Büyüme Eğrisi ve Plate Count tarafından Kuantum Noktaları ve Bakteriyel Toksisite Tahliller kararlı hale getirilmesi ve Bio-konjugasyon

Bu prosedürün genel amacı, antibiyotiklerle konjuge edilmiş veya edilmemiş nanopartiküllerin antibakteriyel etkilerinin yüksek kapasiteli taramasını gerçekleştirmektir. Burada, bunu başarmak için poly mix ve B ile konjuge edilmiş kadmiyum tellürür kuantum noktalarının antibakteriyel etkileri test edilmektedir. Kuantum noktaları öncelikle me, kapto propiyonik asitte çözünür hale getirilir.

Ardından, kuantum noktaları poly mix ve B ile konjuge edilir ve antibiyotik plakalı bakteriler hem antibiyotik konjugeli hem de konjugele olmayan kuantum noktaları ile işleme tabi tutulur; örneklerin yarısı, kuantum noktalarının eksiton ve reaktif oksijen türleri üretmesini sağlayarak kuantum noktası tedavilerinin bakteriyel büyüme ve sağkalım üzerindeki etkisini değerlendirmek amacıyla 30 dakika boyunca 440 nanometre mavi ışık radyasyonuna maruz bırakılır. Optik yoğunluk okumaları yapılır ve koloni sayımları gerçekleştirilir. Elde edilen veriler, antibiyotik konjugeli kadmiyum tellürür kuantum noktalarının uygulanmasının, ardından gelen I radyasyonu ile birlikte, test edilen koşullar arasında en yüksek öldürme etkilerini sağladığını göstermektedir.

Bu yöntem, kadmiyum tellürid kuantum noktalarının ve bunların polyx in B ile konjugasyonunun E coli büyümesi üzerindeki etkisine dair içgörü sağlayabilse de, diğer nanopartikül türlerine ve çeşitli bakteri suşları üzerindeki antibiyotiklere de uygulanabilir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşayacaktır çünkü MPA'nın herhangi bir fazlası kuantum noktalarının agregasyonuna neden olur ve eğer çok az miktarda bile dışarı sızarsa, filtreyi tahrip ederler.

Bugün antibiyotik konjuge KE IDE kuantum noktalarının antibakteriyel etkilerini değerlendirmek için bir yöntem gösterecek olsak da, benzer bir yöntem indiyum fosfat, çinko sülfat ve kadmiyum iyodür çinko sülfat gibi diğer kuantum noktası türleri için de kullanılabilir. Bu prosedüre, cam bir şişede 15 µM konsantrasyonunda toluen içinde kadmiyum tellürür veya CDTE kuantum noktaları çözeltisi hazırlayarak başlayın; absorbans spektroskopisi ile optik yoğunluğu veya OD'yi ölçün ve bir pipet kullanarak bu stok çözeltiden 200 µL'yi cam bir şişeye aktarın.

Plastik kullanmayın. Ardından 800 µL toluen, 1 mL 200 mM borat tamponu ve 2 µL 11,5 M 2-merkapto-propiyonik asit veya MPA ekleyin, flakonun kapağını kapatın ve 30 ila 60 saniye boyunca kuvvetlice çalkalayın. Çalkalama işleminden sonra, sulu faz ve organik çözücü fazı kendiliğinden ayrılacaktır.

Sulu faz, kuantum noktalarının rengini alacaktır. Arayüz tabakasını önlemek için bu tabakayı uzaklaştırın, ardından kuantum noktası fazını alarak temiz bir viale aktarın. Çözünür hale getirilmiş kuantum noktalarını saflaştırmak için onları 500 µL'lik bir santrifüj filtresine aktarın.

100 µL 50 mM bore sekiz tamponu ekleyin ve 13 dakika boyunca 3000 ×g hızında santrifüjleyin. Bu yıkama işlemini dört kez tekrarlayın; son yıkamadan sonra, yıkanmış kuantum noktalarını 500 µL bore tamponu içerisinde süspanse edin ve 4 °C'de saklayın.

