SPLINTER kullanarak Pooled Sıralama gelen Nadir Genomik Variantların Algılama

Bu prosedürün genel amacı, nadir fonksiyonel varyasyonların ağırlıklı olduğu bireylerden oluşan bir popülasyondaki genleri tanımlamaktır. Bu işlem, öncelikle bir DNA örnek popülasyonunun havuzlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, bir yeni nesil dizileme kütüphanesi oluşturmak ve bunu dizilemektir.

Bunu, okumaların referans diziye hizalanması ve bir hata modelinin oluşturulması takip eder. Son adım, splinter algoritması kullanılarak yapılan hesaplamalı analizdir. Nihayetinde, havuzlanmış Yeni Nesil Dizileme'nin splinter analizi, popülasyonlar içinde nadir fonksiyonel varyasyonların ağırlıklı olduğu genleri göstermek için kullanılır. Prosedürün gösterimi.

Bugün, mentorum ve iş birliği yaptığımız Rob Mitra'nın laboratuvarında lisansüstü öğrencisi olan Francesco Vilania ile benim laboratuvarımda lisansüstü öğrencisi olan Enrique Ramos bize eşlik edecekler. Bu tekniğin tekil birey genotipleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, önceden herhangi bir bilgiye ihtiyaç duymadan, karışık bir DNA molekülü popülasyonundaki nadir sekans varyantlarını çok hassas bir şekilde tespit etmenize olanak tanımasıdır. Bu yöntem, geniş kohort çalışmalarında yeni ortaya çıkan hastalık yapıcı nadir varyantların frekansının nasıl belirleneceği gibi, genetik ve genomik alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Optimal doğruluğu elde etmek için her splinter deneyi, negatif ve pozitif bir kontrolün varlığını gerektirir; PCR reaksiyon karışımını PFU ultra high fidelity DNA polimeraz kullanarak hazırlayın. Negatif kontrol, klonlanmış bir vektör iskeleti gibi genetik varyasyon içermediği bilinen herhangi bir DNA dizisinden elde edilen bir PCR ürünüdür.

Burada, M 13 MP 18 vektöründen elde edilen 1, 934 baz çiftlik bir amplikon kullanılmıştır. Pozitif kontrol, tüm popülasyonda bulunan, önceden doğrulanmış herhangi bir dizi varyantı seti olabilir. Bu veriler mevcut değilse, bu laboratuvar, bu tabloda listelendiği üzere PGMT easy vektörüne klonlanmış mühendislik dizilerinin bir karışımından oluşan 331 baz çiftlik bir PCR ürününden meydana gelen yapay bir pozitif kontrol tasarlamıştır.

Bu sekanslar, hasta havuzundaki gerçek varyantların çeşitli düşük alel frekanslarını taklit etmek için birleştirilir. Bu videoya eşlik eden yazılı protokolde tartışıldığı şekilde örneklerin PCR amplifikasyonunun ardından, her bir PCR ürününde kalan fazla primerler Kyogen Kayak hızlı kolon saflaştırma yöntemiyle veya geniş ölçekli temizleme için vakum manifolduna sahip 96 kuyucuklu filtre plakaları kullanılarak temizlenir. Saflaştırma işlemi tamamlandıktan sonra, her bir PCR ürünü standart teknikler kullanılarakle miktarları belirlenir.

Tüm PCR ürünlerini ve kontrollerini, molekül sayısına göre normalize edilmiş bir havuzda birleştirmeye hazırlanın. Konsantrasyona göre havuzlama yapmak, küçük amplikonların daha büyük ürünlere kıyasla aşırı temsil edilmesine neden olacaktır. Bunun yerine, amplikon başına normalize edilmiş sayıda molekülü havuzlayın.

Pipetleme sırasında doğruluğu koruyacak kadar büyük olan rastgele sayılar seçin. PCR ürünlerini ve kontrolleri alın. Küçük PCR aplikantlarının fragmantasyonu, temsilin uçlara doğru yanlılık gösterme olasılığını artıracağından, PCR ürünlerinin ligasyonu gereklidir.

Bu nedenle, pull PCR ürünlerini fragmantasyon işleminden önce büyük konlara ligasyonu yaparız. Protokolde belirtildiği üzere T four Ligase, T four PNK ve PEG kullanarak küt uçlu ligasyon için karışımı hazırlayın. Reaksiyonu 22 °C'de 17 saat boyunca inkübe edin.

Ardından 65 °C'de 20 dakika boyunca inkübasyon yapın ve 4 °C'de bekletin. Daha sonra, 50 ng örneği agaroz jeline yükleyerek ligasyonu kontrol edin. Başarılı ligasyon, şeritte yüksek moleküler ağırlıklı bir bandın oluşmasıyla sonuçlanacaktır.

