Name: Yüksek Yoğunluklu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürleri gelen Rapid Fibroblast Kaldırma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-28T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Öğrenin, fare embriyonik fibroblast katmanını aspire ederek insan embriyonik kök hücre kolonilerini hızla izole etme yöntemini. Bu teknik, koloni bütünlüğünü ve çok yönlülüğü koruyarak büyük ölçekli hasat sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Rejeneratif Tıp California Institute (RN2-00921-1) ve bir NIH tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Ödülü (F32-HL104924) bir Yeni Fakülte Ödülü II tarafından finanse edildi

1. Fare Embriyonik Besleyiciler hazırlanması <ol><li> HESC eş-kültür kullanılan MEFS önceden uygulanan bölünme gelen hücreleri inhibe etmek için ışınlama veya mitomisin-C tedavi edilmelidir. </li><li> MEF ekim öncesi iki saat, mont, her 60 mm plazma% 0.05 Jelatin 2 ml kültür çanak tedavi. </li><li> Bir tedavi MEFS bir flakon ve ~ 20.000 hücre / cm 2 plaka çözülme. </li><li> Hücreleri gecede uymak için izin ver. </li></ol> 2. MEFS üzerine Co-tohumlama hESC <ol><li> Yeni koloniler aşağıdaki gibi, yeni MEF kaplı yemekleri üzerine kriyoprezerve kültürleri veya pasajı mevcut kültürlerden gelen başlatılabilir. </li><li> Isıtılmış 1x 3 mL PBS ile 1 saat pasajlanmağa devam edilmesi için büyük hESC koloniler içeren plakayı yıkayın. </li><li> Kollajenaz IV / PBS çözeltisi (1 mg / ml), 3 ml ekleyin ve 5-10 dakika 37 ° C de inkübe (Not: hücreleri, ayrı veya topu gibi tripsin ile görülen girmeyeceğim). </li><li> Hücrelerinde ise halakollajenaz, 5 ml&#39;lik pipet ucunun bir kenarı kullanmak, küçük hücreli kümeleri içine kırarak, koloniler üzerinde bir ızgara deseni oluşturun. </li><li> Yüzeyinden bütün hücrelerin yerini değiştirmemek, kültür plakasının alt sıyırmak için pipet ucu (kültür levhasına dik bir şekilde tutulan) ucunu kullanımı. </li><li> 5 dakika boyunca (1000 rpm) bir Falcon tüp ve spin içine hücreleri toplayın. </li><li> Santrifüjlemeden sonra, Falcon tüp içinde hücre peleti bırakarak, orta aspire. </li><li> Önce MEFS kaplama günden itibaren MEF orta aspire. </li><li> Yeniden plaka orjinal plaka, 1:3 oranında hücreleri, ve HESC orta 3 ml yem </li></ol> 3. Co-kültür MEFS İncelten Not: İnsan ESC kültürlerinin kültür genellikle 10 ile 14 gün arasında, yüksek yoğunlukta olması gerekir. <ol><li> Levha kenarına bir aspirasyon pipet ucu yerleştirin ve emme yavaşça EMB kenarından yukarı çekmek için izin verir. </li><li> Rçanak, ortam kaydının silinmesi, ve uç levha hücre yakalamak ve yavaş yavaş plaka üzerinde bir yay biçimli bir şekilde uç hareket etmesini sağlar. Not: levha pipet ucu da tıkanmasına neden olur, ancak el kültür plakasının yüzeyinden levha çekerek kullanıcı engel olmamalıdır olarak bu sorun teşkil etmez. Hücreleri aspiratör ucuna sıkışmış iseniz, size tam aspirasyon için hücre sac kırmak için kültür çanak üst kullanabilirsiniz. </li><li> Hemen hESC orta değiştirin ve inkübatör geri tabak koydu. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar MEF kaldırma işleminin Sonuçta küçük bozulmamış hESC pluripotency yapımcıları SSEA-4 ekspresyonu korurken çok büyük koloniler (Şekil 2) içine önemli bir genişleme geçmesi mümkün koloniler (Şekil 1D), Eki ¾ ve Tra 1-81 (Şekil üretir 3). Şekil 1. ESC Koloni morfolojisi MEF kaldırılmasını Öncesi ve Sonrası. Kültür kaplarına üzerine tohumlama sonrası A) 1. gün ve B) günde 2 İnsan Embriyonik Kök Hücre Kolonileri. C) Yüksek Yoğunluklu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kolonileri (H7) MEFS çevrilidir. İki hESC koloniler kırmızı çizgiler içinde özetlenmiştir. D) açıklanan aspirasyonu tekniğini kullanarak MEF çıkarıldıktan sonra, biz sağlam koloni çevreleyen çok az MEFS izole bir hESC kolonisi ile bırakılır. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/3951/3951fig2.jpg" /> Şekil 2. 10 gün MEF kaldırılmasını sonra ESC Colony Genişleme. Hemen MEF tükenmesi sonrasında orijinal hESC koloni (solda) çok büyük bir koloni (sağda) beğenme içine genişletmek için izin verilir10x ximately 800 um. Orijinal koloninin kompozit kolonisi olarak aynı büyütme (10x) de görüntülü unutmayın. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3951/3951fig3.jpg" /> Şekil 3,. MEF-tüketilmiş hESC koloniler immün. Kolonilerin immünofloresan kimlik kadar MEF tükenmesi 10 gün sonra sömürge Ekim ¾ SSEA-4 göre belirgin olarak pluripotency belirteçlerin ekspresyonu ve Tra-1-81 boyanma korumak olduğunu gösterir. Ayrıca, bu hESC koloniler, mezodermal kader karşı türev sergilemez, FLK-1 yokluğu ile gösterilir., A, E, I, ve M) immunoflouscently lekeli koloniler, 20, 10, 10 ve 2x transmisyon ışığı görüntüler, .. sırasıyla B, F, J ve K) çekirdekler gösterir - sırasıyla immunofluorescently lekeli koloniler, 20, 10, 10 ve 2x, CD) DAPI boyalı hücrelerin ifadesi gösteriyorinsan kök hücre belirteci yalnızca SSEA-4, ve kompozit görüntü, 20x. GH) insan kök hücre belirteci Ekim ifadesi gösteriyor ¾ sadece ve kompozit görüntü, 10x. KL) insan kök hücre belirteci ifadesi Tra sadece 1-81 göster ve kompozit görüntü, 10x. MP) son satırı görüntüler bu büyütme, 2x ve bu koloniler görülen tipik düzgün sınırlar tasvir bir koloni tasvir değilse ekspres Ç) FLK-1, mezoderm farklılaşma erken bir göstergesi, ne de did DDR2 boyama yokluğu ile gösterildiği gibi bu P) herhangi bir fibroblastlar içerir. Ek video. Sheet Aspirasyon tarafından Fibroblastlar kaldırılıyor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3951/3951movie1.mp4" target="_blank">filmi görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol><li>Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+inner+cell+mass+cells+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts.</a> Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).</li>
<li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts%3A+somatic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).</li>
<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+scalable+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions.</a> Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).</li>
<li>Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+surfaces+for+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture.</a> J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).</li>
<li>Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+culture+system+using+human+foreskin+fibroblasts+as+feeder+cells+allows+production+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells.</a> Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).</li>
<li>McKay, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+feeder+cell+line+for+derivation+and+culture+of+hESc%2FhiPSc%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc.</a> Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStein%2C+GS+%22Thawing%2C+Seeding%2C+and+Changing+Medium+of+Human+Embryonic+Stem+Cells%22">Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells</a>. Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol. Biol. 767, 107-123 Forthcoming.</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu yazıda sunulan yöntem, insan embriyonik hücre kültürlerinden fibroblast besleyici hücreler ortadan kaldırmak için hızlı ve az masraflı bir alternatif sunuyor. Fibroblastların başarılı kaldırılması artık kök hücre kültürlerinde gelişen bu hücrelerin sıkıca konfluent Monolayer varlığına bağlıdır. 7-10 gün sonra büyüyen hESC koloniler koloniler arasında giderek yoğun fibroblast monolayer üreten, dışa doğru besleyici fibroblastlar itecektir. Fibroblast monolayer içindeki güçlü hücre-hücre ekleri bir hücre tabaka olarak h...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> DDR2 </td><td> Santa Cruz </td><td> 7555 </td><td> Fibroblast Marker </td></tr><tr><td> Dapi </td><td> Calbiochem </td><td> 268298 </td><td> Hücre Çekirdeği Marker </td></tr><tr><td> SSEA-4 </td><td> Millipore </td><td> MAB4304 </td><td> İnsan ESC Marker </td></tr><tr><td> Oct 3/4 </td><td> Santa Cruz </td><td> 9081 </td><td> İnsan ESC Marker </td></tr><tr><td> FLK-1 </td><td> BD Pharma </td><td> 555307 </td><td> Erken Farklılaşma Marker </td></tr><tr><td> Tra-1-81 </td><td> Acris </td><td> AM20377AF4-S </td><td> İnsan ESC Marker </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Özgü nedenlerden TabloGent hESC immünboyama için kullanılır.