Bunlar bir ila iki hafta boyunca stabil kalacaklardır. Kuantum noktalarının konsantrasyonunu tahmin etmek için absorbans ve emisyon spektrumlarını ölçün. Bu şekil, UV lamba aydınlatması altındaki CDTE kuantum noktalarını ve suyla çözünürleştirme öncesi ile sonrası emisyon spektrumlarını göstererek, ligand değişiminden kaynaklanan optik özelliklerdeki değişimin ihmal edilebilir düzeyde olduğunu ortaya koymaktadır.

Protokolün bu kısmı; yosun, ticari kuantum noktaları, metal partiküller ve daha fazlası dahil olmak üzere, negatif yüklü tüm su solarize nanopartiküller için uygulanabilir. Bu örnekte, antibiyotik polimiksin B veya PMB, 30'a bir molar oranda kuantum noktalarına konjuge edilecektir. PMB pozitif yüklüdür ve konjugasyon ihtiyacı olmadan kendiliğinden birleşir. Reaktifler: PMB ve su çözeltisi.

60 µM konsantrasyonda. Her kuyucukta 0,3 mL bakteri bulunan, dörtlü tekrarlar içeren 96 kuyucuklu bir plaka için. Bir mikrosantrifüj tüpüne 50 mM bor tamponu içinde 100 µL 1 µM kuantum nokta ekleyerek, 0,5 mL 200 nM konjugat hazırlamak yeterlidir.

Ardından, konjugat tüpüne 50 µL miktarında 10 x veya 60 µM'lık sulu PMB antibiyotik çözeltisi ekleyin. Kontrol tüpüne 50 µL su ekleyin. Hacmi 50 mM ATE tamponu ile 0,5 mL'ye tamamlayın; tüpleri alüminyum folyo ile ışıktan koruyun ve bir saat boyunca rotatöre yerleştirin.

Agregasyon meydana gelirse, konjugasyonu daha düşük antibiyotik konsantrasyonları ile tekrarlayın. Partiküller agrege olana kadar konsantrasyonu yukarı doğru titre ederek konjugatları yıkayın. Çözeltileri, çoğu antibiyotik için uygun olan ancak proteinler veya antikorlar için uygun olmayan 10.000 moleküler ağırlık kesim limitli bir filtreden geçirin.

Son olarak, absorbans veya floresan spektroskopi, jel elektroforezi veya Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopi ile kuantum başına düşen antibiyotik molekül sayısını tahmin edin. Bu şekil, PMB konjugasyonundan önceki kuantum noktalarının tipik absorbans ve emisyon spektrumlarını ve 160 molar eşdeğer PMB eklemesinden sonraki emisyonu göstermektedir.

Karelerle belirtilen PMB oranı ile kuantum nokta emisyon şiddeti ve üçgenlerle belirtilen pik dalga boyu konumu arasındaki ilişki burada gösterilmiştir. PMB konsantrasyonu arttıkça, QD emisyon şiddeti azalmakta ve bu da pik emisyon dalga boyunda bir kaymaya neden olmaktadır. Protokolün bir sonraki bölümü, konjugasyon deneyinden iki gün önceki akşam, antibiyotiğin yarı maksimum inhibisyon konsantrasyonunu veya IC 50 değerini ve kuantum toksisitesini belirlemek için gerçekleştirilir.

Taze bir e coli kolonisi kullanarak 10 mililitre LB besiyerini eklemiş bir kültür hazırlayın. Ertesi gün, deneyden bir ila iki saat önce şeffaf bir 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğunu doldurun. Büyüme besiyeri ile analiz plakası burada gösterildiği gibi düzenlenmelidir.

Numuneler üç paralel şeklinde plaklara ekilmeli ve antibiyotik konsantrasyonları, bakterileri çok az inhibe eden bir konsantrasyon ile hepsini öldüren bir konsantrasyonu kapsayacak kadar geniş bir aralıkta olmalıdır. Konjugat deneylerinde kullanılacak konsantrasyonlardaki kuantum noktaları içeren tüm kuyucuklar da üç paralel şeklinde dahil edilmelidir. Çok kanallı bir pipet kullanarak, uygun kuyucuklara 1 ila 50 µL bakteri kültürü ekleyin.

Konsantrasyon, ilgili suşun büyüme hızına bağlı olacaktır ve buna göre kalibre edilmesi gerekecektir. Büyümeyi izlemek için plakayı bir plaka okuyucuya yerleştirin ve cihazı iki saat boyunca her 10 dakikada bir 600 nanometrede okuma yapacak şekilde ayarlayın. Hücrelerin tamamı 0,1 ile 0,15 arasında bir OD değerine ulaştığında, plakayı plaka okuyucudan çıkarın ve kaydı durdurun.

