Sıçan mezenter eksteriorizasyon: Anjiogenez ilgilendim Hücresel Dinamikler araştırılması için Bir Model

Bu deneyin amacı, mevcut damarlardan yeni kan damarlarının oluşması şeklinde tanımlanan anjiyogenezde yer alan mekansal ve zamansal hücresel dinamikleri belirlemektir. Basit ve tekrarlanabilir bir model kullanarak, önce sıçan mezenterini kısa süreliğine dışarı çıkararak anjiyogenezi stimüle edin ve stimülasyon sonrası farklı zaman noktalarında mezenter dokularını toplayın. Ardından, doku kesitlerini immün boyama ile işaretleyin.

Örneğin, bir doku içerisindeki tüm yeniden şekillenen damar yapısını görselleştirmek ve büyüyen mikrovasküler ağların temel bir iki boyutlu görselleştirmesini oluşturmak için bir endotelyal hücre belirteci kullanın. Bu model, birlikte değerlendirildiğinde nispeten kısa bir zaman seyri boyunca birden fazla anjiyojenik metriği çarpıcı şekilde artırdığı için caziptir. Ağların tek hücre düzeyinde görselleştirilmesi ve bu metriklerin çok hücreli etiketleme ile korelasyonu, kapiller tomurcuklanmayı içeren yeni hücre fenotiplerinin tanımlanmasında son derece yararlı olduğunu kanıtlamıştır.

Bu yöntem, mikrovasküler ağ büyümesinde yer alan hücresel dinamiklere ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bunlar arasında, kılcal damar filizlenme sürecinde spesifik hücrelerin ne zaman ve nerede mevcut olduğu yer almaktadır. Bu yöntemin temel avantajları; basit olması, minimum cerrahi müdahale gerektirmesi ve nispeten kısa bir süre içinde güçlü bir anjiyojenik yanıt oluşturmasıdır.

Ek olarak bu yöntem, tek hücre düzeyine kadar bozulmamış bir ağın gözlemlenmesine olanak tanıyan bir doku olan rap mezenterinin avantajlarından yararlanır. Deneyimlerimize göre, prosedürün gösterilmesiyle birlikte öğrenilmesi oldukça kolaydır ve sonuç olarak bir araştırmacıdan diğerine tekrarlanabilirdir. Bugün, laboratuvarımızdaki lisansüstü öğrencisi Peter Stapler, ekteki metinde detaylandırıldığı şekilde cerrahi işlem için hazırlıkları yapacaktır.

Sıçanın karın bölgesi tıraşlandıktan sonra, vücut ısısını korumak amacıyla anestezi altındaki sıçanı bir ısıtma pedinin üzerine sırt üstü yerleştirin; karın bölgesini sırasıyla %70'lik izopropil alkol ve iyot emdirilmiş steril gazlı bezlerle temizleyin. Sternumun yaklaşık bir inç altına deri boyunca küçük bir boylamsal insizyon ve ardından linea alba boyunca bir kesi yapın. Önceden kesilmiş örtüyü, açıklığı insizyonla hizalanacak şekilde karın bölümünün üzerine yerleştirin. İnce bağırsağı açığa çıkarmak için insizyon çevresine hafifçe baskı uygulayın. Pamuklu aplikatörler yardımıyla ince bağırsağın bir bölümünü nazikçe dışarı çekerek mezenterini steril salin içeren plastik platformun üzerine yerleştirin ve ileumu bulun.

İnce bağırsağı besleyen arter-ven çiftleri arasındaki ince, yarı saydam membran olan altı ila sekiz adet vaskülarize mezenterik pencereyi belirleyin. Dışlama başlangıç zamanını kaydedin ve 20 dakikalık bir zamanlayıcı ayarlayın. Bağırsak yakınındaki yağlı bölgeye, merkezi konumdaki iki mezenterik pencereyi steril yedi sıfır sütürle işaretleyin.