yüksek yoğunluklu İnsan embriyonik kök hücre kültürleri gelen rapid fibroblast kaldırma

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) blastosist izolasyonu 1 sonra insan embriyonik kök hücreleri (hESC) kültürler kurmak için kullanıldı. Bu besleyici sistem hücre genişleme sırasında spontan farklılaşma geçiren gelen hESC korur. Ancak, bu ko-kültür yöntemi, emek yoğun bir yüksek eğitimli personel gerektirir ve verimleri düşük hESC saflık 4. Birçok laboratuar hESC kültürlerinde besleyici hücrelerin sayısının (yani matriks kaplı yemekleri veya diğer besleyici hücre tipleri 5-8 birleşmeyle) en aza indirmek için çalışmışlardır. Bu modifiye edilmiş kültür sistemlerinin bazı söz göstermiştir, ancak mitomisin C ile tedavi edilen fare embyronic fibroblast ile kültür hESC hESC kültürlerin istenmeyen spontan farklılaşma geciktirmek amacıyla için standart yöntem üstlenilmekle değil. Bu nedenle, hESC genişleme kullanılan besleyici hücrelerin farklılaşması deneyler sırasında kaldırılması gerekir. Çeşitli teknikler HESC eş saflaştırılması için kullanılabilir olmasına rağmenserme lonies (FACS, MACS veya ilaca dirençli vektörlerin kullanımı), bu teknikler emek, yoğun masraflı ve / veya hESC için zararlıdır. Bu proje hedefi hESC daha saf bir nüfusun Hasat sağlayan saflaştırılması için bir yöntem bulmak olmuştur. Biz birleşik hESC kültür, MEF nüfus MEF levha basit ve hızlı bir aspirasyon kullanılarak temizlenebilir olduğunu gözlemledim. Bu kaldırma &quot;yanal hücre-hücre stiren kültür çanak için daha düşük bir afiniteye sahip MEFS bağlayıcı ve kendi üretimi sırasında dışa fibroblastlar itmek için kök hücre kolonilerinin yeteneği dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır niş &quot;. HESC sonra pluripotency devamını sağlamak için MEF uzaklaştırıldıktan sonra 10 gün için SSEA-4, Oct3 / 4 ve Tra 1-81 ifade için incelendi. Ayrıca, hESC koloniler hESC genişleme ek bir düzeyde sağlayan, MEF çıkarıldıktan sonra daha büyük oluşumların içine büyüyen devam başardık.

Geçiş kültürlere besleyici-özgür koşullarda devam eden çabalarına rağmen, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve türetme ve kültürü fare embriyonik besleyiciler (MEFS) ile işbirliği kültürler büyük oranda bağımlı kalır. Burada, biz hızla öncesi deneylere hESC kültürlerden besleyiciler kaldırmak için yeni bir metodoloji göstermektedir.

Yüksek Yoğunluklu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürleri gelen Rapid Fibroblast Kaldırma

