değere kademeli olarak ulaşan cutoff değerlerinin bir listesi olacaktır.Son satır, çalışma için en optimal kesme değerini temsil eder ve bu nedenle veri analizi için kullanılabilir. Optimal sonuç, bir hassasiyet ve özgüllük değerine ulaşmaktır. Ancak, bu değerler elde edilemezse, dahil edilen okuma bazlarının sayısı değiştirilerek splinter analizi optimize edilebilir.Nihai eşik değeri, optimal eşik değerinin altındaki sonuçları splinter çıktı dosyasından filtreleyecek olan cutoff cut betiği kullanılarak verilere uygulanabilir. Bu adım, örnekte bulunan snip ve indel'leri içerecek olan nihai splinter çıktı dosyasını oluşturacaktır. Lütfen insersiyonlar için olan çıktının, sübstitüsyonlar veya delesyonlar için olan çıktıyla biraz farklı olduğunu unutmayın.Havuzlanmış bir örnekteki tek bir alele yönelik kapsama oranının bir fonksiyonu olarak doğruluk, bu tip bir grafikte görselleştirilir. Doğruluk, bir alıcı operatör eğrisinin eğri altındaki alan (kısaca AUC) olarak tahmin edilir ve 0,5'lik rastgele bir doğruluktan 1,0'lık mükemmel bir doğruluğa kadar değişir. Bu örnekte AUC, 200, 500 ve 1.000 alelden oluşan havuzlarda tek mutant alellerin tespiti için alel başına kapsama oranının bir fonksiyonu olarak grafiğe dökülmüştür.Burada, insersiyonlar, delesyonlar ve sübstitüsyonlar için toplam bir fonksiyon olarak UC grafiğe dökülmüştür. Bu hata grafiği, belirli bir pozisyonda hatalı bir bazın eklenme olasılığını göstermektedir. Hata profili, sekanslama okumasının üç prime ucuna doğru artan bir eğilimle düşük hata oranları sergilemektedir.Özellikle farklı referans nükleotidler farklı hata olasılıkları sergiler. Bu grafik, alel başına 25 katın üzerinde kapsama alanına sahip pozisyonlar için splinter'ın alel frekansını tahmin etme doğruluğunu ortaya koymaktadır. splinter tarafından tahmin edilen havuzlanmış DNA alel frekansları ile genom çapında ilişkilendirme çalışmaları veya GWAS sonuçları tarafından ölçülen alel sayımları arasındaki karşılaştırma.Çok yüksek bir korelasyonda, 974 bireyden oluşan bir popülasyon seçilmiş ve sekanslama için 20 kilobazlık bir bölge hedeflenmiştir. Nadir varyantların tespiti için Splinter uygulanmıştır. Standart protokole uygun olarak, her bireye önceden genomik analiz yapılmış ve işaretli varyantlar ile yeni varyantların genotiplemesi arasındaki GWAS uyumluluğu değerlendirilmiştir.Havuzlanmış örnekte tespit edilen sonuçlar mükemmeldi. Birinin popülasyonda nadir görüldüğü üç varyant, dizileme sonuçlarından de novo olarak belirlendi ve bireysel piro dizileme ile doğrulandı; piro dizileme ile havuzlanmış dizileme arasındaki minör alel frekansları veya matematiksel uyum mükemmeldi. Havuzlanmış örneğinizdeki nadir varyantı bulma işlemini tamamladığınızda, birçok kişi tespit edilen bu varyantın fonksiyonel sonuçlarının neler olduğunu bilmek ister.Böylece, varyansınızın anotasyonu, geliştirme aşamasından sonraki süreçte bir sonraki adım haline gelir. Bu teknik, DNA dizileme alanındaki araştırmacıların, büyük popülasyon çalışmalarındaki nadir varyantları karakterize etmek amacıyla, bu varyantları hızlı ve maliyet etkin bir şekilde incelemelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, splinter kullanarak bir havuzlanmış DNA örneğindeki nadir dizi varyantlarının nasıl tespit edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

detection-rare-genomic-variants-from-pooled-sequencing-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Otizm ve şizofreni gibi ortak bir bozukluğa yol novo mutasyonlar bulmak için moleküler genetik strateji.

