Yüksek Yoğunluklu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürleri gelen Rapid Fibroblast Kaldırma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, insan kök hücre kolonilerini hızlı ve verimli bir şekilde izole etmektir. Bu, insan embriyonik hücrelerinin fare embriyonik fibroblastlarından oluşan yoğun bir tabaka üzerinde kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. Zamanla, kök hücre popülasyonunun genişlemesi insan kök hücrelerinin sayısını artırır ve aynı zamanda bu hücrelerin ortamda ada benzeri koloniler oluşturmasına olanak tanır.

Ardından, metilselüloz tabakası aspirasyon yoluyla uzaklaştırılarak insan embriyonik kök hücrelerinin tekil kolonileri geride bırakılır. Kök hücre belirteçleri için yapılan immünohistokimyasal boyama sonuçları, bu yöntemin besleyici hücreleri elemek ve koloni bütünlüğünü korumak için etkili bir izolasyon yöntemi olduğunu göstermektedir. Bu yöntem fikri ilk olarak laboratuvarımızda hücreleri ko-kültür yaparken, kök hücre kültürlerini aşırı konfluent kültür sistemlerinden kurtarmak istemem üzerine ortaya çıktı.

Bu sistemle ilgili çoğu kişinin yaşayacağı temel sorun, insan kök hücre kültürü konusundaki deneyim eksikliğidir. Kök hücre kolonilerini ayırmak için sıralama (sorting) veya elle seçme gibi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu tekniğin deneyler için çok sayıda insan embriyonik kök hücresini izole etmemiz gerektiğinde özellikle yararlı olduğunu gördük. Bu yöntem, yüksek yoğunluklu kültürlerden kolonileri izole etmek için daha hızlı ve daha verimlidir.

Mouse embriyonik fibroblastları, bölünmelerini önlemek için embriyonik kök hücrelerle birlikte kültüre edilmeden önce mitomisin C ile işlem görmeli veya ışınlanmalıdır. MEF ekiminden iki saat önce, her 60 milimetrelik plazma işleminden geçmiş kültür kabını iki mililitre %0,05'lik gelatin ile kaplayın; işlem görmüş MEF içeren bir şişeyi çözdürün, 1.500 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve ekim yapın. Gelatin kaplı kaba santimetrekareye yaklaşık 20.000 hücre düşecek şekilde bir kültür ekleyin ve hücrelerin yapışması için kültürü gece boyunca inkübe edin. Yeni kültürler, kriyoprezerve hücrelerden veya mevcut kültürlerin MEF kaplı kaplara pasajlanmasıyla başlatılabilir. Büyük insan embriyonik kök hücre kolonilerini içeren bir plaka ile başlarken, plakayı bir kez üç mililitre ısıtılmış fosfat tamponlu salin ile yıkayın.

Üç mililitre, bir miligram/mililitre konsantrasyonunda kollajenaz 4 çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de beş ila 10 dakika inkübe edin. Hücreler, tripsinde gördüğünüz gibi belirginleşmeyecek veya topaklanmayacaktır. Beş mililitrelik bir pipet ucunun kenarını kullanarak koloniler üzerinde ızgara şeklinde bir desen oluşturun ve onları küçük hücre kümelerine ayırın.

Şimdi pipet ucunun ucunu kültür plağına dik açı yapacak şekilde tutarak, kültür plağının tabanını sıyırın ve tüm hücreleri yüzeyden ayırın. Hücreleri hasat etmek için bir falcon tüpüne aktarın, beş dakika boyunca 1000 RPM hızında santrifüjleyin ve medyumu aspire ederek uzaklaştırın. Ardından, bir gün önce ekilmiş olan fare embriyonik fibroblastlarındaki medyumu aspire edin.

Ardından, insan embriyonik kök hücrelerini orijinal plakadan bire üç oranında ekleyin ve üç mililitre insan embriyonik kök hücreli besiyeri ile besleyin. İnsan HECS'ler, 10 ila 14 gün boyunca yüksek yoğunlukta kültüre edilir. Aspirasyon pipetinin ucunu plağın kenarına yerleştirin ve vakum kullanarak met şeridinin kenarını nazikçe yukarı çekin.

Besiyerini kapta kaldırın. Ucun hücre tabakasını yakalamasına izin verin ve ardından ucu plakanın üzerinde yay şeklinde yavaşça hareket ettirin. Eğer tabaka pipeti önemli ölçüde tıkarsa, tabakayı kültürden çıkarın.

Hücrelerin parçalanmasını tamamlamak için kültür kabının üst kısmına bir aspiratörle hafifçe vurun ve hücreleri tam bir aspirasyonla uzaklaştırın. İnsan embriyonik kök hücre besiyerini hemen yenileyin ve kültür kaplarına ekim yaptıktan sonra kültürü hücre kültürü inkübatörüne geri yerleştirin. Bu ko-kültür sistemi, fare embriyonik fibroblastları ile çevrili yüksek yoğunluklu insan embriyonik kök hücre kolonileri ile sonuçlanır.

Aspirasyon tekniği, MES'i uzaklaştırır ve küçük, bozulmamış insan embriyonik kök hücre kolonileri oluşturur. Bozulmamış koloniyi çevreleyen çok az miktarda mes ile, embriyonik kök hücre kolonileri oldukça büyük kolonilere dönüşecek şekilde önemli ölçüde genişleyebilir. Örneğin, met boşaltımının hemen ardından gösterilen bu insan embriyonik kök hücre kolonisi, metten 10 gün sonrasına kadar kolonilerin immünofloresan tanımlamasıyla çok büyük bir koloniye genişlemiştir.

Sömürülme işlemi, kolonilerin pluripotens işaretçilerinin ekspresyonunu koruduğunu ve mezodermal kadere doğru bir diferansiyasyon sergilemediğini göstermektedir. Bu transmisyon ışığı görüntüleri, immünofloresan olarak boyanmış kolonilerin farklı büyütmelerdeki morfolojilerini göstermektedir. DAPI, hücrelerin çekirdeklerini boyar.

Önemli bir nokta olarak, insan embriyonik kök hücreleri insan kök hücre belirteçleri olan SSEA-4, TRA-1-60 ve TRA-1-81'i eksprese eder. Görüntülerin, tipik düz kenarları olan bir koloniyi tasvir ettiğine dikkat edin. Mezoderm farklılaşmasının erken bir belirteci olan FLK-1'i eksprese etmezler ve DDR2 boyamasının yokluğundan anlaşılacağı üzere herhangi bir fibroblast içermezler.

Bu videoyu izledikten sonra, doğal ortamları manipüle etmek için kullanılan kültürleme teknikleri yardımıyla insan kök hücre kolonilerinin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Bu yöntem üzerinde uzmanlaştıktan sonra, işlem saniyeler içinde tamamlanabilir. Ayrıca, medyumu ve kalıntı katmanlarını temizlerken kültürlerinizin kurumasına izin vermemeyi unutmayın.