Blastokist izolasyonunun ardından insan embriyonik kök hücre (hESC) kültürleri oluşturmak için fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler) kullanılmıştır1. Bu feeder sistemi...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, insan kök hücre kolonilerini hızlı ve verimli bir şekilde izole etmektir. Bu, insan embriyonik hücrelerinin fare embriyonik fibroblastlarından oluşan yoğun bir tabaka üzerinde kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. Zamanla, kök hücre popülasyonunun genişlemesi insan kök hücrelerinin sayısını artırır ve aynı zamanda bu hücrelerin ortamda ada benzeri koloniler oluşturmasına olanak tanır.Ardından, metilselüloz tabakası aspirasyon yoluyla uzaklaştırılarak insan embriyonik kök hücrelerinin tekil kolonileri geride bırakılır. Kök hücre belirteçleri için yapılan immünohistokimyasal boyama sonuçları, bu yöntemin besleyici hücreleri elemek ve koloni bütünlüğünü korumak için etkili bir izolasyon yöntemi olduğunu göstermektedir. Bu yöntem fikri ilk olarak laboratuvarımızda hücreleri ko-kültür yaparken, kök hücre kültürlerini aşırı konfluent kültür sistemlerinden kurtarmak istemem üzerine ortaya çıktı.Bu sistemle ilgili çoğu kişinin yaşayacağı temel sorun, insan kök hücre kültürü konusundaki deneyim eksikliğidir. Kök hücre kolonilerini ayırmak için sıralama (sorting) veya elle seçme gibi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu tekniğin deneyler için çok sayıda insan embriyonik kök hücresini izole etmemiz gerektiğinde özellikle yararlı olduğunu gördük. Bu yöntem, yüksek yoğunluklu kültürlerden kolonileri izole etmek için daha hızlı ve daha verimlidir.Mouse embriyonik fibroblastları, bölünmelerini önlemek için embriyonik kök hücrelerle birlikte kültüre edilmeden önce mitomisin C ile işlem görmeli veya ışınlanmalıdır. MEF ekiminden iki saat önce, her 60 milimetrelik plazma işleminden geçmiş kültür kabını iki mililitre %0,05'lik gelatin ile kaplayın; işlem görmüş MEF içeren bir şişeyi çözdürün, 1.500 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve ekim yapın. Gelatin kaplı kaba santimetrekareye yaklaşık 20.000 hücre düşecek şekilde bir kültür ekleyin ve hücrelerin yapışması için kültürü gece boyunca inkübe edin. Yeni kültürler, kriyoprezerve hücrelerden veya mevcut kültürlerin MEF kaplı kaplara pasajlanmasıyla başlatılabilir. Büyük insan embriyonik kök hücre kolonilerini içeren bir plaka ile başlarken, plakayı bir kez üç mililitre ısıtılmış fosfat tamponlu salin ile yıkayın.Üç mililitre, bir miligram/mililitre konsantrasyonunda kollajenaz 4 çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de beş ila 10 dakika inkübe edin. Hücreler, tripsinde gördüğünüz gibi belirginleşmeyecek veya topaklanmayacaktır. Beş mililitrelik bir pipet ucunun kenarını kullanarak koloniler üzerinde ızgara şeklinde bir desen oluşturun ve onları küçük hücre kümelerine ayırın.Şimdi pipet ucunun ucunu kültür plağına dik açı yapacak şekilde tutarak, kültür plağının tabanını sıyırın ve tüm hücreleri yüzeyden ayırın. Hücreleri hasat etmek için bir falcon tüpüne aktarın, beş dakika boyunca 1000 RPM hızında santrifüjleyin ve medyumu aspire ederek uzaklaştırın. Ardından, bir gün önce ekilmiş olan fare embriyonik fibroblastlarındaki medyumu aspire edin.Ardından, insan embriyonik kök hücrelerini orijinal plakadan bire üç oranında ekleyin ve üç mililitre insan embriyonik kök hücreli besiyeri ile besleyin. İnsan HECS'ler, 10 ila 14 gün boyunca yüksek yoğunlukta kültüre edilir. Aspirasyon pipetinin ucunu plağın kenarına yerleştirin ve vakum kullanarak met şeridinin kenarını nazikçe yukarı çekin.Besiyerini kapta kaldırın. Ucun hücre tabakasını yakalamasına izin verin ve ardından ucu plakanın üzerinde yay şeklinde yavaşça hareket ettirin. Eğer tabaka pipeti önemli ölçüde tıkarsa, tabakayı kültürden çıkarın.Hücrelerin parçalanmasını tamamlamak için kültür kabının üst kısmına bir aspiratörle hafifçe vurun ve hücreleri tam bir aspirasyonla uzaklaştırın. İnsan embriyonik kök hücre besiyerini hemen yenileyin ve kültür kaplarına ekim yaptıktan sonra kültürü hücre kültürü inkübatörüne geri yerleştirin. Bu ko-kültür sistemi, fare embriyonik fibroblastları ile çevrili yüksek yoğunluklu insan embriyonik kök hücre kolonileri ile sonuçlanır.Aspirasyon tekniği, MES'i uzaklaştırır ve küçük, bozulmamış insan embriyonik kök hücre kolonileri oluşturur. Bozulmamış koloniyi çevreleyen çok az miktarda mes ile, embriyonik kök hücre kolonileri oldukça büyük kolonilere dönüşecek şekilde önemli ölçüde genişleyebilir. Örneğin, met boşaltımının hemen ardından gösterilen bu insan embriyonik kök hücre kolonisi, metten 10 gün sonrasına kadar kolonilerin immünofloresan tanımlamasıyla çok büyük bir koloniye genişlemiştir.Sömürülme işlemi, kolonilerin pluripotens işaretçilerinin ekspresyonunu koruduğunu ve mezodermal kadere doğru bir diferansiyasyon sergilemediğini göstermektedir. Bu transmisyon ışığı görüntüleri, immünofloresan olarak boyanmış kolonilerin farklı büyütmelerdeki morfolojilerini göstermektedir. DAPI, hücrelerin çekirdeklerini boyar.Önemli bir nokta olarak, insan embriyonik kök hücreleri insan kök hücre belirteçleri olan SSEA-4, TRA-1-60 ve TRA-1-81'i eksprese eder. Görüntülerin, tipik düz kenarları olan bir koloniyi tasvir ettiğine dikkat edin. Mezoderm farklılaşmasının erken bir belirteci olan FLK-1'i eksprese etmezler ve DDR2 boyamasının yokluğundan anlaşılacağı üzere herhangi bir fibroblast içermezler.Bu videoyu izledikten sonra, doğal ortamları manipüle etmek için kullanılan kültürleme teknikleri yardımıyla insan kök hücre kolonilerinin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Bu yöntem üzerinde uzmanlaştıktan sonra, işlem saniyeler içinde tamamlanabilir. Ayrıca, medyumu ve kalıntı katmanlarını temizlerken kültürlerinizin kurumasına izin vermemeyi unutmayın.