Dokunun daldırılmış ve nemli kalmasını sağlamak için, steril beş mililitrelik bir şırınga kullanarak Petri kabındaki salini aralıklarla tamamlayın. Eksternalizasyon süresi dolduktan sonra, mezenteriyumu karın boşluğuna geri yerleştirin. Karın kasını beş sıfır monofilaman sütür ile kesikli dikiş şeklinde kapatın.

Ardından cildi, kesintili dikiş yöntemiyle 4-0 monofilaman sütür kullanarak kapatın; dikiş bölgesini %70'lik izopropil alkol ve iyodin emdirilmiş steril gazlı bezle sırasıyla silerek temizleyin, sıçanın her iki gözüne kayganlaştırıcı jel sürün ve iyileşmesi için kafesine geri yerleştirin. İlgilenilen günde, stimülasyon sonrası sıçanı kurumsal kılavuzlara uygun olarak anestezi altına alın ve ötanize edin. Daha sonra abdominal kaviteyi yeniden açın ve karın bölgesini bir parça streç filmle örtün. Şimdi ince bağırsağı nazikçe dışarı çekin ve forseps ile mikro makas kullanarak işaretlenmiş iki pencereyi bulun.

Yağ sınırını da içerecek şekilde dışa çıkarılmış mezenterik pencerelerin her birini kesin. Pencerelerin potansiyel olarak kanla dolmasını önlemek için yağ sınırı içindeki arter-ven çiftlerini kesmemeye dikkat edin. Ayrıca, bağırsak içeriğinin sızmasına neden olabilecek bağırsak kesimlerini en aza indirin.

Pencerelerle temas kurulduktan hemen sonra her bir pencere PBS içine daldırılır. Ardından, dokuları pozitif yüklü mikroskop lamlarına yaymak için pens kullanın. Her lama iki doku yerleştirin. Dokular kısmen kuruduktan sonra, fazla yağı bir bistüri ucuyla temizleyin.

Numuneleri dondurucuya yerleştirerek -20 °C'de 30 dakika boyunca metanol ile sabitleyin. Fazla tampon çözeltiyi uzaklaştırmak için lamları vakumda kurutun. Ayrıca, antikor çözeltilerinin dokudan kontrolsüz bir şekilde akmasını önlemek için dokuların etrafını mum kalemle çevreleyin.

Şimdi, tüm dokuyu kaplayacak şekilde yaklaşık 200 µL seyreltilmiş primer antikor çözeltisi damlatın. Oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin, dokuları PBS artı %0,1 sapin ile üç kez tampon değiştirerek yıkayın. Ardından, strep adin peroksidaz sekonder antikor çözeltisini ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin; üç yıkamanın ardından örnekleri vector nova red içinde 15 dakika inkübe edin.

Lamları monte etmek için suyla durulayın. 10 kez %95 etanol içinde daldırın ve ardından ardışık dejidrasyon adımlarını uygulayın. Lamların kurumasını bekleyin, dokuları ince bir tabaka halinde kapatın ve vakumlu kurutma ile markalamadan sonra lam kapatıcıları yerleştirin.

Slaytlar. Doku örneklerini seyreltilmiş primer antikor çözeltisi ile kaplayın. Oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Her biri 10 dakika sürecek şekilde, %0,1 saponin içeren PBS ile üç kez yıkayın. Ardından sekonder antikoru ekleyin ve bir saat boyunca inkübe edin. %0,1 saponin içeren PBS ile yıkama işlemlerini gerçekleştirin, lamları gliserollü PBS ile kapatın ve oje ile mühürleyin.

Burada, yaygın bir Petri kabının cerrahi platform olarak kullanılması için modifikasyonunu detaylandırıyoruz. Mezenterin önceden kesilmiş delikten çekilebilmesi için pürüzsüz bir yüzey sağlamak amacıyla sarı modelleme kili kullanılmıştır. Eksternalizasyon süresi boyunca platformda gösterilen mezenterik pencereler, burada bağırsağı besleyen arter ve ven çiftleri arasındaki ince şeffaf membranlar olarak tanımlanmaktadır.