Numuneyi, viskozitesini azaltmak için Qiagen PB Buffer ile 10'a 1 oranında seyrelterek rastgele bir sonikasyon stratejisiyle DNA fragmantasyonu için hazırlayın. Ardından, geniş PCR ürün konsantrasyonunu 24 örnekli Diagen Node Bio Rupture kullanarak fragmente edin; 25 dakika boyunca, her dakika için 40 saniye açık ve 20 saniye kapalı olacak şekilde yüksek güçte sonike edin. DNA fragmantasyon sonuçlarını agaroz jelde kontrol edin ve metinde açıklandığı şekilde illumina sekanslama işlemine geçin.

Sekanslamaya başlamak için okuma hizalamasını gerçekleştirin. Ham sekanslama okuma dosyalarını ya scarf formatına dönüştürün ya da bunları sıkıştırın. Sıkıştırma işlemi isteğe bağlıdır.

Herhangi bir ilgili bilgi kaybı olmadan, sonraki analiz adımları için zaman ve alan tasarrufu sağlar. Dahil edilen hizalama aracını kullanarak, ham okumaları açıklama eklenmiş hızlandırılmış referans dizisine hizalayın. Hedeflenen bölgelere özgü olanlar arasında PCR reaksiyonlarının yanı sıra pozitif ve negatif kontroller de yer alır.

Giriş formatı scarf formatında veya sıkıştırılmış olmalıdır. Ardından, metinde açıklandığı şekilde dosya etiketleme işlemini gerçekleştirin. Her çalışma, her çalışma için hataları modellemek ve doğru varyant çağrımı yapmak üzere karakterize edilecek benzersiz bir sekanslama hatası profili oluşturur.

Hizalanmış etiketli dosyadan elde edilen her havuz örnek kütüphanesine, dizi varyasyonu sergilediği bilinen bir iç kontrol dahil edilmiştir. Negatif kontrol referans dizisini kullanarak, beraberinde sunulan araçla bir hata modeli dosyası oluşturun; tüm negatif kontrol dizisi kullanılabilir veya alternatif olarak, beş uç ve üç uç noktaları belirtilerek yalnızca bir alt küme seçilebilir. Benzersiz okumalar ve psödokayımlar her zaman uygulanmalıdır.

Araç, çıkış dosyası adı parametresiyle başlayan ve sırasıyla sıfır, bir veya iki ile biten üç dosya oluşturacaktır. Bu dosyalar, splinter ile varyant belirleme işlemi için sırasıyla sıfırıncı, birinci ve ikinci derece hata modellerine karşılık gelir. Çalışma hata oranı profilinin görselleştirilmesi için her zaman ikinci derece hata modeli kullanılmalıdır.

Hata modeli grafiğini çizmek için kullanılan Pearl betiği, sıfırıncı derece hata modeli dosyasında bir PDF hata grafiği oluşturmak için kullanılabilir. Grafik dosyası, çalışmaya özgü hata eğilimlerini ortaya çıkaracak ve analiz için maksimum okuma baz sayısını belirlemek amacıyla kullanılacaktır. Aşağıdaki bölüm, nadir sekans varyantlarını tespit etmek için hata modelini kullanarak hizalanmış dosya üzerinde splinter'ın nasıl çalıştırılacağını gösterecektir.

Analizdeki ilk adım, referans dizilim ve hata modelini kullanarak hizalanmış dosya üzerinde splinter'ı çalıştırmaktır. Kusurlu olduğu tespit edilen tek okuma bazları analiz dışı bırakılabilir. P-değeri eşik değeri, varyant çağırma analizinin ne kadar katı olacağını belirler.

Minimum -1,301 kesme değeri iyi bir başlangıçtır. Havuz boyutu seçeneği, minor alel frekansları gerçek havuzdaki tek bir alelinkinden daha düşük olan potansiyel varyansları eleyerek algoritmanın sinyal-gürültü ayırt etme yeteneğini optimize eder. Havuz boyutu seçeneği, deneyde analiz edilen gerçek alel sayısından büyük olan en yakın değere ayarlanmalıdır.

Daha düşük frekanslarda tespit edilen varyanslar gürültü olarak kabul edilip yok sayılacaktır. Tüm parametreleri ve dosya adlarını girdikten sonra splinter'ı çalıştırın. Bu dosya, örnek genelinde istatistiksel olarak anlamlı olan tüm vuruşları, varyant tipinin konumuna dair bir açıklama ile birlikte döndürür.

Varyantın DNA zinciri frekansı başına P-değeri ve DNA zinciri başına toplam kapsama alanı. Liste şişesi, örneğin genelindeki kapsamayı normalize etmek için splinter tarafından kullanılır. İlk alan ilgili amplikonu, ikinci alan ise mutasyonun bulunduğu pozisyonu belirtir.

N, dizinin geri kalanının herhangi bir mutasyon içermediğini belirtir. Normalizasyon için, belirli bir çalışmada duyarlılığı ve özgünlüğü maksimize etmek adına pozitif kontrolün analizi temel öneme sahiptir. Bu durum önemlidir çünkü büyük olasılıkla -1,301 olan başlangıç kesme değeri, tüm yalancı pozitifleri elemeye yetmeyecektir.