rapid-fibroblast-removal-from-high-density-human-embryonic-stem-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makalede, izolasyon ve bakım, cilt ve akciğer dokusunda yaban kemirgenler birincil fibroblast kültürlerinin için bir protokol tanımlamaktadır.

Kemirgenler itibaren İlköğretim Yetişkin Fibroblast Kültürleri kurulması

Fibroblast davranışı, bir klinik antite spektrumunun temelini oluşturur, ancak büyük ölçüde doğal heterojenlikleri nedeniyle zayıf karakterize edilirler. Geleneksel fibroblast araştırmaları, in vivo fibroblast davranışını maskeleyen in vitro manipülasyona dayanır. Hücre kültürü gerektirmeyen fare derisi fibroblastlarının izolasyonu için FACS tabanlı bir protokol tanımladık.

FACS ile Murin Dermal fibroblast İzolasyonu

Bu kulak ve farelerin kuyrukları primer fibroblastlar üretilmesi için basit ve hızlı bir deney prosedürü tarif etmektedir. Prosedür özel hayvan eğitim gerektirmeyen ve 10 gün oda sıcaklığında saklanan kulaklardan fibroblast kültürlerin üretimi için de kullanılabilir.

Fare Kulak ve Kuyruk Dokular Yaratma İlköğretim Fibroblast Kültürleri

İnsan kaynaklı pluripotent stem (hiPS) hücrelerinin sağlam türetilmesi, entegre edilmeyen Sendai virüsü (SeV) vektörü aracılığıyla dermal fibroblastların yeniden programlanması kullanılarak gerçekleştirilmiştir. HiPS hücre bakımı ve klonal genişleme, rekombinant insan lamınin 521 (LN-521) matrisi ve Esansiyel E8 (E8) Ortamı ile kseno içermeyen ve kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak gerçekleştirildi.

Laminin 521 Matrisini Kullanarak İnsan Tarafından Oluşturulan Pluripotent Kök Hücrelerin Entegrasyon Serbest Türevi

Burada biz insan birincil fibroblastlar değiştirilmiş mRNA'ların programlama faktörler kodlama kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücre yeniden programlamak için klinik, yüksek verimli, besleyici-Alerjik bir yöntemi açıklamak ve olgun mikroRNA-367/302 taklit eder. Ayrıca programlama verimlilik, değerlendirmek için yöntem klonal IPSC kolonileri genişletin ve pluripotency işaretin TRA-1-60 ifade onaylamak bulunmaktadır.