Ortak Bozuklukları de Novo Mutasyonlar, otizm ve şizofreni gibi tanımlayın Bir Strateji

Biz Barkodlanan DNA kütüphaneleri ve büyük ölçüde paralel "yeni nesil" dizisi ile klinik tümör numunelerinde önemli kanserle ilişkili mutasyonların saptanması için olan hibridizasyon-bazlı sonraki ekson yakalama hazırlanmasını tarif etmektedir. Hedefli ekson dizileme nedenle düşük frekanslı mutasyonları tespit etmek için yüksek duyarlılık verimli, yüksek verimlilik, düşük maliyet ve derin dizisi kapsama avantajlar sunmaktadır.

Ekson yakalama ve Devasa Paralel Dizilimine tarafından Tümör Örneklerinin somatik genetik değişiklikler tespit

Bisülfit amplikon dizilemesi (BSAS), hedeflenen genomik ilgi bölgelerinde sitozin metilasyonunu ölçmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, baza özgü bir seviyede DNA metilasyonunun mutlak kantitasyonunu üretmek için yeni nesil dizilemeden önce hedef bölgelerin PCR amplifikasyonu ile eşleştirilmiş bisülfit dönüşümünü kullanır.

DNA Metilasyon Analizi nesil Dizilimine tarafından hedef

Bu el yazması mutasyonlar düşük frekans ctDNA, ER-Seq. algılamak için bir teknik anlatılmaktadır Bu yöntem iki yönlü hata düzeltmesi, özel arka plan filtre ve verimli moleküler acquirement eşsiz kullanımı tarafından ayrıştırılan.

Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti

Hedeflenen yeni nesil sıralama Hastalıkları Araştırma ve Klinik teşhis giderek daha popüler hale geliyor zaman ve maliyet-etkin bir yaklaşımdır. Burada açıklanan protokol sıralaması için gerekli karmaşık iş akışı ve hastalık katkıda genetik varyantların tanımlamak için kullanılan Biyoinformatik işlem sunar.

Hedef yeni nesil sıralama ve Biyoinformatik boru hattı anayasal hastalığı genetik belirleyicileri değerlendirmek için

Yeni nesil sıralama (NGS) platformu (~0.5–2.0%) yüksek hata oranı tarafından sınırlı genomik karakterizasyonu için güçlü bir araçtır. NGS hata oranı önlemek ve mutasyonlar varyant alleli kesirler 0,0001 nadir, tespit etmemize izin bizim hata düzeltilmiş sıralama yöntemleri açıklanmaktadır.

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Deneysel evrim dondurulmuş arşivlerine kolayca uyarlanabilen tek nükleotid olmayan polimorfizm alel dinamiklerini takip etmek için uygun maliyetli bir yöntem geliştirdik. Üçlü PCR tekniği, deneysel evrim boyunca bir yerleştirme alelinin göreceli frekansını ölçmek için otomatik paralel kılcal elektroforez ile birleştirildi.

Deneysel Olarak Evrimleşmiş Popülasyonlarda Yapısal Varyantların Dinamiklerini Takip Etmek

Genetiği değiştirilmiş fare modellerinde ortaya çıkan tümörlerde terapötik hedefleri ve karşılık gelen insan tümör tipini belirlemek ve karşılaştırmak için genomik analizler ve fonksiyonel genomik ekranlar kullanan türler arası karşılaştırmalı bir onkogenomik yaklaşım geliştirdik.

Malign Periferik Sinir Kılıfı Tümörünün Fare Modellerinde Terapötik Hedefleri Belirlemek için Genetik Profilleme ve Genom Ölçeğinde Bırakma Taraması

Fare Tails Genomik DNA izolasyonu

Mikrobiyal topluluk yüksek molekül ağırlıklı ve yüksek kalitede genomik DNA izole etmek için bir metodoloji tarif edilir.

Topraklar ve tortulları Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA çıkarımı

Öğrenin SPLINTER algoritması kullanarak havuzlanmış DNA dizileme verilerinde nadir genomik varyantları tespit etmeyi. Bu hesaplamalı yöntem, büyük popülasyonlarda kanserle ilişkili genlerdeki varyasyonları doğru şekilde belirlemenizi sağlar.

SPLINTER kullanarak Pooled Sıralama gelen Nadir Genomik Variantların Algılama

Daha fazla video keşfet