Ardından, kuantum noktaları içeren PMB'yi uygun kuyucuklara ekleyin ve plakanın yarısını üç tekrarlı olarak alüminyum folyo ile kapatın. Daha sonra, plakanın aydınlatılacak tarafını maruz bırakmak için plakayı, 2,4 milliwatt LED'lerden yapılmış özel bir 440 nanometre lambanın altına 30 dakika boyunca yerleştirin. Işık maruziyetinden sonra plakayı plaka okuyucuya yerleştirin ve büyüme hızına bağlı olarak beş ila 12 saat boyunca her 10 dakikada bir OD 600 değerini kaydedin. Kültürlerin kurumasını önlemek için yazılım kullanarak sıcaklığı mümkünse 32 degrees Celsius'un altında tutun.

Büyüme eğrilerini seçilen bir zaman noktasında log konsantrasyona karşı grafiğe dökün ve ekranda gösterilen, H'nin hill katsayısı olduğu hill denklemini kullanarak antibiyotiğin IC 50 değerini belirleyin. Y max büyümenin en yüksek noktasıdır ve Y min, ideal olarak yine bir platoda yer alan sıfır noktasıdır. Kayıt süresinin sonunda, boş kuyucuklar hücrelerin tamamen öldüğünü gösterecek ve artan ilaç konsantrasyonları boyunca bir hücre yoğunluğu gradyanı ortaya çıkacaktır.

Bakteriler, burada gösterildiği gibi S şeklinde büyüme eğrileri sergilemelidir. Maksimum platonun konumu suştan suşa büyük farklılıklar gösterir ve aynı zamanda sıcaklığa bağlıdır. Temsilci olarak belirli bir zaman noktası seçilebilir ve kuantum noktalarını değerlendirmek için IC 50 değerini vermek amacıyla değerler antibiyotiğin logaritmasına karşı grafiğe dökülebilir.

Toksisite sağkalımı, kuantum noktaları konsantrasyonunun logaritmasına karşı da çizilebilir; ancak kullanılan konsantrasyonda sadece kuantum noktaları ile anlamlı bir bakteriyel öldürme elde etmek nadirdir. Kuantum noktalarının ve antibiyotiklerin tek başlarına sahip olduğu toksisite belirlendikten sonra, antibiyotiğin toksisitesini belirlemek için aynı protokol uygulanabilir. Konjuge kuantum noktaları gösterilmiştir.

Analiz için örnek bir yerleşim burada verilmiştir. Konjugatların artan konsantrasyonlarda dörtlü tekrarlar halinde test edildiğine dikkat edin; yalnızca bakteri içeren bir kontrol şeridi, yalnızca ilaç içeren bir şerit ve yalnızca kuantum noktaları için örnek kuyucukları eklenmelidir. Ardından, büyüme eğrileri oluşturmak için OD 600 okumaları ve daha önce olduğu gibi IC50 değerleri kullanılabilir.

Bu şekil, tek başına antibiyotik kadar toksik olan konjugatlara bir örnek ile daha toksik olan konjugatlara bir örneği göstermektedir. Her bir koşul için koloni oluşturan birim veya CFU sayısını belirlemek amacıyla, plak sayımı yapmak için işlem görmüş 96 kuyucuklu plaktan bir veya daha fazla kuyucuk seçin. Seçilen bakteriyel örneklerin her birinin salin solüsyonu ile seri dilüsyonunu yapın.

Bunu yapmak için uygun kolonlara 180 µL tuzlu solüsyon pipetleyin. Bakteriyel solüsyondan 20 µL aktarın ve 180 µL tuzlu solüsyon ile seyreltin. Pipet ucunu değiştirin, karıştırın ve seyreltilmiş bakteriyel solüsyondan 20 µL'yi 180 µL tuzlu solüsyona aktarın.

Bu işlemi altı kez tekrarlayın. Ardından, son altı dilüsyonun her birinden 10 µL alarak dikdörtgen bir auger plakasına damlatın. Dikdörtgen bir plakaya 36 spot damlatılabilir.