PCAM etiketlemesi, eksternalizasyon sonrası belirli zaman noktalarında, yeniden şekillenen mikrovasküler ağların hiyerarşisi boyunca tüm damar tiplerini tanımlar. Bu görüntüler, stimülasyon sonrası belirli zaman noktalarındaki anjiyojenik metrikleri nicelendirmek için kullanılabilir.

PCAM işaretlemesi, arterlerin venlere karşı belirlenmesini sağlar. Besleyici arterlerin, eşleşmiş venlere kıyasla genellikle daha küçük çaplar ve uzamış endotel hücre morfolojisi sergilediğini unutmayın. Yeniden şekillenen ağların tipik özellikleri arasında vaskülarize alan, kapiller filizlenme ve damar yoğunluğu yer alır.

Bu çeşitli anjiyojenik metriklerin kantifikasyonu, ağ büyümesinin zaman seyrini karakterize eder. Mevcut damarlardan yeni kılcal damar oluşumu üçüncü ve beşinci günler arasında zirveye ulaşır ve 10. güne kadar uyarılmamış seviyeye döner. Laboratuvarımızda, filizlenmedeki bu geçici artışı, vaskülarize alan ve vasküler yoğunluktaki artışlar takip etmektedir.

Bu model sistem, bu yeniden yapılanma sürecindeki belirli zaman noktalarında yeni hücresel fenotipik değişikliklerin belirlenmesi için kullanılmıştır. İmmünofloresan PCA etiketlemesi endotel hücrelerini kırmızıya boyarken, sınıf üç beta tübülin etiketlemesi sinirleri ve anjiyojenik damarlar boyunca uzanan parazitleri yeşile boyar. İlginç bir şekilde, uyarılmamış dokularda sınıf üç beta tübülin ekspresyonu sinire özgüdür.

Buna karşılık, kapiler filizlenmenin zirve noktasında, perivasküler hücreler tarafından sınıf üç beta tübülinle ifade edilir. Bu tür bir sonuç, anjiyogenik süreçte yer alan yeni hücre tiplerini belirlemek için bu basit ve sağlam anjiyogenik modelin kullanımını vurgulamaktadır. 10. güne gelindiğinde, sınıf üç beta tübülin ekspresyon paterni uyarılmamış senaryoya dönmeye başlar.

Bu model, hücre soyu çalışmaları için de potansiyel olarak kullanılabilir. Önceden işaretlenmiş kemik iliği hücrelerinin veya mezenkimal kök hücrelerin, 20 dakikalık dışlama süresi boyunca mezenterik pencerelerin üzerine süperfüze edildiği bu ön çalışmalar, hücrelerin yeniden şekillenen mezenterik dokuya dahil edilmesinin fizibilitesini desteklemektedir. Bu videoyu izledikten sonra, mikrovasküler ağ büyümesinde yer alan hücresel dinamikleri incelemek için sıçan mezenter internalizasyon modelimizi nasıl kullanacağınız konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu basit teknik yaklaşık 45 dakika ile bir saat arasında gerçekleştirilebilir. Unutmayın, cerrahi bir işlemden sonra mezenteriyi hassas bir şekilde tutmak ve damarları delikten kaçınmak kritik önem taşır. Kan damarları boyunca birden fazla hücre tipini tanımlamak için immün markalama uygulanabilir.

Ayrıca lenfatik damarlar ve sinirler için de işaretleme yapabilirsiniz. Bu, sadece anjiyogenezde yer alan hücresel fenotipik değişiklikleri değil, aynı zamanda anjiyogenez, nörojenez ve lenf anjiyogenezi arasındaki koordinasyonu araştırmamıza olanak tanır.