Her bir splinter analizi, öncelikli olarak tahmin edilemeyecek olan, saptanan her varyant için gerçek P-değerini gösterecektir. Ancak, tüm analiz, bilinen gerçek pozitif baz konumları için başlangıç çıktısında görüntülenen en az kısıtlayıcı P-değeri kullanılarak tekrarlanabilir. Bu işlem, gerçek pozitiflere kıyasla tipik olarak çok daha az anlamlı P-değerlerine sahip olan yanlış pozitiflerin çoğunu, hatta tamamını dışarıda bırakırken tüm gerçek pozitiflerin korunmasını sağlayacaktır.

Bu işlemi otomatikleştirmek için cutoff tester betiği kullanılabilir. Cutoff tester betiği, bir splinter çıktı dosyasına ve normalizasyon için kullanılanla aynı biçimde, sekme ile ayrılmış bir dosya şeklinde sunulan pozitif kontrol hitleri listesine ihtiyaç duyar. Elde edilen çıktı, optimal değere kademeli olarak ulaşan cutoff değerlerinin bir listesi olacaktır.

Son satır, çalışma için en optimal kesme değerini temsil eder ve bu nedenle veri analizi için kullanılabilir. Optimal sonuç, bir hassasiyet ve özgüllük değerine ulaşmaktır. Ancak, bu değerler elde edilemezse, dahil edilen okuma bazlarının sayısı değiştirilerek splinter analizi optimize edilebilir.

Nihai eşik değeri, optimal eşik değerinin altındaki sonuçları splinter çıktı dosyasından filtreleyecek olan cutoff cut betiği kullanılarak verilere uygulanabilir. Bu adım, örnekte bulunan snip ve indel'leri içerecek olan nihai splinter çıktı dosyasını oluşturacaktır. Lütfen insersiyonlar için olan çıktının, sübstitüsyonlar veya delesyonlar için olan çıktıyla biraz farklı olduğunu unutmayın.

Havuzlanmış bir örnekteki tek bir alele yönelik kapsama oranının bir fonksiyonu olarak doğruluk, bu tip bir grafikte görselleştirilir. Doğruluk, bir alıcı operatör eğrisinin eğri altındaki alan (kısaca AUC) olarak tahmin edilir ve 0,5'lik rastgele bir doğruluktan 1,0'lık mükemmel bir doğruluğa kadar değişir. Bu örnekte AUC, 200, 500 ve 1.000 alelden oluşan havuzlarda tek mutant alellerin tespiti için alel başına kapsama oranının bir fonksiyonu olarak grafiğe dökülmüştür.

Burada, insersiyonlar, delesyonlar ve sübstitüsyonlar için toplam bir fonksiyon olarak UC grafiğe dökülmüştür. Bu hata grafiği, belirli bir pozisyonda hatalı bir bazın eklenme olasılığını göstermektedir. Hata profili, sekanslama okumasının üç prime ucuna doğru artan bir eğilimle düşük hata oranları sergilemektedir.

Özellikle farklı referans nükleotidler farklı hata olasılıkları sergiler. Bu grafik, alel başına 25 katın üzerinde kapsama alanına sahip pozisyonlar için splinter'ın alel frekansını tahmin etme doğruluğunu ortaya koymaktadır. splinter tarafından tahmin edilen havuzlanmış DNA alel frekansları ile genom çapında ilişkilendirme çalışmaları veya GWAS sonuçları tarafından ölçülen alel sayımları arasındaki karşılaştırma.

Çok yüksek bir korelasyonda, 974 bireyden oluşan bir popülasyon seçilmiş ve sekanslama için 20 kilobazlık bir bölge hedeflenmiştir. Nadir varyantların tespiti için Splinter uygulanmıştır. Standart protokole uygun olarak, her bireye önceden genomik analiz yapılmış ve işaretli varyantlar ile yeni varyantların genotiplemesi arasındaki GWAS uyumluluğu değerlendirilmiştir.

Havuzlanmış örnekte tespit edilen sonuçlar mükemmeldi. Birinin popülasyonda nadir görüldüğü üç varyant, dizileme sonuçlarından de novo olarak belirlendi ve bireysel piro dizileme ile doğrulandı; piro dizileme ile havuzlanmış dizileme arasındaki minör alel frekansları veya matematiksel uyum mükemmeldi. Havuzlanmış örneğinizdeki nadir varyantı bulma işlemini tamamladığınızda, birçok kişi tespit edilen bu varyantın fonksiyonel sonuçlarının neler olduğunu bilmek ister.

Böylece, varyansınızın anotasyonu, geliştirme aşamasından sonraki süreçte bir sonraki adım haline gelir. Bu teknik, DNA dizileme alanındaki araştırmacıların, büyük popülasyon çalışmalarındaki nadir varyantları karakterize etmek amacıyla, bu varyantları hızlı ve maliyet etkin bir şekilde incelemelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, splinter kullanarak bir havuzlanmış DNA örneğindeki nadir dizi varyantlarının nasıl tespit edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.