Plakanın tezgah üzerinde 15 dakika boyunca kurumasına izin verin; 15 dakika sonra, plakayı 37 °C'de 16 saat boyunca inkübe edin. Mililitre başına koloni oluşturan birim sayısını belirlemek için kolonileri sayın. İşlemlerin bakteriyel büyüme üzerindeki etkisini belirlemek için koloni sayısını dilüsyon faktörü ile çarpın ve ekilen hacme bölün.

E. coli hücre yoğunluğu OD 600'de ölçülmüştür. Burada, sıfırdan hücrelerin tamamen ölmesine kadar farklı ilaç konsantrasyonlarını içeren temsili bakteriyel büyüme eğrileri gösterilmiştir. Açık semboller, konsantrasyonları belirtilmiş olan yalnızca PMB grubunu temsil etmektedir.

Dolu semboller ışınlama uygulanmamış C-D-T-E-P-M-B'yi, yarı dolu semboller ise ışınlama uygulanmış C-D-T-E-P-M-B'yi temsil etmektedir. Işınlamanın sadece PMB içeren örnekler üzerinde hiçbir etkisi olmamıştır, bu nedenle netlik adına bu eğriler gösterilmemiştir. Işığın etkilerini kontrol etmek amacıyla, 200. dakikadaki büyüme eğrisi değerlerinin log PMB'ye karşı grafikleri ve IC 50 değerlerini belirlemek için bu denkleme yapılan uyumlar burada verilmiştir.

Sadece antibiyotik kullanılarak ve 30 dakikalık ışık maruziyeti ile bir eğri oluşturulmuştur. Bu şekil, CDTE qd'ler kullanılarak 200. dakikadaki bakteriyel sağkalımı QD konsantrasyonuna karşı göstermektedir. Işık maruziyeti ile bir miktar toksisite görülmektedir, ancak bu miktar bir IC 50 değeri belirlemek için çok düşüktür.

Bu durum, konjugasyon deneyinde kullanılan konsantrasyonlarda tek başına CDTE'nin toksisitesinin, farklı tedavilerin hücre büyümesi üzerindeki etkilerini karşılaştırmak için ihmal edilebilir olduğunu göstermektedir; 200. dakikadaki büyüme eğrisi değerleri grafiğe dökülmüş ve burada gösterildiği gibi daha önce belirtilen denkleme uydurulmuştur. C-D-T-E-P-M-B konjugatları, tek başına PMB'den daha toksikti. Karşılaştırmalı olarak, altın nanoparçacık A-U-P-M-B konjugatları, tek başına PMB'ye kıyasla artmış bir toksisite göstermemiştir; bu işlem, tedavilerin bakteriyel sağkalım üzerindeki etkisini belirlemek için yapılmıştır.

P-M-B-Q-D-P-M-B veya tek başına QD ile 30 dakika boyunca I radyasyonu uygulanan veya uygulanmayan, 96 kuyucuklu plakaya yerleştirilmiş e coli için koloni oluşturan birim sayısı belirlenmiş ve ardından 32 °C'de dört saat boyunca inkübe edilmiştir. Her bir bakteri örneğinin serum fizyolojik ile seri dilüsyonları yapılmış ve 100 x ile 10⁷ X çözeltilerinden 10 µL'lik miktarlar agar plaklara ekilmiştir. Plaklar 37 °C'de inkübe edilmiş ve 16 saat sonra koloniler sayılmıştır.

Bu örnekte, plaka sütunları A ile C arası, artan konsantrasyonlarda CDTE ile işlem görmüş bakterileri içermektedir. Işınlama uygulanmamış konjugatlar ve D ile F arası ise artan konsantrasyonlarda konjugatlarla işlem görmüş bakterilerdir. Satırlar boyunca, 30 dakikalık ışınlama ile birlikte dilüsyonlar gösterilmektedir.

Veriler, ışınlama sonrası konjugatların, ışınlanmamış konjugatlara kıyasla bakteriyel büyüme üzerinde daha yüksek inhibisyona sahip olduğunu göstermektedir. Ca reaktiflerinin son derece toksik olduğunu ve bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük takmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, nanopartiküllerin antibiyotiklerle konjugasyonu olan veya olmayan antibakteriyel etkilerinin yüksek çıktılı taramasının nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.