RNA tabanlı insan birincil fibroblastlar indüklenmiş Pluripotent kök hücre yeniden programlama

Bu yazıda insan derisinden papiller ve retiküler fibroblastların yalıtımına yönelik FACS tabanlı bir protokol açıklanmaktadır. Eksplant kültürler aracılığıyla yaygın olarak kullanılan izolasyon protokolüyle kaçınılmaz olan in vitro kültürünü bozur. Yayılımlı fibroblast alt setleri işlevsel olarak farklıdır ve dermis içinde diferansiyel gen ifadesi ve lokalizasyonu görüntüler.

Floresan-aktif hücre sıralama ile ınsan derisinden papiller ve Reiküler fibroblastların izolasyonu

Bu protokol, 0-4 gün eski farelerin derisinden melanosit ve fibroblast kültürlerini eşzamanlı olarak oluşturmak için hızlı bir yöntem özetliyor. Bu primer kültürler, cilt hücresi biyolojisi, pigmentasyon, yara iyileşmesi ve melanom dahil olmak üzere fizyolojik olarak ilgili süreçlerin çeşitli çalışma için muhafaza ve manipüle edilebilir.

Primer Murine melanosit ve fibroblast kültürlerinin hızlı üretimi

Birincil erişkin fibroblastları, yeni başlayanlar tarafından (örn. öğrenciler) kolay, hızlı ve güvenilir bir şekilde ayırmak için bir protokol sunuyoruz. Prosedür primer fibroblastlar elde etmek için enzimatik doku sindirim ve ultrasonik dalgalar ile mekanik ajitasyon birleştirir. Protokol, belirli deneysel gereksinimlere (örn. insan dokusu) kolayca adapte edilebilir.

Ultrasonik-Augmented primer yetişkin fibroblast yalıtım

Hücre yeniden programlama, pluripotent hücre durumunu düzenleyen ve koruyan anahtar genlerin tanıtılmasını gerektirir. Açıklanan protokol, insan dermal fibroblastlarından viral/entegre yöntemler olmadan ancak modifiye edilmeyen RNA'lar (NM-RNA) kullanarak hücresel savunma mekanizmalarını azaltan immün kaçırma faktörleri ile birlikte indüklenen pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) kolonilerinin oluşmasını sağlar.

Erişkin İnsan Dermal Fibroblastlarının Abdominal Deriden İzolasyon ve İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerin Indüklenen Alacalı Kök Hücrelerin Indükleyici Olmayan Yöntemle Üretilmesi

Burada, gen transfeksiyonuna veya retroviral vektörlere ihtiyaç duymadan, memeli pluripotent hücrelerini verimli bir şekilde üretmek için kimyasal epigenetik silme kullanımını mekanosensing ile ilgili ipuçlarıyla birleştiren bir yöntem sunuyoruz. Bu nedenle, bu strateji translasyonel tıp için umut vericidir ve kök hücre organoid teknolojisinde kayda değer bir ilerlemeyi temsil etmektedir.

Memeli Pluripotent Hücreleri Üretmek için Epigenetik Modifikasyonu ve Biyomekanik İpuçlarını Birleştiren İki Adımlı Bir Strateji

Burada sunulan, mekanistik çalışmalar, hastalık modelleme ve tarama uygulamaları için uygun, çift kutuplu çok kuyulu bir plakada 48 dokudan oluşan paralel bir kültür için tasarlanmış bağ dokuları üretmek için bir protokoldür. Protokol, farklı organ ve türlerden fibroblastlarla uyumludur ve burada insan primer kardiyak fibroblastlarla örneklenmiştir.

Fibroblast Türetilmiş İnsan Tarafından Tasarlanmış Bağ Dokusu Tarama Uygulamaları için

Öğrenin, fare embriyonik fibroblast katmanını aspire ederek insan embriyonik kök hücre kolonilerini hızla izole etme yöntemini. Bu teknik, koloni bütünlüğünü ve çok yönlülüğü koruyarak büyük ölçekli hasat sağlar.

Yüksek Yoğunluklu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürleri gelen Rapid Fibroblast Kaldırma

Daha fazla video keşfet